CC BY
8ВОПРОСЫ БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ ИЗГОТОВЛЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ИМПЛАНТАНТОВ, СВЯЗАННЫЕ с ВИРУСНЫМИ ГЕПАТИТАМИ В и С. Современные методики проведения пластических операций в различных областях медицины отводят ведущую роль биологическим имплантатам, преимущественно аллогенного происхождения. Для их изготовления производится посмертный забор тканей доноров, в которые входят костно-хрящевые органы, сухожилия, связки, сердечные клапаны, твердая мозговая оболочка и т.д. Отбор донорского материала в мировой практике регулируется жесткими стандартами и контролируется серологическими анализами. Вместе с тем биоимплантология США и Западной Европы насчитывает большое количество случаев инфицирования реципиентов заболеваниями, в основном вирусной этиологии, через имплантируемый материал (W.W.Tom-ford 1990,1995, A.G.Sutherland et al., 1997, MJ.Joyce 1999). В нашей стране подобные статистические исследования не проводились, но можно предположить, что несовершенство должного контроля в процессе изготовления имплантатов, особенно на периферии, делает цифру потенциально инфицированных реципиентов недопустимо большой. Поэтому вопросы безопасности в процессе работы с аллотканями и при клиническом использовании биологических имплантатов вышли на ведущее место в этой отрасли медицины. Решение их лежит в плоскости разрешения проблем в правовых, морально-этических, экономических и прочих аспектах работы медицинских учреждений, где разрешен забор тканей.
За 1998-2000 гг. в тканевом банке ЦИТО было отбраковано 84,6% донорского материала. Из этого количества на долю диагностируемых вирусных гепатитов В и С пришлось 35,4%, примерно столько же было исключено из работы на этапе осмотра поступивших доноров. Порядок и процедура отбора доноров происходят в соответствии с требованиями Европейской Ассоциации Тканевых Банков. Поэтому наличие на теле следов от внутривенных инъекций, характерных для наркомании, или очевидных признаков асоциального образа жизни является абсолютным противопоказанием к забору тканей. Вместе с тем, на фоне ограниченного количества материала, были проведены серологические исследования крови от молодых людей (20-25 лет), умерших от передозировки наркотиков. Полученные данные свидетельствовали о практически 100%-ном прижизненном носительстве гепатита В, который сочетался примерно в четверти случаев с гепатитом С. Данные исследования носили внутренний характер и преследовали цель изучить степень риска при работе с таким контингентом доноров. К сожалению, число молодых людей, погибших от употребления наркотиков, по нашим наблюдениям, становится все больше и вместе с тем, как это не кощунственно звучит, ткани от них абсолютно непригодны для трансплантации органов и тканей.
На фоне нарастания числа инфицированных доноров нами была сделана попытка внедрения в работу тканевого банка ранних методов диагностики инфекционных заболеваний. На этапе отбора донора были использованы экспресс тест-системы, в частности, на вирусный гепатит В -«Hexagon HBsAg». В итоге мы получили менее 50% достоверных результатов, сравнивая их с результатами клинической лаборатории переливания крови ЦИТО. Диагнозы в последней ставились после исследований плазмы крови на аппарате B4312L (Bio-Kinetics Reader) с использованием тест-систем (Rekombi-BEST anti-VGS-Strip и VectogenB - HBs - antigen - strip).
Проблема ранней диагностики вирусных инфекций, особенно гепатитов В и С, остается открытой и становится одной из самых актуальных в работе тканевых банков не только в России, но и в странах, где производится забор и переработка биологических тканей аллогенного происхождения. Внедрение в практику тканевых банков высокочувствительных экспресс-тестов на ранних этапах забора тканей должно существенно снизить риск инфицирования медицинского персонала и позволит избежать напрасных материальных затрат при производстве пластического материала. При этом необходимо учесть то, что исследуемая плазма крови будет получена от умерших людей. Достаточно широко применяемые диагностические методики ориентированы, прежде всего, на диагностику вирусных инфекций у живого человека. Возможно, существуют нюансы, которые затрудняют использование тестов, рассчитанных на прижизненные состояния, в случаях работы с трупной кровью. В связи с этим целесообразно провести исследования экспресс тест-систем фирм-производителей с целью определения наиболее чувствительных диагностических тестов, учитывая специфику нашей работы. Выбор последних, в рамках Российской Ассоциации Тканевых Банков
(РАТБ), будет рекомендован всем тканевым банкам РФ для практического применения. Все эти вопросы непосредственно относятся к, так называемому, «входному контролю».
Что касается «выходного контроля», то существенно снизить риск инфицирования через биологические имплантаты удается в случаях их стерилизации на конечных технологических этапах изготовления материала. Существующие и наиболее часто встречающиеся методы стерилизации включают в себя стерилизацию закисью этилена, химическими растворами (в частности -формалина) и ионизирующим излучением (В.Ф.Парфентьева с соавт., 1969, В.И.Савельев, 1996, M.Kakiuchi et al., 1996). К последнему способу относится воздействие на биологические объекты гамма-лучей и потока быстрых электронов. Главным и важным качеством данного метода является его управляемость в дозировании стерилизующих агентов. Это позволяет вести поиск оптимальных доз радиационного поглощения при воздействии на различные биологические ткани (кости, сухожилия, сердечные клапаны, сосуды и т.д.), учитывая их структурные особенности (E.Munting et al., 1988, AJ.Hamer et al., 1999). И в то же время проводить наши экспериментальные исследования с целью определения достаточных доз лучевого воздействия для инактивации антигенных структур гепатитов В и С в костной ткани.
Современные нормативы лучевой стерилизации биологических объектов в целом определены и равны для большинства стран 25 кГр. При этом в России, на сегодняшний день, эта доза равна 15 кГр (В.Н.Пономарев, Т.И.Носкова, 1993), в Польше - 33,5 - 35 кГр, в странах Скандинавии - до 45 кГр (A.Dziedzic-Goclawska, 1999, 2000). Однако по мере возрастания радиационных доз поглощения, биомеханические свойства материала снижаются, с 30 кГр ультраструктура им-плантатов начинает резко разрушаться (J.D.Currey et al., 1997, A.Dziedzic-Goclawska, 2000). Вместе с тем в худшую сторону изменяются и их пластические свойства: кондуктивные и индуктивные, Эти особенности лучевого воздействия являются крайне важным моментом в свете проведения нами экспериментальной работы по определению минимальной дозы, при которой создалась бы высокая степень безопасности материала в клинических условиях.
В наших исследованиях использовались образцы из компактных костных тканей доноров, инфицированных гепатитами В и С. Доноры выбирались произвольно и степень «загрязненности» материала не определялась. При их приготовлении воспроизводилась технология ЦИТО по изготовлению костных деминерализованных трансплантатов (ДКТ). Донорский материал был деминерализован 0,6 Н хлористоводородной кислотой и лиофилизирован после замораживания при температуре -35°С. В последующем ДКТ подверглись лучевому воздействию потока быстрых электронов в возрастающих дозах от 15 до 50 кГр, Сохранение HBV в образцах устанавливалось методом определения разрушения поверхностного антитела вируса гепатита В (HBsAg). Иммунофер-ментный тест по выявлению HBsAg ставился по инструкции по применению тест-системы Hepanostika HBsAg Uni-Form II фирмы "Organon". Полная инактивация HBsAg предполагалась тогда, когда отношение значений в опытной лунке по результатам замера составляло значение равное или ниже 2,1, чем по результатам отрицательного контроля. Выделение РНК HCV из исследуемых образцов проводилось стандартным методом с использованием смеси гуани-дин/тиоционат/фенол/хлороформ (P.Chomezynski et al., 1987). Детекция РНК HCV выполнялась с помощью "nested" - варианта RT-PCR с использованием праймеров на 5'-нетранслируемый регион (H.Okamoto et al., 1990). Продукты амплификации анализировались путем электрофореза в 2% агарозном геле и окрашивались бромидом этидия. Результаты иммуноферментного анализа регистрировались с помощью спектрофотометрии. Полученные результаты исследования свидетельствовали о том, что дозы поглощения в 50 и 36 кГр являются близкими к минимальным для инактивации антигенных структур гепатитов В и С соответственно.
Таким образом, при существующих общепринятых в мире нормативных величинах лучевой стерилизации до 35 кГр присутствует опасность переноса вирусных инфекций через ДКТ в случаях ошибки при диагностике вирусных гепатитов. Ультраструктурный анализ в наших исследованиях показал значительные разрушения костного вещества после воздействия потока быстрых электронов дозами (50 кГр), способными разрушить антигенные структуры гепатита В. Изменения структуры имплантатов после облучения 36 кГр были несколько меньше, хотя также достаточно большие, что соотносится с зарубежными исследованиями. Учитывая эти обстоятельства, в лаборатории «костный банк ЦИТО» проводится работа по созданию условий защиты тканей от высо-
ких доз лучевой стерилизации, способной обеспечить высокую степень безопасности при наличии вирусной инфекции. Задача, безусловно, сложная, но пример стран Скандинавии, где стерилизация биологического материала осуществляется дозами 45 кГр, говорит о том, что решение этой проблемы есть. Остаются открытыми вопросы качественной ранней диагностики вирусных гепатитов В и С у инфицированных доноров, эти вопросы необходимо решить в самые сжатые сроки.
В свете комплекса проблем, которые обусловлены резким ростом заболевания вирусными гепатитами В и С в России, необходим также комплексный подход к разработкам и клиническому использованию биологических имплантатов. Для реализации этой программы необходимо тесное сотрудничество специалистов различных отраслей медицины: трансплантологов, вирусологов, биофизиков и многих других.
М.В.Лекишвили, ГУНЦИТО им. Н.Н.Приорова, г. Москва.
10-ЛЕТНИЙ ОПЫТ ПРОВЕДЕНИЯ ВАКЦИНАЦИИ ПРОТИВ ГЕПАТИТА В СРЕДИ ЛИЦ, СОСТАВЛЯЮЩИХ ГРУППЫ ВЫСОКОГО РИСКА ИНФИЦИРОВАНИЯ НВ-ВИРУСОМ. Группы высокого риска инфицирования НВ-вирусом хорошо известны. Их составляют медицинские работники (прежде всего имеющие по роду своей профессиональной деятельности частые «кровяные контакты»); дети, родившиеся у больных острым ГВ в последнем триместре беременности, хроническим гепатитом В и «носителей» НВ-вируса; члены их семей; пациенты отделений гемодиализа; воспитанники специнтернатов; больные, лечение которых сопряжено с большой «парентеральной нагрузкой»; лица, применяющие внутривенное введение наркотических препаратов; работники секс-бизнеса и др. Вакцинопрофилактика гепатита В (ГВ) среди лиц, составляющих некоторые из этих групп, была начата в нашей стране в 1990 г. после приобретения правительством Советского Союза в 1989 г. у фирмы Смит Кляйн Бичем одного миллиона доз генно-инженерной вакцины Engerix В и издания в декабре 1989 г. специального приказа Минздрава, разрешающего применение этой вакцины в группах риска. Нами была изучена эффективность иммунизации этой вакциной 1553 медработников с высоким риском заражения НВ-вирусом и 184 выпускников медучилищ; 542 детей, родившихся у женщин с персистирующей HBs-антигенемией в регионах с высоким уровнем носительства HBsAg и HBeAg, а также 1341 ребенка - в Москве; 88 пациентов отделений гемодиализа, 85 членов семей больных хроническим ГВ, 87 воспитанников специнтернатов. Лица, составляющие эти группы (кроме детей, родившихся у «носителей» HBsAg в Москве, иммунизированных в 1997-2000 гг.), были привиты против ГВ в 1990-1992 гг. Всех входящих в эти группы обследовали на наличие маркеров НВ-вирусной инфекции (HBsAg, анти-HBs с определением их концентрации) через месяц и 1-1,5 года после завершения курса вакцинации, а привитых медработников через - 5 и 10 лет. Кроме того, в этот же период были привиты против ГВ вакциной Engerix В 50000 новорожденных детей из гипер эндемичных регионов, где ранее была выявлена большая активность перинатальной передачи НВ-вируса. Параллельно анализ заболеваемости ГВ и результатов определения маркеров HBV-инфекции проводили у лиц, составляющих соответствующие группы сравнения.
Во всех группах риска (кроме пациентов отделений гемодиализа и детей, родившиеся у «носителей» HBsAg) вакцину вводили 3-кратно по схеме 0-1-6 месяцев. Пациентов, находившихся на лечении в отделениях гемодиализа, прививали двойными дозами вакцины 4-кратно по схеме 01-2-6 месяцев, а детей, родившихся у женщин с персистирующей HBs-антигенемией, иммунизировали 4-кратно (в первые сутки, затем в возрасте одного, двух и 12-14 месяцев). У всех вакцинированных лиц (за исключением новорожденных детей) предварительно было исключено наличие маркеров ГВ (HBsAg и анти-HBs).
В результате проведения иммунизации вакциной Engerix В лиц, составляющих разные группы риска, была установлена большая эффективность ее применения, доказана безопасность, высокая иммуногенная активность и слабая реактогенность этой вакцины. У 92-97% лиц из отдельных групп риска (кроме больных центров гемодиализа), привитых вакциной Engerix В, имело место образование (появление) антител к HBs- антигену в защитных титрах. Через месяц после окончания курса вакцинации анти-HBs были обнаружены у 92,3% иммунизированных медицинских работников, 96%-97,8% детей, родившихся у «носителей» HBs- антигена в разных регионах,
