CC BY
40
№ 3 - 2007 г. 15.00.00 фармацевтические науки
УДК 615.33:543.25
ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКАЯ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМФОТЕРИЦИНА В В КРОВИ
Л.В. Пашкова, Е.А. Ивановская
ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава (г.
Новосибирск)
Разработана экспресс-методика инверсионного вольтамперометрического определения амфотерицина В в крови на ртутнопленочном электроде на приборе ТА-2 (ООО НПП "Техноаналит" Россия, Томск).
Ключевые слова: вольтамперометрическая методика, амфотерицин
Препарат амфотерицин В, эффективен в отношении многих патогенных грибов, возбудителей различных заболеваний. Характерной особенностью амфотерицина В по сравнению с другими современными противогрибковыми препаратами является его эффективность при глубоких и системных микозах. Спектр его действия распространяется на дрожжи и дрожжеподобные грибы, дерматофиты, возбудителей гистоплазмоза и кокцидиоидоза, североамериканского бластомикоза, споротрихоза. Он проявляет активность против некоторых штаммов плесневых грибов из рода Aspergillus и Cephalosporium [3].
Для контроля эффективности проводимого лечения амфотерицином В, изучения фармакокинетических параметров, необходима адекватная и достоверная информация о концентрации препарата в крови, поэтому в анализе можно успешно применить высокочувствительные электрохимические методы. Предлагаемый способ определения амфотерицина В основан на применении метода инверсионной вольтамперометрии, который обладает высокой чувствительностью, экспрессностью и простотой аппаратурного оформления.
Экспериментальная часть. Объектом исследования служил амфотерицин В (лиофилизат для приготовления раствора для инфузий 50000 мкг (Ед) ). Растворы низших концентраций получали путем последовательного разведения исходного раствора водой бидистиллированной.
Концентрацию амфотерицина В определяли методом инверсионной вольтамперометрии на приборе ТА-2 (ООО НПП "Техноаналит" Россия, Томск) в двухэлектродной ячейке, индикаторным служил ртутно-пленочный электрод, электрод сравнения - хлор-серебряный [1]. Деаэрирование и перемешивание анализируемых растворов с целью
удаления следов кислорода осуществляли азотом с содержанием кислорода менее 0,001%. Фоновый раствор готовили из алюминия нитрата А1^03)3.
В работе были задействованы одноканальные дозаторы на 0,01; 0,05; 0,1; 1,00; 10,00 мл со сменными наконечниками.
Каждое из измеряемых цифровых значений является средним из трех-пяти измерений.
Результаты и их обсуждение. На начальном этапе перенесения методики определения амфотерицина В на биологический объект был проведен эксперимент по выявлению сигнала вещества в присутствии нативной сыворотки, 0,04 мл которой помещали в электрохимическую ячейку и проводили электролиз, при этих условиях сигнал амфотерицина В присутствовал. Были откорректированы параметры развертки потенциала: границы - (-0,350) ^ 0,225 В; скорость - 60 мВ/с.
Для установления линейной зависимости высоты аналитического сигнала от концентрации амфотерицина В в датчике, в электрохимическую ячейку поместили 0,01 мл сыворотки крови и измерили величину силы тока в нулевой точке, затем, прибавляя по
0,01 мл раствора стандартного образца с концентрацией 5 мг/л, параллельно измеряли силу тока в ячейке. Таким образом, было установлено, что в присутствии сыворотки крови для амфотерицина В сохраняется линейная зависимость в изменяемых условиях развертки вольтамперограммы.
С целью проверки воспроизводимости результатов определения амфотерицина В по разработанной методике был проведен тест "введено - найдено" для ста двадцати проб с концентрацией 500; 50; 5; 0,5; 0,05 и 0,005 мг/л, по двенадцать проб для каждой.
Полученные результаты подвергли статистической обработке (табл.) [2].
Как видно из таблицы, погрешность методики составляет не более 10 %, что соответствует погрешности вольтамперометрического метода, тогда как определение амфотерицина В в концентрации 0,005 мг/л отягощено систематической ошибкой в 6,98 %.
Методика определения амфотерицина В в крови на приборе ТА-2 состояла из следующих стадий:
1. Из программного обеспечения вольтамперометрического анализатора открывали приложение, обозначенное нами как "Амфотерицин В".
2. В электролитические ячейки объемом 20 мл помещали по 10 мл фонового электролита (0,1 М раствора алюминия нитрата) и запускали программу электролиза при потенциале (-0,350)В в течении 65 с. На экране монитора получали изображение вольтамперограмм фоновых линий при постоянно-токовой форме развертки потенциала.
3. В электрохимические ячейки добавляли по 0,01 мл исследуемого образца сыворотки крови, запускали программу электролиза для получения вольтамперограмм, соответствующих пробе, и измеряли высоту сигнала амфотерицина В (мкА).
4. В электролитические ячейки помещали по 0,02 мл внутреннего стандарта 5 мг/л раствора амфотерицина В и в результате электролиза получили вольтамперограммы, соответствующие пробе с добавкой.
5. Программное обеспечение прибора автоматически производило расчет концентраций. Время единичного анализа составляло не более 5 мин.
Метрологические характеристики разработанной методики
(£, число степеней свободы = 19; Р, доверительная вероятность = 95 %;^г,^, критерий
Стьюдента (табл.) = 2,09)
№ Истинное значение измеряемой величины мг/л Среднее выборки, Дисперсия, 82 Дисперсия среднего,У Стандартное отклонение, S
1 0,005 4,96х10-3 1,41х10-7 2,01х10-8 3,75х10-4
2 0,05 4,99х10-9 1,25х10-5 1,78х10-6 3,53х10-3
3 0,5 4,997х10-1 4,26х10-4 6,08х10-5 2,06х10-2
4 5 4,999 1,98х10-2 2,83х10-3 1,41х10-1
5 50 49,904 2,5х10-1 3,59х10-2 5,01х10-1
6 500 499,14 1,87 3,68х10-1 1,37
№ Истинное значение измеряемой величины мг/л Стандартное отклонение среднего, S Относительное стандартное отклонение, Sr Полуширина довери тельного интервала Относи тельная ошибка среднего результата, £,%
1 0,005 5,36х10-5 7,56х10-2 3,47х10-2 6,98
2 0,05 5,05х10-4 7,06х10-2 3,27х10-3 6,44
3 0,5 2,95х10-3 4,12х10-2 1,91х10-2 3,82
4 5 2,01х10-2 2,81х10-2 1,13х10-1 2,06
5 50 7,16х10-2 1,00х10-2 4,64х10-1 0,93
6 500 1,96х10-1 2,74х10-3 1,27 0,25
По результатам исследования были определены: величина среднего значения ("X"), дисперсия ^2), дисперсия среднего (V" х"), стандартное отклонение ^), стандартное отклонение среднего ^), относительное стандартное отклонение ^^Ь^^Ь^, полуширина доверительного интервала, относительная ошибка среднего результата (в,%).
Методика в дальнейшем может быть использована для расчетов основных фармакокинетических параметров (начальная и поддерживающая дозы, период полувыведения, константа скорости элиминации, константа скорости всасывания, токсическая и эффективная концентрации) амфотерицина В, что позволит осуществлять своевременную коррекцию фармакотерапии, подбирая дозы препарата для конкретного больного.
Так же данную методику планируется использовать в клинических исследованиях комплексной композиции амфотерицина в для регулирования его концентрации в крови.
Список литературы
1. Пашкова Л.В. Разработка методики количественного определения амфотерицина В / Л.В. Пашкова // Журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2006. -N1-2. - С. 96-97.
2. Харитонов Ю.А. Аналитическая химия (аналитика). В 2 кн. / Ю.А. Харитонов. // Кн. 2. - Москва: Высш. шк., 2001.
3. Шелкамов Н.Д. Амфотерицин в терапии глубоких микозов /Н.Д. Шелкамов, В.М. Лещенко, О.Б. Минкстер [и др.] // Успехи в области изучения и производства антибиотиков. - Вып. 2. Результаты научных исследований по амфотерицину В и его клиническому применению. - Москва, 1967. - С. 58-61.
