CC BY
97
УДК 615.281.9
ВОДНЫЙ РАСТВОР И ВОДНЫЙ ДИАЛИЗОВАННЫЙ РАСТВОР НАНОЧАСТИЦ МЕДИ, И ИХ ДЕЙСТВИЕ НА КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ ESCHERICHIA COLI
© Т.А. Шульгина, Д.М. Пучиньян
Ключевые слова: Escherichia coli; водные растворы; наночастицы; медь.
Приоритетным решением проблемы антибиотикорезистентности является применение нанотехнологий. Проведено экспериментальное исследование антибактериального действия водных дисперсий наночастиц меди в отношении 10 клинических штаммов кишечной палочки, в ходе которого изучено бактерицидное действие водных растворов и их биохимическая активность. Установлено, что при действии опытных образцов выраженность антибактериального эффекта имеет дозозависимый эффект, а ферментативная активность исследуемых штаммов не изменяется.
В настоящее время острота проблемы, связанная с инфекционно-воспалительным процессом, приобретает все большую актуальность в связи с изменением биологических свойств возбудителей и приобретением ими полиантибиотикорезистентности. Так, у St. aureus чаще всего развивается метициллинрезистентность или полирезистентность, у Ps. aeruginosa - полирезистентность и панрезистентность, у ряда грамотрицательных бактерий (E. coli, Klebsiella spp., Proteus spp. и др.) -полирезистентность. Считают, что в большинстве случаев полирезистентность обусловлена образованием этими бактериями бета-лактамаз расширенного спектра, которые, в свою очередь, являются мощным оружием защиты микроорганизмов от антибиотиков. Эти данные способствуют поиску новых средств с выраженным бактерицидным эффектом, в частности, на основе наночастиц металлов [1-3].
Работы в области получения наночастиц и исследования широкого диапазона их свойств ведутся во все мире и являются современным приоритетным направлением в развитии нанотехнологий. Вещества в нано-размерной области проявляют особые специфические свойства (механические, спектральные, электрические, магнитные и т. д.), вызывая тем самым интерес в отношении изучения влияния размера и формы ультрачастиц на химическую активность, образование малых агрегатов. Особое внимание уделяется сохранению физико-химических свойств наночастиц металлов, в т. ч. с помощью использования различных систем стабилизации в растворах [4].
В настоящее время наноразмерные материалы могут быть получены различными методами: плазмохимическим синтезом, осаждением из коллоидных растворов, термическим разложением и восстановлением, механосинтезом, детонационным синтезом, электрическим взрывом проводников, лазерным и электроннолучевым нагревом. Каждый из перечисленных методов имеет свои преимущества, недостатки и область применения [5].
В результате научных изысканий возникло новое направление в области синтеза, исследований свойств и разработки вариантов применения наночастиц метал-
лов - биохимический синтез, позволяющий получать стабильные дисперсии не только в органическом растворителе, но и в полярных средах. Е.М. Егоровой с соавторами (2011) была разработана методика получения водных дисперсий наночастиц из их мицеллярных растворов, в частности, водных дисперсий наночастиц серебра, золота, меди и цинка [6].
Интерес представляют исследования указанных водных дисперсий наночастиц металлов на различные штаммы микроорганизмов и, особенно, на полирези-стентные.
Цель - изучение антимикробного действия и биохимической активности водного раствора и водного диализованного раствора меди на клинические штаммы E. coli.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Экспериментальное исследование проводилось на 10 клинических штаммах E. coli, выделенных от больных травматолого-ортопедического профиля.
Водный раствор (CCu = 0,25 мМ, САОТ = 60 мМ) и водный диализованный раствор меди (CCu = 0,25 мМ, САОТ = 30 мМ) в концентрациях 3, 2, 1, 0,5, 0,25 и 0,125 % добавляли в питательную среду с учетом разведения. Все растворы предоставлены ООО НПК «Наномет», г. Москва.
Микробную взвесь готовили из суточной культуры с оптической плотностью 0,1 с помощью прибора «Densi La Meter». Раститрованную в изотническом растворе хлорида натрия до 104 колониеобразующих единиц (КОЕ) микробную взвесь высевали по 100 мкл на чашку Петри. Контрольную группу составляли выросшие на питательной среде КОЕ без добавления опытных образцов. Посевы инкубировали в течение суток в термостате при температуре 37 °С. После инкубации проводили подсчет выросших колоний и сравнивали их с контрольным посевом. Показателем антибактериальной активности считали концентрации исследуемых растворов, полностью подавляющие рост микроорганизмов.
3189
Таблица 1
Антибактериальный эффект водных растворов наночастиц меди на клинические штаммы E. тоН (п = 10)
Опытные растворы Контроль 3 % 2 % 1 % 0,5 % 0,25 % 0,125 %
Число колоний
Водный (С& = 0,25 мМ, Саот = 60 мМ) 1459,0 ± 91,5 - - - 785,6 ± 60,4*** 883,2 ± 57,0*** 1044,5 ± 41,4***
Водный диализованный (С^ = 0,25 мМ, САОТ = 30 мМ) 801,5 ± 78,6 - - - 471,3 ± 71,7** 424,4 ± 61,3*** 547,0 ± 78,6*
Примечание: р - уровень достоверности показателей по отношению к контрольной группе (*р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001); «-» - отсутствие роста на чашках.
Статистическая обработка экспериментальных данных проведена с использованием экспресс-метода Р.Б. Стрелкова (1986).
Следующий этап экспериментального исследования включал изучение биохимической активности 10 клинических штаммов E. тоН после воздействия водных дисперсий наночастиц меди с использованием набора «Энтеротест 16».
Из суточной культуры E. тоН готовили суспензию в изотническом растворе хлорида натрия, мутность которой соответствовала 1 -й степени по шкале мутности MacFarland. По 0,1 мл суспензии инокулировали во все лунки пластины. Затем в соответствующие лунки добавляли парафиновое масло и реактив. Подготовленную пластину набора инкубировали 24 ч при 37 °С. После термостатирования результаты всех реакций учитывали и заносили в бланки.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Данные экспериментального исследования показывают прямую зависимость антибактериального действия водного и водного диализованного растворов от их концентраций. Такая зависимость проявлялась в разнице абсолютных величин КОЕ на опытных и контрольных чашках (табл. 1).
Статистически достоверное снижение количества КОЕ отмечалось при действии:
- водного раствора наночастиц меди в концентрациях 0,5, 0,25, 0,125 % (р < 0,001);
- водного диализованного раствора наночастиц меди в концентрациях 0,5 (р < 0,01), 0,25 (р < 0,001) и
0,125 % (р < 0,05).
Таким образом, водные дисперсии наночастиц меди могут служить основанием для использования их в качестве добавки к композитным материалам, повышающим их антибактериальное действие.
При оценке биохимической активности штаммов E. тоН использовали цветную шкалу сравнения и/или таблицу для интерпретации реакций из «Энтеротеста 16». В результате проведенных исследований было установлено, что в контрольной и опытных группах сохранялась высокая ферментативная активность в отношении целлобиозы и меньшая - в отношении сахарозы, трегалозы и спиртов. При ферментации цитрата Симмонса высокая активность сохранялась только в контрольной группе, в опытных группах - у 50 % штаммов. Исследуемые штаммы E. тоН не образовывали индол, не выделяли сероводород, не разлагали инозит и мочевину, не дезаминировали фенилаланин.
Антибактериальное действие и изменения биохимических свойств клинических штаммов E. тоН под влиянием наночастиц меди, входящих в состав водных растворов, изучено недостаточно. Известно, что водные растворы наночастиц серебра имеют выраженный бактерицидный эффект при действии высоких концентраций только на музейные штаммы кишечной палочки и золотистого стафилококка, а действие наночастиц меди изучалось в качестве катализатора в промышленном производстве и для расширения спектра бактерицидной активности модифицированных наночастицами (отдельно или в сочетании с наночастицами серебра) лакокрасочных и других материалов [7]. Данные, полученные нами, согласуются с данными экспериментальных исследований Е.М. Егоровой (2010-2011), что указывает на единые механизмы подавления роста бактерий.
Таблица 2
Биохимическая активность штаммов E. тоН при действии водных дисперсий наночастиц меди (п = 10)
Тест Контроль Водный раствор меди Водный диализо- ванный раствор меди
Сероводород 10 (-) 10 (-) 10 (-)
Лизин 5 (-) / 5 (+) 5 (-) / 5 (+) 5 (-) / 5 (+)
Индол 10 (+) 10 (+) 10 (+)
Орнитин 10 (+) 5 (-) / 5 (+) 5 (-) / 5 (+)
Уреаза 10 (-) 10 (-) 10 (-)
Фенилаланин 10 (-) 10 (-) 10 (-)
Эскулин 10 (-) 10 (-) 10 (-)
Цитрат Симмонса 10 (+) 5 (-) / 5 (+) 5 (-) / 5 (+)
Малонат 10 (+) 5 (-) / 5 (+) 5 (-) / 5 (+)
Инозит 10 (-) 10 (-) 10 (-)
Адонит 10 (+) 5 (-) / 5 (+) 5 (-) / 5 (+)
Целлобиоза 10 (+) 10 (+) 10 (+)
Сахароза 2 (-) / 8 (+) 2 (-) / 8 (+) 2 (-) / 8 (+)
Сорбитол 2 (-) / 8 (+) 2 (-) / 8 (+) 2 (-) / 8 (+)
Трегалоза 2 (-) / 8 (+) 2 (-) / 8 (+) 2 (-) / 8 (+)
Маннитол 2 (-) / 8 (+) 2 (-) / 8 (+) 2 (-) / 8 (+)
Примечание: «-» - отрицательная реакция; «+» - положительная реакция.
3190
ВЫВОДЫ
1. Рост бактериальных клеток E. тоН полностью прекращается при действии 3, 2, 1 %-ных водных растворов и водных диализованных растворов наночастиц меди.
2. Водные дисперсии наночастиц меди, согласно данным, полученным с помощью «Энтеротеста 16», не оказывают выраженного влияния на ферментативную активность исследуемых и контрольных штаммов E. тоН, характерную для микроорганизмов этого вида.
ЛИТЕРАТУРА
1. Яковлев В.П., Яковлев С.В. Рациональная антимикробная фармакотерапия. М.: Бионика, 2002. 650 с.
2. Сидоренко С.В. Исследования распространения антибиотикорези-стентности: практическое значение для медицины // Инфекции и антимикробная терапия. 2002. Т. 4. № 2. С. 38-41.
3. Характеристика и клиническое значение бета-лактамаз расширенного спектра / А.Г.Березин [и др.] // Антибиотики и химиотерапия. 2003. Т. 48. № 7. С. 5-11.
4. Нанотехнології, наномедицина, нанофармокологія: стан, перспек-тивинаукових досліджень, впровадження в медичну практику / В.Ф. Москаленко [и др.] // Человек и лекарство: материалы І нац. конгр. Киев, 2008. С. 167-168.
5. Garcia-Barrasa J., Lopez-de-Luzuriaga J.M., Monge M. Silver nanoparticles: synthesis through chemical methods in solution and biomedical applications // Central European Journal of Chemistry. 2011. V. 9. № 1. Р. 7-19.
6. Егорова Е.М., Ревина А.А., Кондратьева В.С. Способ получения наноструктурных металлических частиц: патент РФ № 2147487, МПК B22F 9/24 по заявке № 99114319/02, приор. от 01.07.1999 г., опубл. 20.04.2000 г.
7. Egorova E.M. Biological effects of silver nanoparticles // Silver nanoparticles: Properties, Characterization and Applications / еd. by A.E. Welles. N. Y., 2010. P. 221-258.
Поступила в редакцию 28 октября 2013 г.
Shulgina T.A., Puchinyan D.M. AQUEOUS SOLUTION AND AQUEOUS DIALYZED SOLUTION OF COPPER NANOPARTICLES AND THEIR EFFECTS ON CLINICAL STRAINS OF ESCHERICHIA COLI
The priority of antibiotic-resistance solution is the use of nanotechnology. An experimental investigation of the antibacterial action of aqueous dispersions of copper nanoparticles against 10 clinical isolates of E. coli, during which the bactericidal action of aqueous solutions and their biochemical activity are studied. It is stated that the action of the prototypes has a strong antibacterial effect dose-dependent effect, and the enzymatic activity of the strains is not changed.
Key words: Escherichia coli; aqueous solutions; nanoparticles; copper.
3191
