CC BY
45
БИОТЕРАПИЯ ВНУТРИКОЖНАЯ КЛЕТОЧНАЯ РЕАКЦИЯ... 63
УДК 616.5-006.81:615.371.015.44 И.Н. Михайлова1, П.В. Иванов2, Н.Н. Петенко1, К.А. Барышников1, Л. Ф. Морозова , О. С. Бурова1, Е.А. Черемушкин1, C. Субраманиан1, Г.З. Чкадуа1, А.Ю. Барышников1, Л.В. Демидов1 ВНУТРИКОЖНАЯ КЛЕТОЧНАЯ РЕАКЦИЯ НА ФОНЕ ВАКЦИНОТЕРАПИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ 1РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва 2Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Контактная информация Михайлова Ирина Николаевна, кандидат медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела биотерапии опухолей НИИ клинической онкологии РОНЦ, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН адрес: 115478 Москва, Каширское ш., 24; тел.: +7(495)324-90-34 e-mail: [email protected] Статья поступила: 18.11.2009, принята к печати 02.03.2010. Резюме Изучены лимфоидные структуры биоптатов кожи пациентов с меланомой при проведении им вакцинотерапии модифицированными аллогенными опухолевыми или аутологичными дендритными клетками. Наибольшая выраженность изменений клеточного состава кожи отмечена после вакцинации аллогенной вакциной по сравнению с вакцинацией аутологичными дендритными клетками. Ключевые слова: меланома, иммунокомпетентные клетки, противоопухолевая вакцинотерапия.
I.N. Mikhaylova, P. V. Ivanov, N.N. Petenko, K.A. Baryshnikov, L.F. Morosova, O.S. Burova, E.A. Cheremushkin, S. Subramanian, G.Z. Chkadua, A.Yu. Baryshnikov, L.V. Demidov IMMUNE REACTION OF THE SKIN IN MELANOMA PATIENTS AFTER VACCINE THERAPY N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow I.M. Sechenov Moscow Medical Academy Abstract Lymphoid structures of the skin were studied in melanoma patients after antitumor vaccination. We have studied biopsy material of the skin using standard and immunohistochemical methods of staining. Patients with allogenic gene-modified tumor cell based vaccine showed well-defined morphological changes of the skin in comparison with patients who received autologous dendritic cell vaccine primed with oncolysate in vitro. Key words: melanoma, immunocompetent cells, antitumor vaccinotherapy. Введение Цель исследования - изучение клеточного состава кожи пациентов с диссеминированной ме- Механизмы иммунного ответа в настоящее ланомой в процессе терапии аллогенной или денд-время представляются достаточно изученными. Зна- ритной вакциной. чительно в меньшей степени известны принципы реализации иммунных реакций в коже. Впервые предпо- Материалы и методы ложение о том, что кожные покровы являются генератором и местом развития иммунной гиперчувстви- Пациентам с диссеминированной меланомой тельности высказал в 1930 г. M.B. Sulberher. С 1970 г. кожи проводилась иммунотерапия противоопухоле-K.Fichtelius и соавт. изучали вопрос об участии кожи выми вакцинами на основе аутологичных дендритных в иммунных реакциях организма как лимфоидного или модифицированных опухолевых аллогенных кле-органа первичного уровня. В 1980-х гг. сформирова- ток. Вакцина вводились пациентам внутрикожно в лась теория о коже как органе центрального и пери- несколько точек (от 2 до 10) в непосредственной бли-ферического иммунногенеза [2; 5; 13]. За последние зости от регионарных лимфатических коллекторов. годы накоплены новые данные об иммунных функци- Однократная доза введения клеток составляла от 1,0 ях [4; 7; 8; 9; 11]. Установлена корреляция между вы- до 3,0*106 клеток для дендритной вакцины и до раженностью показателей иммунных реакций в пе- 30,0*106 для аллогенной, интервалы между вакцина-риферической крови и изменениями клеточного со- циями составляли 1-2 нед. Биопсия кожи производи-става кожи [6]. Описаны реакции иммунных структур лась перед первой и третьей вакцинациями в отдале-кожных покровов при ВИЧ-инфекции [1; 12], а также нии от места вакцинации, в подлопаточной области их участие в развитии опухолевых процессов [3]. на 1-2 см ниже угла лопатки по лопаточной линии. Имеются данные, позволяющие рассматривать Повторная биопсия проводилась перед третьим введе-кожу как орган, аналогичный тимусу [2; 10]. По- нием вакцины в подлопаточной области противопо-скольку введенные противоопухолевые вакцины в ложной стороны. Толщина биоптата составляла около виде дендритных и аллогенных клеток оказывают 1,5-2 мм, включая фрагмент слоя гиподермы. Исследо-системное иммуномодулирующее воздействие, пред- вались образцы тканей 10*10*3 мм. Подготовка мате-ставляет интерес изучение клеточного состава кожи в риала проводилась согласно стандартному протоколу с процессе противоопухолевой вакцинации. помощью окраски гематоксилином-эозином.
№ 1/том 9/2010 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
Иммуногистохимическая характеристика клеток до терапии дендритными клетками___
Слои кожи Клетки Сосочковый слой Сетчатый слой Потовые железы Сальные железы
Внесосудистая зона Периваскулярные пространства Внесосудистая зона Периваскулярные пространства М±м % М±м %
М±м % М±м %
CD3 0,73±0,69 0,2±0,2 6,6±1,6 4,96±1,55 0 0 0 0
CD8 0,73±0,52 0,82±0,65 5,85±0,81 6,2±1,36 0 0 0,3±0,2 0,3±0,2
CD 14 0 0 10±1,88 0,83±0,5 0 0 0 0
CD20 0 0 5,95±1,58 5,84±2,04 0 0 0 0
CD56 2,3±0,26 18,03±2,44 2,92±0,32 25,22±3,66 1,9±0,35 6,64±1,9 1,6±0,3 9,65±2,3
CD83 1,57±0,4 12,9±3,65 2,37±0,5 7,74±1,66 0 0 0,6±0,24 0,65±0,29
Таблица 2
Иммуногисто химическая характеристика клеток после терапии дендритными клетками___
Слои кожи Клетки Сосочковый слой Сетчатый слой Потовые железы Сальные железы
Внесосудистая зона Периваскулярные пространства Внесосудистая зона Периваскулярные пространства М±м % М±м %
М±м % М±м %
CD3 2,38±1Д8 2,53±1,25 1,47±0,48 2Д7±0,86 0 0 0 0
CD8 6±0,7 2,1±1,06 0 0 0 0 0 0
CD 14 2±1,7 0,397±0,394 0 0 0 0 0 0
CD20 0,2±0Д9 1,58±1,57 0,5±0,38 1,8±1,36 0 0 0 0
CD56 4Д8±0,93 40,24±3,37 4,02±0,5 32,6±3,66 1,8±0,67 2,7±1,0 0,9±0,33 3,7±1,88
CD83 0,85±0,2 2,05±0,8 1,66±0,3 7,59±1,97 1,33±0,56 0,48±0,27 0 0
Иммуногистохимическая характеристика клеток до терапии вакциной Аллоген
Слои кожи Клетки Сосочковый слой Сетчатый слой Потовые железы Сальные железы
Внесосудистая зона Периваскулярные пространства Внесосудистая зона Периваскулярные пространства М±м % М±м %
М±м % М±м %
CD3 1,95±0,37 18,73±2,97 3,05±0,53 18,32±3,84 0 0 0,2±0Д 0,97±0,55
CD8 0Д5±0,08 0,94±0,54 0Д5±0,08 0,69±0,39 0 0 0 0
CD 14 0,23±0,08 1,74±0,64 0,53±0Д7 0,84±0,36 0 0 0 0
CD20 1Д8±0,24 17,77±3,71 1,89±0,32 15,29±3,94 0 0 0,7±0,38 2±1Д9
CD56 0,63±0,20 5,12±1,52 1,37±0,37 2Д1±0,69 0,4±0Д8 0,87±0,42 0 0
CD83 1Д±0,2 6,43±0,96 1ДЗ±0Д8 7,13±1,36 1±0,28 0,67±0,35 0,8±0,33 0,36±0,2
Таблица 4
Иммуногисто химическая характеристика клеток после терапии вакциной Аллоген
Слои кожи Сосочковый слой Сетчатый слой Потовые железы Сальные железы
Внесосудистая зона Периваскулярные пространства Внесосудистая зона Периваскулярные пространства М±м % М±м %
Клетки М±м % М±м %
CD3 4,6±0,95 15,57±3,08 10,3±2,61 14,64±2,98 11,55±3,83 5,6±1,66 9,75±3,55 4,26±1,49
CD8 1,27±0,33 1,73±0,36 4,6±0,85 7,22±1,38 0 0 4,05±0,88 4,07±1,37
CD 14 0,4±0Д5 0,67±0,29 2Д±0,55 3,32±1,38 0 0 0,5±0,25 0,45±0,28
CD20 2,23±0,47 9±2,0 2,48±0,57 6,66±1,5 0,3±0Д2 0,5±0,22 0,7±0,25 1,01±0,36
CD56 2Д±0,36 5,07±0,94 2,3±0,37 5,7±1,09 0 0 2,05±0,45 ЗД8±0,79
CD83 1,45±0,27 5,2±1,09 1,7±0,33 5Д7±0,93 0Д2±0,06 0,24±0Д4 0,4±0ДЗ 0,7±0,24
66
БИОТЕРАПИЯ
ВНУТРИКОЖНАЯ КЛЕТОЧНАЯ РЕАКЦИЯ..
Исследование гистологических срезов изучалось с помощью световой микроскопии при малом и большом увеличениях.
Подсчет клеток проводился с помощью визирной сетки. Статистический анализ проводился с помощью t-критерия Стьюдента.
Более детальный клеточный состав биоптатов исследовался посредством иммуногистохимического анализа с использованием моноклональных антител к Т-клеткам (CD3, CD8), моноцитам (CD 14), B-клеткам (CD20), NK-клеткам (CD56), дендритным клеткам (CD83). Антитела производства Novocastra Laboratories.
Результаты
Изучены 24 препарата биоптатов кожи подлопаточной области до и после вакцинации, взятые у 12 пациентов (7 мужчин и 5 женщин), которым проведена терапия аутологичными дендритными клетками.
В полученных препаратах кожи пациентов в периваскулярных пространствах сосочкового слоя после вакцинации отмечалось достоверное (р<0,05) увеличение количества фибробластов и макрофагов и достоверное (р<0,05) уменьшение количества фиброцитов, появление эозинофилов; периваскулярные пространства сетчатого слоя оставались без изменений (статистически достоверных различий не выявлено); в клеточном окружении потовых желез отмечалась тенденция (р<0,1) к увеличению количества фибробластов, уменьшению количества деструкций; в клеточном окружении сальных желез отмечалась тенденция (р<0,1) к уменьшению количества больших лимфоцитов и достоверное (р<0,05) увеличение количества деструкций.
Иммуногистохимическое исследование было проведено на 16 препаратах биоптатов кожи подлопаточной области на материале, полученном до и после вакцинации.
На фоне проводимой вакцинации в перива-скулярных пространствах сосочкового слоя отмечено достоверное (р<0,05) уменьшение количества маркеров дендритных клеток (CD83) с тенденцией к увеличению количества NK-клеток (CD56); увеличение количества NK-клеток (CD56) в перива-скулярных пространствах сетчатого слоя (р<0,05) и тенденция к уменьшению количества T-клеток (CD3; табл. 1-2). Клеточное окружении потовых сальных желез оставалось без динамики.
На фоне вакцинации модифицированными аллогенными опухолевыми клетками изучены 16 препаратов биоптатов кожи подлопаточной области, взятых у 3 мужчин и 5 женщин до и после вакцинации.
На фоне проводимой вакцинации в коже пациентов в периваскулярных пространствах сосоч-кового слоя отмечено достоверное (р<0,05) увеличение количества средних лимфоцитов и достоверное (р<0,05) увеличение количества больших, средних, малых лимфоцитов и макрофагов в сетчатом слое.
В окружении клеточного состава потовых желез отмечена тенденция (р<0,1) к увеличению количества фиброцитов, средних лимфоцитов, макрофагов.
В окружении клеточного состава сальных желез отмечено достоверное (р<0,05) увеличение количества больших лимфоцитов, тенденция (р<0,1) к увеличению количества плазмоцитов (рис. 1-3). Иммуногистохимические исследования 8 био-
птатов кожи подлопаточной области до и после вакцинации в периваскулярных пространствах со-сочкового слоя показали достоверное (р<0,05) увеличение количества Т-клеток (CD3, CD8), B-клеток (CD20), NK-клеток (CD56).
Периваскулярные пространства сетчатого слоя также характеризовались достоверным (р<0,05) увеличением количества CD3, CD8, CD14, CD56 маркеров.
В окружении клеточного состава потовых желез отмечено достоверное (р<0,05) увеличение количества Т-клеток (CD3); в окружении клеточного состава сальных желез отмечено достоверное (р<0,05) увеличение количества Т-клеток (CD3, CD8,) и NK (CD56) (табл. 3-4; рис. 4).
Обсуждение
По данным ряда авторов [3] кожа является высокоорганизованным периферическим органом, ассоциированным с иммунной системой, обладающим необходимым составом иммунных клеток, кооперативно взаимодействующих между собой при участии иммунорегуляторных цитокинов.
Согласно представлениям современных исследователей [3-5; 12], основными участниками иммунных реакций в кожных покровах являются клетки лимфоидного ряда и макрофагальные клетки. Ранее A. Chang и соавт. [14] изучали внутри-кожную реакцию на введение дендритных клеток, нагруженных аутологичным опухолевым лизатом.
На фоне вакцинотерапии дендритными клетками отмечалось изменение клеточного состава иммунокомпетентных клеток в месте внутрикожно-го введения вакцины.
При световой микроскопии кожных биопта-тов, окрашенных гематоксилином-эозином, в поверхностных слоях кожи отмечалась умеренная периваскулярная лимфоидная инфильтрация, при этом в более глубоких слоях кожи присутствовали более крупные периваскулярные и интерстициаль-ные инфильтраты мононуклеарных клеток.
В воспалительном внутрикожном инфильтрате также присутствовали эозинофилы, дендритные и единичные плазматические клетки.
При иммуногистохимической характеристике клеточных инфильтратов было установлено, что они состоят из кожных дендритных клеток, лимфо-цитарные скопления содержали преимущественно CD4 лимфоциты и в меньших количествах CD8 лимфоциты [14].
Наше исследование биоптатов показало, что при вакцинотерапии дендритными клетками больных диссеминированной меланомой появляются количественные изменения клеточных популяций в коже. При аллогенной вакцинации отмечается более выраженная лимфоидная инфильтрация, что может быть обусловлено развитием реакции «трансплантат против хозяина» или белковыми активациями цито-кинов трансфицированных клеток.
Таким образом, внутрикожное введение противоопухолевых вакцин способствует увеличению количества иммунокомпетентных клеток (лимфо-идных, NK, дендритных) в участках кожи, не затронутых введением вакцины, что может свидетельствовать об активации иммунной системы организма как в крови, так и в коже.
Иллюстрации 1—4 см. на стр. VI—VII
БИОТЕРАПИЯ
ВНУТРИКОЖНАЯ КЛЕТОЧНАЯ РЕАКЦИЯ..
67
Выводы
1. Внутрикожная вакцинация генно-инженерной вакциной «Аллоген» приводит к активации иммунных механизмов защиты кожи, проявляющейся в увеличении количества иммунокомпетентных клеток (больших, средних, малых лимфоцитов, макрофагов, плазмоцитов) в различной степени выраженности в различных областях кожи, в основном в периваскулярных пространствах сетчатого слоя. При иммуногистохимическом исследовании выявляется достоверное увеличение количества СБ3 маркеров во всех областях кожи, увеличение CD8, CD56 везде за исключением окружения потовых желез, увеличение CD20 сосочкового и CD14 маркеров сетчатого слоя в периваскулярных пространствах.
2. В процессе вакцинотерапии пациентов с диссеминированной меланомой дендритными клетками, нагруженными опухолевым лизатом, отмечается сдвиг в пользу фибробластов в соотношении между клетками фиброидного ряда в периваскулярных пространствах сосочкового слоя, а также умеренно выраженная эозинофилия; в окружении сальных желез увеличивается количество деструктивных клеток. При иммуногистохимическом исследовании выявляется достоверное увеличение CD56 маркеров в периваскулярных пространствах сетчатого слоя, тенденция к увеличению их в периваску-лярных пространствах сосочкового слоя, уменьшение CD83 маркеров в периваскулярных пространствах сосочкового слоя, CD3 маркеров в периваскулярных пространствах сетчатого слоя. В окружении потовых и сальных желез статистически значимых изменений не отмечается.
Работа выполнена при финансовой поддержке Правительства г. Москвы в рамках Научно-технической программы «Разработка и внедрение в медицинскую практику новых методов и средств диагностики и лечения онкологических и других заболеваний» и гранта «Terry Fox Run».
Литература
1. Бархина Т.Г., Пархоменко Ю.Г. Морфологическая характеристика клеток эпидермиса при ВИЧ // Архив патологии. - 1996. - № 5. - С. 64-7.
2. Белецкая Л.В., Беренбейн Б.А. Сходство эпителиальных клеток и эпителия тимуса // Вестник дерматологии. - 1986. - № 8. - С. 15-21.
3. Вавилов А.М., Лезвинская Е.М. Иммунокомпетентные структуры кожи их роль в развитии первичных кожных лимфом // Архив патологии. - 1996. - № 6. - С. 7-12.
4. Гантиевская Ю.А. Селявко В.В. Дендритные клетки: роль в системе иммунитета // Иммунопатология, аллергология и инфектология. - 2001. - № 4. - С. 5-19.
5. Зимина И.В., Лопухин Ю.М. Кожа, как иммунный орган //Иммунология. - 1994. - № 6. - С. 8-12.
6. Кашутин С.Л. Соотношение параметров иммунных реакций в коже и периферической крови. Авто-реф. дисс. ... канд. мед. наук. Архангельск, 1998.
7. Кошевенко Ю.Н. Механизмы клеточного иммунитета в коже // Косметика и медицина. - 2001. - № 3.
- С. 15-26.
8. Марголина А. Защитные системы кожи и косметические средства // Косметика и медицина. - 2002. -№ 3. - С. 8-20.
9. Сергеев А.Ю., Караулов А.В., Сергеев Ю.В. Иммунодерматология: иммунологические основы патогенеза воспалительных дерматозов человека // Иммунопатология, аллергология и инфектология. -2003. - № 3. - С. 10-23.
10. Фролов Е.П., Персина И.С., Лезвинская Е.М. О значении лимфоидных образований кожи в иммунно-генезе // Вестник дерматологии и венерологии. - 1988. - № 1. - С. 29-34.
11. Шишкова И.В., Авакян А.Р. Иммунные реакции кожи и ассоциированных с ней лимфатических узлов // Актуальные вопросы дерматовенерологии. - Курск, 2000. - Вып. 3. - С. 157-60.
12. Braathen L.R. The role of Langerhans cell in HIV-infection // The XXIII Congress Of The Polish Derma-tologic Society, Wrodaw 14.09-16.09 1989, Summaries. - P.5.
13. Braathen L.D. The role of human epidermal LC in skin immunity // Derm. Beruf. Umwelt. - 1987. - 35(2).
- P. 58-61.
14. Chang A., Redman B., Whitfield J. et al. A Phase I Trial of Tumor Lysate-pulsed Dendritic Cells in the Treatment of Advanced Cancer // Clinical Cancer Research. - 2002. - 8. - P. 1021-32.
Рисунки к статье И.Н. Михайловой и соавт.
«ВНУТРИКОЖНАЯ КЛЕТОЧНАЯ РЕАКЦИЯ НА ФОНЕ ВАКЦИНОТЕРАПИИ МЕЛАНОМЫ КОЖИ»
Рис. 1. Инфильтрация периваскулярных пространств сетчатого слоя, выводных протоков потовых желез, концевых отделов сальных желез на фоне вакцинации генно-инженерной вакциной: А - до проведения вакцинотерапии; Б - после проведения вакцинотерапии.
Рис. 2. Инфильтрация периваскулярных пространств сосочкового и сетчатого слоев кожи на фоне вакцинации генно-инженерной вакциной:
А - до проведения вакцинотерапии Б - после проведения вакцинотерапии.
Рис. 3. Инфильтрация перигландулярных пространств сальных желез (большое увеличение) на фоне вакцинации генно-инженерной вакциной:
А - до проведения вакцинотерапии; Б - после проведения вакцинотерапии.
j." ., - -'■■ -f 'г '
rf.
■ Г -. •• ■-■ ■
■ ! r. .'V ■
■ ■ 1 .. ...L . "«ft
ж
i- ; v > í
i .' -J с ■■ ■ ■,-
.f У^Ví^i^'-fífti'Vi-j .i-;
(Щ1 ! . '. . J
: (i •'* J >■
ш Ч L
А- ■ í г,
.
. X ^'г
№
. tjK y bfc.....4' . Г. ■■ ....... ' 4
ИЗ Si
I \ I , . -т.-л ...
I I - ___- ■ " .■■../■■ ' w ¥
Рис. 4. Иммунногистохимическая окраска на CD8 на фоне вакцинации генно-инженерной вакциной: А - до проведения вакцинотерапии; Б - после проведения вакцинотерапии.
Рисунки к статье М.А. Чекаловой и соавт. «ВОЗМОЖНОСТИ ЭХОГРАФИИ
ПРИ ДИАГНОСТИКЕ МЕТАСТАЗОВ ЛЕЙОМИОСАРКОМ ТЕЛА МАТКИ»
MTS HEPAR LMS:- - О Cancer, reseach center
Abdomen tmse
26/11 /2008 13:15:44
0 ♦
Storing HDD:29% Free
-■CINE REVIEW ►
Рис. 6. Ультразвуковая томограмма больной ЛМС с метастазами в большом сальнике.
