CC BY
27
И. В. ПЕТРОВА, К. Ю. РУКИН
влияние 3-нитротирозина на дифференцировку
И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ дендритных КЛЕТОК
у больных бронхиальной астмой
□ шп mrrnnn гпп^г-п iiiiinn гтттппп mrrmn ггпг □ пшггпгш ill 1гш гтпггг ПГЕППППШГШ гппггггпп гп п □гшп, 634050, С] сглгц ш н гтгггппп п гппп, 2.
E-mail: [email protected], П Ш +79234335151
В условиях нитрозилирующего стресса дендритные клетки созревают в присутствии высоких концентраций 3-нитротирозина, который может влиять на их функциональную активность. В исследовании принимали участие больные легкой и тяжелой бронхиальной астмой. Культивирование незрелых дендритных клеток из моноцитов периферической крови проводили по стандартным протоколам в присутствии 3-нитротирозина, для индукции созревания дендритных клеток использовали липополисахарид. Для контроля созревания дендритных клеток оценивали экспрессию клеточных маркеров (CD 25, CD83, CD86, HLA-DR). Установлено, что 3-нитротирозин в концентрации 5-10 нг/мл стимулирует созревание дендритных клеток у больных бронхиальной астмой. Высокие дозы 3-нитротирозина вызывают задержку созревания и угнетение функциональной активности дендритных клеток.
Ключевые слова: бронхиальная астма, дендритные клетки, 3-нитротирозин.
I. V. PETROVA., K. Yu. RUKIN
EFFECT OF 3-NITROTYROSINE THE DIFFERENTIATION AND FUNCTIONAL ACTIVITY OF DENDRITIC
CELLS IN PATIENTS WITH BRONCHIAL ASTHMA
Central-scientiically research laboratory the Siberian state medical university,
Russia, 634050, Tomsk, street the Moscow path, 2.
E-mail: [email protected], tel. +79234335151
In conditions of nitrosative stress dendritic cells mature in the presence of high concentrations of 3-nitrotyrosine, which can affect their functional activity. The study involved patients with mild and severe bronchial asthma. Cultivation of immature dendritic cells from peripheral blood monocytes was performed by standard protocols in the presence of 3-nitrotyrosine to induce maturation of dendritic cells using lipopolysaccharide. To control the maturation of dendritic cells was evaluated expression of cell markers (CD 25, CD83, CD86, HLA-DR). Established that the 3-nitrotyrosine in concentration 5,10 ng/ml stimulates the maturation of dendritic cells in patients with bronchial asthma. High doses of 3-nitrotyrosine cause a delay of maturation and inhibition of functional activity of dendritic cells.
Key words: bronchial asthma, dendritic cells, 3-nitrotyrosine.
Введение
По современным представлениям, воспаление дыхательных путей является основным морфологическим признаком бронхиальной астмы, определяющим ее клинико-функциональные проявления [3, 11]. Воспаление в бронхиальной стенке сопровождается интенсивным образованием токсических метаболитов N0 и формированием нитрозилирующего стресса. В предыдущих исследованиях нами установлено, что накопление 3-нитротирозина (3-НТ) в дыхательных путях при тяжелой астме ассоциировано с формированием особого морфологического паттерна воспаления, признаками которого являются снижение плотности эозинофилов и объемной плотности реснитчатых эпителиоцитов и увеличение плотности нейтрофилов [1, 2]. Механизм участия 3-нитротирозина в этом процессе неизвестен.
В регуляции иммунного ответа и развитии аллергических реакций ключевую роль играют дендритные клетки (ДК) [4, 6]. ДК выполняют важные иммунорегу-ляторные функции, такие как контроль за дифферен-цировкой Т-лимфоцитов, регуляция активации и супрессии иммунного ответа. ДК поглощают антигены,
процессируют и представляют на своей поверхности в комплексе с HLA I или HLA II классов. В зависимости от типа патогена дендритные клетки способны направлять дифференцировку наивных Т-хелперов (Th0) в сторону Th-1, Th-2, регуляторных Т-клеток или Th 17 [7].
В условиях нитрозилирующего стресса ДК созревают в присутствии высоких концентраций 3-нитротирозина, который, возможно, влияет на их функциональную активность либо путем прямой цитотоксичности, либо через формирование в очаге воспаления определенного цитокинового профиля.
Целью настоящего исследования являлось изучение влияния 3-нитротирозина на созревание и функциональную активность дендритных клеток у больных бронхиальной астмой.
Материалы и методы исследования
В исследовании принимали участие больные легкой (n=30) и тяжелой (n=30) бронхиальной астмой (мужчины и женщины в возрасте от 18 до 60 лет, средний возраст 35,12± 1,61 года). Диагноз и тяжесть заболевания определяли в соответствии с рекомендациями Международного согласительного документа GINA.
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (128) 2011 УДК 5Т7.112.387.3:576.53:616.248
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (128) 2011
Контрольную группу составили 50 человек в возрасте от 18 до 60 лет.
Критерии включения пациентов в исследование: амбулаторные и стационарные пациенты; положительные аллергопробы с 1 и более аэроаллергенами;
пациенты, имеющие ранее подтверждённый диагноз бронхиальной астмы:
1-я группа: лёгкая персистирующая астма (на момент включения в исследование необходимо наличие одного и более следующих признаков: симптомы чаще, чем 1 раз в неделю, но реже, чем 1 раз в день; ночные симптомы чаще 2 раз в месяц, но не чаще 1 раза в неделю; вариабельность ПСВ (ОФВ1) 20-30%, при этом ОФВ1 > 80% от должного и ПСВ > 80% от персонального лучшего (ОФВ1 - объем форсированного выдоха за 1 сек., ПСВ - пиковая скорость выдоха);
2-я группа: тяжёлая персистирующая астма (на момент включения в исследование необходимо наличие одного и более следующих признаков: симптомы ежедневные; частые ночные симптомы; ограничение физической активности; вариабельность ПСВ (ОФВ1) более 30%, при этом ОФВ1< 60% от должного и ПСВ< 60% от персонального лучшего;
пациенты, у которых РС20 (концентрация метахоли-на, вызывающая падение ОФВ1 на 20% и более) в ме-тахолиновом тесте < или = 8 мг/мл;
пациенты, не получавшие (в течение последнего месяца) терапии следующими препаратами: глюкокортикостероиды (системные, ингаляционные, топические), антилейкотриеновые препараты, пролонгированные теофиллины, пролонгированные Р2-агонисты, кромогликат натрия, недокромил натрия, омализумаб);
пациенты, не имевшие острых респираторных заболеваний, а также обострений астмы в течение предшествующих 4 недель;
пациенты, умеющие правильно пользоваться ингалятором, пикфлоуметром, способные адекватно оценивать своё состояние, а также своевременно и верно заполнять дневники самоконтроля (ПСВ - утро, вечер; оценка дневных и ночных симптомов).
Критерии включения в контрольную группу: отрицательные кожные аллергопробы;
IgE < 100 МЕ/мл;
отсутствие аллергических заболеваний на момент включения и в анамнезе;
пациенты, не получавшие (в течение последнего месяца) терапии следующими препаратами: глюкокортикостероиды (системные, топические), антилейкотриеновые препараты, пролонгированные теофиллины, пролонгированные Р2-агонисты, кромогликат натрия, недокромил натрия, омализумаб;
пациенты, не имевшие острых респираторных заболеваний.
Культивирование незрелых дендритных клеток из моноцитов периферической крови больных БА и здоровых доноров проводили по стандартным протоколам. На 6-й день культивирования к полученным незрелым ДК добавляли 3-НТ (в различных концентрациях: 5, 10, 50, 500 нг/мл). Для индукции созревания ДК использовали ЛПС (концентрация в лунке 100 нг/мл). Инкубировали при 37° в С02-инкубаторе. На 8-й день ДК собирали для последующего определения поверхностных CD-маркеров. Контроль созревания ДК и оценку экспрессии клеточных маркеров дендритных клеток (CD 25, CD83, CD86, HLA-DR) проводили методом проточной цитофлюориметрии с использованием моноклональных антител anti-CD25-PE, anti-CD83-PE, anti-CD86-FITC (BD «Pharmingen»), anti-HLA-DR-FITC («Сорбент», Москва) с последующим анализом на цитометре «FACS Calibur» (BD «Biosciense»).
СИЕШШ 1
Влияние различных концентраций ЗНТ на клетки
Рабочая доза 3-НТ Изменения клеток в мазке Условия культивирования
5 нг/мл Реакция идет по типу спонтанной стимуляции. Характерных изменений нет. Клетки целые. Напоминает стандартный мазок крови. Отмечается повышенное содержание нейтрофилоб 20% ЭТС/RPMI 72 часа 37° С Се2
10 нг/мл Наблюдаются синтетические процессы в клетках. Клетки активные, делящиеся. Отмечается повышенное содержание моноцитов 20% ЭТС/RPMI 72 часа з/с С°2
50 нг/мл Синтетические процессы в клетках идут. Есть клетки с разрушенными мембранами. Отмечается повышенное содержание моноцитов 20% ЭТС/RPMI 72 часа 37° С С°2
500 нг/мл Угнетающая функция данной дозы на клетки. Клетки живы, но стимулирующего и активирующего эффекта на них не наблюдается. Вновь отмечается повышенное содержание нейтрофилов 20% ЭТС/RPMI 72 часа 37° С Се2
сИШШ 2
Экспрессия поверхностных молекул на дендритных клетках в присутствии или отсутствии 3-нитротирозина
Маркер (%) Незрелые ДК дк-лп с ДК+3-НТ (5 нг/мл) ДК+3-НТ (10 нг/мл) ДК+3-НТ (50 нг/мл) ДК-3-НТ (500 нг/мл)
Легкая бронхиальная астма
CD25+ 19,5±2,2 42,4=4,2 40,7=5,1 35,5=4,3 10,9=2,6 2,7±0,6**
CD83+ 13,1=4,2 32,9±4,3 35,0±6,2 33,9=5,3 12,3=4,1 4,9=1,9**
CD86- 11,8=2,1 48,9=5,8 33,9=4,5 22,7=4,6 Р2<0,05 3,2=0,7 1,9=0,5**
HLA-DR 40,7=4,3* 65,2=6,6* 67,1=8,24 57,3=7,7 Р1<0,05 Р2<0,05 5,3=0,6 2,6=1,8**
Тяжелая бронхиальная астма
CD25+ 17,7=2,2 36,3=4,2 46,3=6,1 76,3=8,1 Р1<0,05 Р2<0,05 22,2=0,9 3,1 =0,9**
CDS3- 16,0=4,1 30,7=6,1 48,1=7,4 59,3=8,7 Р1<0,05 Р2<0,05 18,4=3,5 58=2,4**
CD86- 11,4=3,5 43,4=3,9 34,2=5,5 27,2=9,5 Р1<0,05 10,2=3,6 1,9=0,4**
HLA-DR 37,7=4,3* 60,9=5,3* 66,7=7,2 70,4=6,2 Р2<0,05 19,3=3,7 3,4=1,2**
Группа контроля
CD25+ 18,7=2,5 39,1=3,8 35,8=4,4 25,1=4,2 11,0=1,8 2,7=0,6**
CD83+ 12,3=3,9 29,3=5,7 34,2=5,9 28,3=6,1 Р2<0,05 13,1=3,0 4,9=19**
CD86+ 13,6=3,1 45,9=4,1 34,0=4,6 5,0=1,6 Р1<0,01 Р2<0,05 2,0=0,5 1, 9=0,5**
HLA-DR 41,4=4,2* 63,1=4,9* 60,7±6,8* 13,1=2,9 Р1<0,01 Р2<0,05 4,8±0,5 2,6±1,8**
Примечание: * - Р<0,05 по сравнению с экспрессией CD25+, CD83+, CD86+;
** - Р<0,01 по сравнению с экспрессией соответствующих маркеров ДК, культивированных с
3-НТ в концентрации 5-10 нг/мл;
Р1 - по сравнению с экспрессией HL A-DR при концентрации 3-НТ 5 нг/мл;
Р2 - по сравнению с экспрессией соответствующих маркеров при культивировании ДК легкой
БА с 3-НТ в концентрации 5 нг/мл.
Статистический анализ данных проводили с использованием параметрических и непараметрических критериев, методов дискриминантного и лог-регресси-онного анализа.
Результаты и обсуждение
Эффективность иммунного ответа и его направленность во многом определяются функциональной активностью ДК и характером их взаимодействия с Т-лимфо-цитами. В свою очередь, функциональная активность ДК во многом зависит от степени их зрелости [8, 10, 5].
Для определения фенотипа и функциональной активности ДК, образующихся в условиях нитрозилирующе-го стресса, ДК культивировали с различными концентрациями 3-НТ (5-500 нг/мл) и сравнивали экспрессию поверхностных CD-маркеров (CD83, CD25, CD86 и HLA-DR) у больных легкой и тяжелой бронхиальной астмой и у здоровых доноров. Концентрации 3-НТ были выбраны на основании исследования, которое включало в себя тестирование действия 3-НТ на клетки в реакции биотрансформации лимфоцитов (макро-РБТЛ) (табл. 1). Установлено, что in vitro 3-НТ в концентрации
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (128) 2011
Кубанский научный медицинский вестник № 5 (128) 2011
(5-500 нг/мл) не влияет на жизнеспособность клеток и не обладает цитотоксичностью для ДК [9, 12].
Фенотипический анализ показал, что незрелые ДК как у больных БА, так и в группе контроля характеризовались повышенной экспрессией HLA-DR и более низкой (р<0,05) экспрессией костимуляторных молекул (CD86), маркеров активированных клеток (CD 25) и маркеров зрелых ДК (CD 83) (табл. 2). Как и ожидалось, ДК, стимулированные ЛПС, демонстрировали повышенную экспрессию поверхностных маркеров. В целом фенотип популяции ДК, стимулированных ЛПС, при БА был сопоставим с популяцией ДК, стимулированных ЛПС, у здоровых доноров (табл. 2).
Сравнительный фенотипический анализ показал, что при культивировании ДК больных легкой БА с 3-НТ в концентрации 5 и 10 нг/мл, не отмечалось снижения доли CD83+ зрелых и CD25+ активированных клеток, и популяция ДК по своему фенотипу была схожей с таковой в контрольной группе. Отмечено ингибирующее действие 3-НТ в концентрации 10 нг/мл на экспрессию HLA-DR (57,3±7,7% против 67,1±8,2% при концентрации 3-НТ 5 нг/мл, р<0,05) и на экспрессию CD86 (22,7±4,6 против 33,9±4,5 при концентрации 3-НТ 5 нг/ мл, р<0,05) у больных легкой БА. Как видно из таблицы
2, при увеличении концентрации 3-НТ до 50 и 500 нг/ мл ДК больных легкой БА характеризовались признаками задержки созревания, что проявлялось снижением доли CD83+ зрелых, CD25+ активированных клеток и CD86 костимуляторных молекул.
При увеличении концентрации 3-НТ до 10 нг/мл в группе контроля отмечалось достоверное снижение относительного количества зрелых CD83 (28,3±6,1% против 34,2±5,9% при концентрации 5 нг/мл), CD25 активированных клеток (25,1±4,2% против 35,8±4,4%), CD86 костимуляторных молекул (5,0±1,6% против 34,0±4,6%), а также рецепторов HLA-DR (13,1 ±2,9% против 60,7±6,8). В то же время экспрессия CD83, CD25 и HLA-DR ДК больных тяжелой БА, культивированных с 3-НТ в концентрации 10 нг/мл, была значительно (р<0,05) выше, чем у ДК, культивированных с той же концентрацией 3-НТ в группе с легкой БА и группе контроля (табл. 2).
Экспрессия CD83, CD25 и HLA-DR ДК больных тяжелой астмой показала колоколоподобный дозозависимый ответ: при увеличении дозы 3-НТ экспрессия достоверно возрастала, максимум наблюдался при концентрации 3-НТ 10 нг/мл, затем экспрессия маркеров достоверно (р<0,05) уменьшалась (3-НТ в дозе 50 нг/мл) и при культивировании с 3-НТ в концентрации 500 нг/мл популяция ДК характеризовалась признаками задержки созревания (табл. 2). На фоне этого ДК больных тяжелой БА при культивировании с 3-НТ демонстрировали постепенное достоверное (р<0,05) дозозависимое снижение экспрессии CD86 костимуляторных молекул. Костимуляторные сигналы через CD86 имеют важное значение, поскольку являются решающим фактором для направления дифференциров-ки наивных CD4+ Т-лимфоцитов в сторону Т1л2 клеток. Возможно, именно с низкой экспрессией CD86 связано то, что при тяжелой БА в условиях нитрозилирующего стресса имеют место признаки Т1"|1-подобного ответа. В свою очередь, при легкой астме иммунный ответ развивается по классическому Т1л2 пути. Таким образом, можно говорить о влияния нитрозилирующего стресса
на направленность иммунного ответа при аллергическом воспалении дыхательных путей.
Полученные нами данные свидетельствуют о нарушении созревания и изменении функциональной активности ДК в условиях нитрозилирующего стресса. Высокая концентрация 3-нитотирозина ингибирует дифференцировку, созревание и функцию дендритных клеток, 3-НТ является одним из факторов, определяющих характер взаимодействия ДК с Т-кпетками, участвующими в реализации аллергического воспаления дыхательных путей. Результаты исследования свидетельствуют о том, что 3-НТ играет важную роль в формировании особого паттерна воспаления, характерного для тяжелой астмы, результатом которого являются ремоделирование бронхиальной стенки, необратимая бронхообструкция и терапевтическая резистентность.
ЛИТЕРАТУРА
1. Козина О. В. Вклад токсических метаболитов NO в формирование эозинофильного воспаления при бронхиальной астме / О. В. Козина, Л. М. Огородова, Е. А. Геренг и др. // Пульмонология. -2009. - № 4. - C. 69-73.
2. Структурно-функциональные изменения в слизистой оболочке бронхов при хронических воспалительных заболеваниях / Е. А. Геренг, И. В. Суходоло, Р. И. Плешко, Л. М. Огородова,
E. Б. Букреева, О. В. Козина и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2009. -№ 5. - C. 35-39.
3. Banchereau J. Dendritic cells and the control of immunity / J. Banchereau, R. M. Steinman // Nature. - 1998. - Vol. 392. -P. 245-252.
4. Characterization of dermal dendritic cells obtained from normal human skin reveals phenotypic and functionally distinctive subsets /
F. O. Nestle, X. G. Zheng, C. B. Thompson [et al.] // J. immunol. -1993. - Vol.151. - P. 6535-6545.
5. CD4+ T cell response elicited by different subsets of human skin migratory dendritic cells / A. E. Morelli, J. P. Rubin, G. Erdos [et al.] // J. Immunol. - 2005. - Vol. 175. - P. 7905-7915.
6. Dendritic cells as the terminal stage of monocyte differentiation / K. A. Palucka, N. Taquet, F. Sanchez-Chapuis, J. C. Gluckman // J. immunol. - 1998. - Vol. 160. - P. 4587-4595.
7. HartD. N. Dendritic cells: unique leukocytes populations which control the primary immune responses / D. N. Hart // Blood. - 1997. -Vol. 90. - P. 3245-3287.
8. Induction of IL-10-producing, nonproliferating CD4+ cells with regulatory properties by repetitive stimulation with allogeneic immature human dendritic cells / H. Jonuleit, E. Schmitt, G. Schuler [et al.] // J. exp. med. - 2000. - Vol. 192. №9. - P. 1213-1222.
9. Interleukin-10 prevents the generation of dendritic cells from human peripheral blood mononuclear cells cultured with interleukin-4 and granulocyte/macrophage colony-stimulating factor / C. Buelens, V. Verhasselt, D. De Grote [et al.] // Eur. j. immunol. - 1997. -Vol. 27. - P. 756-762.
10. Lanzavecchia A. The instructive role of dendritic cells on T cell responses: lineages, plasticity and kinetics / A. Lanzavecchia, F. Sallusto // Curr. opin. immunol. - 2001. - Vol. 13. № 3. - P. 291-298.
11. Prostaglandin E2 production by dendritic cells from subjects with asthma compared with normal subjects / J. A. Long, M. Fogel-Petrovic, D. A. Knight [et al.] // American journal of respiratory and critical care medicine. - 2004. - Vol. 170. - P. 485-491.
12. The serotoninergic receptors of human dendritic cells: identification and coupling to cytokine release / M. Idzko E. Panther, C. Stratz [et al.] // J. immunol. - 2004. - Vol. 172. - P. 6011-6019.
Поступила 12.06.2011
