CC BY
16УДК 577.21+601
DOI: 10.24412/2308-7188-2023-1-33-44
Лаврский Алексей Юрьевич
кандидат биологических наук, доцент кафедры биологии и географии
ФГБОУ ВО «Пермский государственный гуманитарно-педагогический
университет», Пермь, Россия 614990, г. Пермь, ул. Пушкина, 42, тел. (342) 2151952, доб. 485
e-mail: Lavrsky@pspu. ru
Бондарцова Ксения Владимировна
магистрант направления «Экология и биотехнология» естественнонаучного факультета
ФГБОУ ВО «Пермский государственный гуманитарно-педагогический
университет», Пермь, Россия 614990, г. Пермь, ул. Пушкина, 42, тел. (342) 2151952, доб. 485 e-mail: [email protected]
Лаврская Екатерина Андреевна
ассистент кафедры биологии и географии
ФГБОУ ВО «Пермский государственный гуманитарно-педагогический
университет» 614990, г. Пермь, ул. Сибирская, 24, тел. (342) 23863455 аспирант 2-го курса биологического факультета ФГАОУ ВО «Пермский государственный национальный исследовательский
университет», Пермь, Россия 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15 e-mail: [email protected]
ВЛИЯНИЕ ВНЕШНИХ ФАКТОРОВ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ ХИМИЧЕСКОЙ ТРАНСФОРМАЦИИ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI НА
ПРИМЕРЕ ШТАММА XL1-blue Aleksei Y. Lavrskii
Candidate of Biological Sciences, Docent of Chair of Biology and Geography
Perm State Humanitarian Pedagogical University 42, Pushkina, 614990, Perm, Russia e-mail: [email protected]
© Лаврский А.Ю., Бондарцова К.В., Лаврская Е.А., 2023
Ksenia V. Bondartsova
Master of Pedagogical Direction 'Ecology and Biotechnology'
Perm State Humanitarian Pedagogical University 42, Pushkina, 614990, Perm, Russia e-mail: [email protected]
Ekaterina A. Lavrskaia
Assistant of the Department of Biology and Geography
Perm State Humanitarian Pedagogical University 42, Pushkina, 614990, Perm, Russia 2st year postgraduate student of the Faculty of Biology Perm State National Research University 15, Bukireva, 614990, Perm, Russia e-mail: [email protected]
THE EFFECT OF EXTERNAL FACTORS ON THE EFFECTIVENESS OF CHEMICAL TRANSFORMATION OF ESCHERICHIA COLI CELLS
EXAMPLE XL1- BLUE STRAIN
Аннотация. Приводятся результаты исследования влияния низких температур при подготовке, времени хранения, а также состава буфера на эффективность химической трансформации клеток Escherichia coli плазмидными векторами.
Ключевые слова: компетентные клетки, низкие температуры, химическая трансформация, плазмидные векторы, Escherichia coli.
Abstract. The article presents the results of the study of the effect of low temperatures during preparation, storage time, and buffer composition on the efficiency of chemical transformation of Escherichia coli cells by plasmid vectors.
Key words: competent cells, low temperatures, chemical transformation, plasmid vectors, Escherichia coli.
Современная биотехнологическая промышленность немыслима без «микробных» технологий. Существуют сотни биотехнологических штаммов, обладающих самыми разными характеристиками, позволяющих синтезировать различное сырье и являющихся модельными системами для изучения различных процессов [2; 3; 4].
В качестве основных модельных микроорганизмов используются кишечная палочка (Escherichia coli), сенная палочка (Bacillus subtilis) и множество штаммов молочнокислых и других бактерий [1; 2; 3; 5].
Распространены две основные группы методов трансформации, применяемых для прокариот: электропорация и химическая трансформация.
Наиболее простым и технологичным является процесс химической трансформации, поскольку модификация не предполагает другого носителя кроме молекул ДНК (обычно плазмидного вектора) и нет дополнительных промежуточных этапов. Кроме того, данная методика не требует дорогостоящего оборудования (электропораторы и расходные материалы к ним) и довольно доступна. Недостатком является относительно невысокая эффективность, но она компенсируется большим числом бактериальных клеток в трансформируемой культуре.
Ключевым сырьем для химической трансформации бактерий являются так называемые компетентные клетки (КК) [1; 8; 9]. Состояние компетентности к трансформации - сложное комплексное состояние, обычно сопряженное с изменением внешних условий, при котором запускаются специфические гены, синтезируются определенные вещества, а также изменяется структура мембраны и клеточной стенки.
Изучение факторов, влияющих на образование КК, может быть перспективно, так как оно должно способствовать повышению эффективности трансформации и экономии времени и генетических элементов при молекулярном клонировании с использованием бактериальных культур.
Целью нашей работы было выявление условий, обеспечивающих наибольшую эффективность химической трансформации клеток Escherichia coli штамма XL1-blue на различных этапах подготовки.
Задачи:
1. Проанализировать эффективность получения КК Escherichia coli для химической трансформации стандартным и модифицированными низкотемпературными методами, стимулирующими тепловой шок; выявить условия с наибольшим выходом трансформантов.
2. Оценить влияние компонентов солевого буфера на эффективность трансформации.
3. Оценить влияние таких факторов, как время хранения КК и тип плазмиды, на выход трансформантов.
Химические факторы компетентности представляют собой продукты экспрессии определенных генов. Клеточная стенка в этом состоянии имеет повреждения, а мембрана может иметь инвагинации и поры. В естественных условиях возникновение большого количества КК маловероятно, поэтому состояние индуцируют специальными методами.
В литературе описано несколько классических методик получения КК (обычно для Escherichia coli, но есть сведения и о других бактериях, в т. ч. грамположительных, например Bacillus subtilis) [1; 5; 7; 8; 9].
Обычно это обеспечивается несколькими факторами: 1) молодой (ночной) культурой; 2) накоплением химических факторов компетентности в клетках и культуральной среде; 3) специальным солевым буфером; 4) температурным шоком клеток, который приводит к изменениям в структурах клеточной стенки и мембраны.
После индукции КК их обычно трансформируют сразу или замораживают, в т. ч. в жидком азоте, и хранят при отрицательных температурах: от -24 до -70 °С.
Каждое оттаивание и последующая заморозка снижает компетентность ориентировочно в два раза, поэтому целесообразно аликвотирование КК на маленькие порции по нескольку микролитров [1].
В настоящее время КК доступны для заказа у многих поставщиков, и некоторые лаборатории предпочитают заказывать готовые. Минус такого подхода - в относительной дороговизне продукции, а также в сложности поддержания условий хранения КК при доставке (нужны низкие температуры, менее -20 °С). По этим причинам удобно готовить КК в целевой лаборатории, а затем их сразу замораживать и хранить до востребования.
Классические методики могут несколько отличаться, поэтому целесообразно установить влияние тех или иных этапов подготовки КК на эффективность их последующей трансформации.
В общих чертах последовательность приготовления КК выглядит следующим образом [1; 6; 7; 8; 9]:
1. Получение молодой, плотной «ночной» культуры целевых клеток (E. coli) и выращивание ее в суспензии до требуемой плотности.
2. Охлаждение и осаждение суспензии клеток при 0 °С.
3. Полное осаждение биомассы бактерий и удаление супернатанта.
4. Ресуспендирование в специальном солевом буфере и охлаждение при 0 °С 10-15 мин.
5. Внесение криопротектора, обычно ДМСО (диметилсульфоксид).
6. Трансформация или замораживание при низких температурах (от -20 до -70 °С) для дальнейшего использования.
Приготовление КК
В качестве основного модельного штамма Escherichia coli использовался штамм XL1-blue (Evrogen) генотип: recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1lac [F'proAB lacIqZAM15 Tn10 (Tetr)].
Приготовление КК осуществлялось из ночной культуры, доращиваемой в суспензии на среде SOB до плотности OD = 0,6 ±0,03.
Для инкубации культур использовались термошейкер ST-3 и суховоздушный термостат.
Плотность пробы культуры замерялась на спектрофотометре КФК-3, после чего доводилась до требуемого значения стерильной средой. При этом вычислялась поправка на объем, и аналогичная манипуляция производилась со всей культурой. Проба, на которой производился замер, далее в работе не использовалась и инактивировалась.
Культура бактерий центрифугировалась при температуре +4 °С 3000RPM в пробирках объемом 5 мл.
Общий ход реализованной в работе методики подготовки КК E.coli представлен в табл. 1.
При приготовлении КК использовались два варианта солевого буфера: на основе TB с трис-боратным буфером и TB с буфером HEPES.
Таблица 1
Общая методика приготовления КК на основе классических методов с модификациями авторов [1; 6; 7; 9]
№ Производимые операции
Выращивание ночной культуры бактерий на агаризованной среде при 37 °С в термостате
1. Ресуспендирование колоний E.coli (3-4 шт.) диаметром 2-3 мм в стерильных полипропиленовых пробирках с крышкой объемом 50 мл, содержащих по 10 мл среды SOB
2. Выращивание при интенсивном встряхивании в орбитальном термошейкере при скорости вращения 250 об/мин и температуре 37 °С в течение 12 ч
3. Подгонка до оптической плотности суспензии OD600 = 0,6 стерильной средой на основе пробного замера
4. Инкубация суспензии при 0 °C в течение 12 мин
5. Центрифугирование 10 мин, 3000 об/мин при +4 °C, удаление супернатанта
6. Ресуспендирование в буфере TB, инкубация при 0 °C 12 мин
7. Повторное ресуспендирование и осаждение в буфере TB в течение 10 мин, удаление супернатанта
8. Ресуспендирование клеточного осадка в 1/8 исходного объема буфера TB
9. Внесение до 1/3 объема 3,5 % раствора ДМСО (криопротектор)
10. Инкубация при 0 °C в течение 12 мин
11. Ресуспендирование клеток в остатках жидкости
12. Аликвотирование (стерильные охлажденные пробирки типа «эппендорф» объемом 500 мкл)
13. Использование для трансформации или заморозка в жидком азоте с последующим хранением при -25 ± 1 °C
Следует отметить, что первый вариант является «экстремальным», поскольку трис(гидроксиметил)аминометан (Tris, THAM) довольно токсичен для живых клеток, в то время как HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота) является типичным компонентом сред для культуральных работ. Несмотря на этот недостаток, ТРИС, как правило, более доступен и способен стабилизировать показатели pH, близкие к требуемым.
Изменения затронули 11-й пункт общего хода подготовки КК, описанного в табл. 1: вместо инкубации при 0 °C использовалась заморозка в жидком азоте.
Варианты температурной обработки и буферов при индукции представлены в табл. 2.
Таблица 2
Варианты условий получения КК холодовым (низкотемпературным) методом
№ (тип) КК Солевой буфер для приготовления КК Инкубация при 0 °С после внесения ДМСО, мин Заморозка в жидком азоте после внесения ДМСО, Заморозка в жидком азоте перед хранением, мин Хранение в холодильнике при -24 °С, ч
мин
1 Модифицир. ТВ + Трис-боратный 10 - 2 24
2 Модифицир. ТВ + Трис-боратный 3 - 2 24
3 Модифицир. ТВ + Трис-боратный - 10 2 24
4 Модифицир. ТВ + Трис-боратный 10 - 0 24
5 Стандартный ТВ + HEPES 10 - 2 0
6 Стандартный ТВ + HEPES - 10 2 0
7 Стандартный ТВ + HEPES 10 - 2 168
8 Стандартный ТВ + HEPES - 10 2 168
Для трансформации использовались два вида плазмидных векторов компании Evrogen, содержащих гены turboRFP и turboGFP, а также, в качестве селективного маркера, ген устойчивости к ампициллину.
Кроме готовых и очищенных векторов в работе применялись те же плазмиды, несущие гены AFP, полученные из культуры трансформантов того же штамма E.coli в нашей лаборатории.
Плазмидная ДНК выделялась с помощью набора Plasmid miniprep производства компании Evrogen.
Для осаждения на спин-колонках использовались центрифуга-миксер Elmi CM-50M (до 15000 rpm) и вортекс Elmi V-3.
Концентрация очищенной ДНК определялась на УФ-спектрофотометре «Ломо-СФ102».
Трансформация осуществлялась в пробирках типа «эппендорф» объемом 500 мкл.
На одну трансформацию использовалось 10 мкл суспензии компетентных клеток и 2 мкл раствора плазмидного вектора концентрацией 5 нг/мл [1].
После необходимых манипуляций суспензии трансформантов разбавлялись до 50 мкл средой SOB и высевались на содержащий 200 мг/л селектирующего антибиотика общий ГРМ-агар производства г. Оболенска в чашки Петри. Посев на поверхность агара производился «сплошным газоном» с помощью стеклянных шпателей Дригальского.
Инкубация трансформантов осуществлялась в термостате при температуре 37 °С в течение 48 ч. Для появления колоний достаточно и 20-24 ч, но требуется время для синтеза и созревания AFP, чтобы колонии трансформантов хорошо отличались от нетрансформантов визуально.
Опыты с КК, полученными в ходе данной работы, имели двойную повторность.
При небольшом их количестве подсчет производился вручную, при значительном - чашки Петри сканировались в планшетном сканере и подсчет осуществлялся с помощью свободно распространяемого программного обеспечения ImageJ.
Дополнительная низкотемпературная стимуляция в процессе трансформации, вероятно, также влияет на адсорбцию ДНК на поверхность клеток и структуру пор в клеточных стенках и мембране. Исходя из этого предположения, в ходе трансформации мы применяли также вместо холодового шока заморозку в жидком азоте при 0 °С согласно классическим методам, что отражено в табл. 2.
После инкубации экспрессию рекомбинантного гена или ее отсутствие можно констатировать визуально при освещении УФ-лучами как в суспензиях, так и в колониях на агаре, поэтому подсчет модификантов легко реализуем.
Результаты экспрессии рекомбинантных белков в клетках трансформантов довольно заметны и поддаются визуальному учету как в суспензиях, так и в колониях на агаризованной среде (рис. 1).
■Г
I
turbo GFP
turbo RFP
V
Е. coli XLl-blue без AFP
. ¿X
"У
а
б
Рис. 1. Флуоресценция суспензий трансформантов E.coli (а); колонии трансформантов, экспрессирующих ОБР (обозначены стрелками), и нетрансформантов на агаризованной селективной среде (б) при освещении УФ-лучами
В качестве референсной трансформации (положительный контроль) использовались готовые КК E. coli штамма XL1-blue, поставляемые компанией Evrogen, и стоковый вектор, описанный выше.
По сути, все эти измерения можно рассматривать как повторности одного опыта, поскольку векторы, несущие GFP и RFP, очень похожи по своей генетической структуре и имеют одинаковые сроки изготовления и концентрацию.
Можно отметить, что эффективность трансформации в целом типична и невысока, что, вероятно, можно связать с длительностью хранения (1-2 месяца) и особенностями транспортировки клеток и вектора, которые, впрочем, соответствовали требованиям (материалы транспортируются при глубоких отрицательных температурах на сухом льду) (табл. 3).
Таблица 3
Эффективность трансформации стоковых КК готовыми векторами
компании Evrogen
№ Вариант трансформации N - эффективность трансформации , КОЕ*ЮА6/мкг Ncp - средняя эффективность трансформации , КОЕ*10А6/мкг
1 Стоковые компетентные клетки Evrogen + вектор GFP 4 2,75
2 Стоковые компетентные клетки Evrogen + вектор GFP 1,5
3 Стоковые компетентные клетки Evrogen + вектор GFP 1
4 Стоковые компетентные клетки Evrogen + вектор GFP 4,5
5 Стоковые компетентные клетки Evrogen + вектор RFP 1,5 2,5
6 Стоковые компетентные клетки Evrogen + вектор RFP 4
7 Стоковые компетентные клетки Evrogen + вектор RFP 2
Полученные данные вполне согласуются с типичной эффективностью трансформации, описанной во многих источниках [1; 6; 7; 8].
Результаты трансформации КК, изготовленных по модифицированному холодовому методу, приведены в табл. 4. В ходе работы были получены некоторые интересные данные, свидетельствующие в пользу того, что заморозка в жидком азоте после внесения криопротектора положительно влияет на качество КК. Все значения N - эффективности трансформации для удобства сравнения приведены к единой размерности: КОЕ*ЮА6/мкг. Жирным шрифтом в таблице выделены результаты измерения проб, в большей степени отличающихся от других вариантов опыта.
Так, пробы 4 и 5 на основе КК 3-го типа демонстрируют наибольший выход трансформантов из всех КК, приготовленных с использованием трис-боратного буфера: N = 12,5 и 14 КОЕ*ЮА6/мкг. Эти значения попадают в диапазон 10-50 КОЕ*10А6/мкг, заявленных для стоковых КК, но в данной серии опыта превышают их показатели (положительный контроль) более чем в 4 раза.
Вероятно, имеют значение и процессы при заморозке и оттаивании клеточной суспензии, а также время пребывания культуры в замороженном состоянии, хотя в последнем случае можно предположить, что относительно крупные биологические молекулы практически неподвижны и влияют другие процессы, например, фазовых переходов воды. Так, аналогичные пробы 6 и 7 на основе КК 4-го типа отличаются от предыдущих тем, что при индукции компетентности они вообще не подвергались воздействию температуры жидкого азота, в результате они вообще не демонстрируют трансформантов, несущих AFP.
Таблица 4
Эффективность трансформации клеток E. coli штамма XL1-blue с компетентностью, индуцированной холодовым методом с модификациями
№ Тип КК Буфер подготовки КК Вариант трансформации Транс-форманты (ср) Нетранс-форманты (ср) Хранение при -25 ±1°C, ч N - эффективность трансформации КОЕ*ЮА6/мкг
Модиф. ТВ + По стандартной методике, с
1 1 трис-боратный выделенной плазмидой (RFP) 4 11 24 4,5
Модиф. ТВ + По стандартной методике, с
2 2 трис-боратный выделенной плазмидой (GFP) 0 1 24 0,0
Модиф. ТВ + По стандартной методике, с
3 2 трис-боратный выделенной плазмидой (RFP) 0 0 24 0,0
Модиф. ТВ По стандартной методике,
4 3 + трис-боратный с выделенной плазмидой (GFP) 12,5 2 24 12,5
Модиф. ТВ По стандартной методике,
5 3 + трис-боратный с выделенной плазмидой (RFP) 14,0 0 24 14,0
Модиф. ТВ + По стандартной методике, с
6 4 трис-боратный выделенной плазмидой (GFP) 0 3 24 0,0
Модиф. ТВ + По стандартной методике, с
7 4 трис-боратный выделенной плазмидой (RFP) 0 3 24 0,0
8 1 Модиф. ТВ + трис-боратный С заморозкой в жидком азоте вместо инкубации при 0°С и выделенной плазмидой (GFP) 3 10 24 2,5
№ Тип КК Буфер подготовки КК Вариант трансформации Транс-форманты (ср) Нетранс-форманты (ср) Хранение при -25 ±1°С, ч N - эффективность трансформации КОЕ*ЮА6/мкг
9 1 Модиф. ТВ + трис-боратный С заморозкой в жидком азоте вместо инкубации при 0°С и выделенной плазмидой (Я^Р) 0 0 24 0,0
10 1 Модиф. ТВ + трис-боратный Со стоковым вектором GFP Еуго§еи 7 35 24 8,5
11 1 Модиф. ТВ + трис-боратный С заморозкой в жидком азоте вместо инкубации при 0°С и стоковым вектором ОБР Evrogen 8 24 24 8,0
12 1 Модиф. ТВ + трис-боратный С заморозкой в жидком азоте вместо инкубации при 0°С и стоковым вектором ОБР Evrogen 7 15 24 7,0
13 5 Станд. ТВ + HEPES По станд. методике со стоковым вектором КРР Evrogen 1747,5 0 0 1747,5
14 6 Станд. ТВ + HEPES По станд. методике со стоковым вектором GFP Evrogen 1550,0 0 0 1550,0
15 7 Станд. ТВ + HEPES По станд. методике со стоковым вектором КРР Evrogen 43 59 168 43,0
16 8 Станд. ТВ + HEPES По станд. методике со стоковым вектором GFP Evrogen 9,5 21 168 9,5
17 7 Станд. ТВ + ИЕРЕБ Отрицательный контроль роста КК -нетрансформантов 0 0 0 0,0
Пробы 11 и 12 демонстрируют повышенный выход модификантов по сравнению с аналогичными по буферу 1, 2 и 3 и похожий уровень с пробой 10, которая отличается только дополнительной заморозкой при трансформации. По данным пробам нельзя сделать однозначного заключения, т. к. выборки на данном этапе исследований не позволяют с высокой точностью оценить зависимость математически. Можно предположить, что буфер для хранения стокового вектора, а также степень его очистки способствуют повышенному выходу модификантов.
Самые значительные отличия по эффективности трансформации демонстрируют пробы 13 и 14. Проба 13 превосходит по эффективности референсную трансформацию (положительный контроль) более чем в 660 раз и аналогичную пробу 15 более чем в 40 раз. В то же время проба 14 превосходит аналогичную по условиям пробу 16 более чем в 160 раз и положительный контроль более чем в 580 раз. Отличия хорошо заметны и визуально, по числу
колоний модификантов на селективной среде, пример сканов чашек Петри можно оценить ниже (рис. 2).
а б
Рис. 2. Колонии трансформантов E. coli на агаризованной среде, полученные при использовании КК сразу после приготовления (а) и после хранения в течение недели (б)
Эти пары проб являются, по сути, дублирующими: 13-я и 14-я проба - это те же КК, что и в 15-й и 16-й пробе, но использованные непосредственно после приготовления, тогда как 15-я и 16-я пробы - после недельного хранения при -25 ±1 °С.
В результате свежие компетентные клетки в буфере, содержащем ТРИС, по эффективности трансформации превосходят недельные в среднем в 62 раза.
Можно заметить, что использование в составе буфера HEPES благоприятно влияет на эффективность трансформации, кроме того, уже через неделю после заморозки в жидком азоте и при последующем хранении клетки значительно снижают свою компетентность.
Почти все полученные КК дают некоторое количество неполных модификантов, несущих только ген резистентности к селектирующему фактору, но в их клетках по какой-то причине не экспрессируется ген AFP или белок не приобретает функциональность.
Данное исследование, вероятно, следует позиционировать как обзорное, позволяющее оценить перспективные направления в изучении темы. Дальнейшее накопление данных должно позволить оптимизировать условия трансформации и подготовки КК.
На основании полученных результатов можно сделать предварительные выводы:
1. Низкотемпературные методы позволяют эффективно получать КК Escherichia coli для дальнейшей трансформации плазмидами. Высокий положительный эффект был, в большинстве случаев, зафиксирован при замене инкубации на льду во время подготовки КК на заморозку в жидком азоте.
2. Компоненты солевого буфера для подготовки КК также влияют на состояние компетентности бактерий: большее количество трансформантов
было получено при использовании буфера, содержащего HEPES, по сравнению с ТРИС, такие клетки при аналогичных прочих условиях в среднем в 176 раз трансформируются эффективнее. Можно также предположить, что состав буфера и низкотемпературная обработка влияют комплексно.
3. Время хранения готовых КК при -25 ± 1 °С даже после заморозки в жидком азоте негативно сказывается на их способности к трансформации. За неделю этот показатель снизился ориентировочно в 40 раз при трансформации вектором, содержащим RFP, и в 163,1 раза - вектором с GFP.
Несмотря на схожесть генетического строения и одинаковую концентрацию, вектор turboRFP-b демонстрирует большую эффективность трансформации по сравнению с turboGFP-b. Это справедливо как для стокового вектора, так и для выделенной из бактериальной культуры плазмиды.
Список литературы
1. Великов В.А. Молекулярная биология. Практическое руководство : учеб. пособие для студ. биол. фак. и фак. нано- и биомед. технол., обуч-ся по напр. «Биология (020400)», «Биология-пед (050100)», «Биотехнические системы и технологии (200100)», «Медицинская физика (011200)» и по спец. «Биоинженерия и биоинформатика (020501)». - Саратов : Саратовский источник, 2013.
2. Иванова К.А., Шаньшин Д.В., Щербаков Д.Н. Конструирование фагмидного вектора для дисплея фрагментов антител человека // Journal of Siberian Medical Sciences. - 2014. - № 3 [Электронный ресурс]. - URL: https://cyberleninka.ru/article/n/konstruirovanie-fagmidnogo-vektora-dlya-displeya-fragmentov-antitel-cheloveka (дата обращения: 08.12.2022).
3. Крякунова Е.В., Хамидуллина Р.Г., Барабанщиков Б.И., Гимадутдинов О.А. Референс-плазмида для определения копийности плазмид, содержащих bla-ген // Учен. зап. Казан. ун-та. Сер.: Естеств. науки. - 2010. - № 1. - C. 127135 [Электронный ресурс]. - URL: https://cyberleninka.ru/article/n/referens-plazmida-dlya-opredeleniya-kopiynosti-plazmid-soderzhaschih-bla-gen (дата обращения: 12.03.2023)..
4. Набережнов Д.С. Молекулярное клонирование ДНК с использованием плазмид, содержащих ген устойчивости к канамицину // Международный журнал гуманитарных и естественных наук. - 2022. - № 11-1. - C. 20-24.
5. Bron S. Plasmids / S. Bron; ed. Harwood C.R. Chichester // Molecular Biological Methods for Bacillus: John Wiley and Sons Ltd. - 1990. - P. 75-175.
6. Chung C.T. One step preparation of competent Escherichia coli: transformation and storage of bacterial cells in the same solution / C.T. Chung, S.L. Niemala, R.H. Miller // Proc. Natl. Acad.Scie. USA. - 1989. - V. 86. - P. 2172-2175.
7. Inoue H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids / H. Inoue, H. Nojima, H. Okayama // 1990, Gene, - V. 96, Issue 1. - P. 23-28, ISSN 0378-1119.
8. Janjua S. High efficiency DNA transformation protocol for Escherichia coli using combination of physico-chemical methods / S. Janjua, S.Younis, F. Deeba, S.M.S. Naqvi // International Journal of Agriculture and Biology. - 2014. - V16. -P. 132-138.
9. Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual / T. Maniatis, E.F. Fritsch, J. Sambrook // N. Y. : Cold Spring Harbor Laboratory, 1982. - 555 p.
