ВЛИЯНИЕ ВАСКУЛЯРНОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА НА ЯИЧНИК В МОДЕЛИ РАДИАЦИОННОИНДУЦИРОВАННОЙ ОВАРИАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

2023, т. 13, № 4

крымский журнал экспериментальной и клинической медицины

УДК 618.11-008.6 DOI: 10.29039/2224-6444-2023-13-4-22-26

ВЛИЯНИЕ ВАСКУЛЯРНОГО ЭНДОТЕЛИАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА НА ЯИЧНИК В МОДЕЛИ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОЙ ОВАРИАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

Демяшкин Г. А.1,2, Муртазалиева З. М.2, Пугачева Е. Н.2, Вадюхин М. А.2, Ингель И. Э.1, Михина Л. Н.1, Фомина Н. К.1

'ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр радиологии» Минздрава России, 249036, ул. Королева, 4, Обнинск, Россия

2ФГАОУ ВО Первый Московский государственный медицинский университет им. И. М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), 119048, ул. Трубецкая, 8 стр.2, Москва, Россия.

Для корреспонденции: Демяшкин Григорий Александрович, д.м.н., заведующий лабораторией гистологии и иммуногистохимии ИТМиБ Первого МГМУ им. И. М. Сеченова (Сеченовский Университет); e-mail: dr.dga@ mail.ru

For correspondence: Grigory Demyashkin, МD, Head of Department of Hystology, Sechenov University, e-mail: [email protected]

Information about authors:

Demyashkin G. A., https://orcid.org/0000-0001-8447-2600 Murtazalieva Z. M., https://orcid.org/0009-0000-2361-7618 Pugacheva E. N., https://orcid.org/0009-0009-2268-3838 Vadyukhin M. A., https://orcid.org/0000-0002-6235-1020 Ingel I. E., https://orcid.org/0000-0002-6776-1176 Mikhina L. N., https://orcid.org/0000-0001-7600-7901 Fomina N. K., https://orcid.org/0000-0002-1499-1349

РЕЗЮМЕ

Плазма, обогащенная тромбоцитами, является регенеративным субстратом при повреждении структур яичника за счет входящих в ее состав биологически активных молекул. Ее предлучевое применение потенциально может снизить диапазон и глубину радиационно-индуцированного повреждения яичника. Цель исследования: иммуногистохимическая оценка роли васкулярного эндотелиального фактора роста на структуры яичника в модели радиационно-индуцированной овариальной недостаточности. Материал и методы. Фрагменты яичников четырех групп (I - Контроль (n=10), II - фракционное облучение электронами в суммарной дозе 20 Гр (n=10), III - фракционное облучение электронами в суммарной дозе 20 Гр + плазма, обогащенная тромбоцитами (n=10), IV - плазма, обогащенная тромбоцитами (n=10)) были изучены иммуногистохимическим методом с антителами к VEGF. Результаты. Фракционное облучение электронами привело к уменьшению доли VEGF-позитивных фолликулярных клеток, а предлучевое введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, демонстрировало сохранение более высоких значений экспрессии исследуемого фактора роста. Обсуждение. Выявленный в настоящем исследовании иммуногистохимический паттерн, вероятно, связан с индукцией ангиогенеза и метаболизма структур яичника факторами роста в составе плазмы, обогащенной тромбоцитами. Ее предлучевое введение способствовало снижению глубины и диапазона радиационно-индуцированной овариальной недостаточности. Заключение. Предлучевое введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, привело к активации неоангиогенеза и усилению репаративных процессов в яичнике после воздействия фракционного локального облучения электронами в суммарной дозе 20 Гр.

Ключевые слова: овофолликулогенез, электроны, васкулярный эндотелиальный фактор роста, ангиогенез, иммуногистохимия

INFLUENCE OF VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR ON THE OVARY IN A MODEL OF RADIATION-INDUCED OVARIAL INSUFFICIENCY

Demyashkin G. A.12, Murtazalieva Z. M.2, Pugacheva E. N.2, Vadyukhin M. A.2, Ingel I. E.1, Mikhina L. N.1, Fomina N. K.1

1National Medical Research Center for Radiology, Obninsk, Russia 2Sechenov University, Moscow, Russia

SUMMARY

Plasma enriched with platelets is a regenerative substrate for damage to ovarian structures due to the biologically active molecules it contains. Its pre-irradiation application has the potential to reduce the range and depth of radiation-induced ovarian damage. Aim of the study: immunohistochemical assessment of the role of vascular endothelial growth factor on ovarian structures in a model of radiation-induced ovarian failure. Material and methods. Fragments of ovaries of four groups (I - Control (n=10), II - fractional irradiation with electrons in a total dose of 20 Gy (n=10), III - fractional irradiation with electrons in a total dose of 20 Gy + platelet-rich plasma (n=10), IV - platelet-rich plasma

(n=10)) were studied by immunohistochemical method with antibodies to VEGF. Results. Fractional electron irradiation led to a decrease in the proportion of VEGF-positive follicular cells, and pre-irradiation administration of platelet-rich plasma demonstrated the maintenance of higher expression values of the studied growth factor. Discussion. The immunohistochemical pattern identified in the present study is likely associated with the induction of angiogenesis and metabolism of ovarian structures by growth factors in platelet-rich plasma. Its pre-radiation administration contributed to a decrease in the depth and range of radiation-induced ovarian failure. Conclusion. Pre-irradiation administration of platelet-rich plasma led to the activation of neoangiogenesis and enhanced reparative processes in the ovary after exposure to fractional local electron irradiation with a total dose of 20 Gy.

Key words: ovofolliculogenesis, electrons, vascular endothelial growth factor, angiogenesis, immunohistochemistry

Ионизирующее излучение часто применяют при облучении злокачественных новообразований органов малого таза, причем существует риск поражения соседних органов, в том числе - ради-ационно-индуцированное повреждение яичников [1]. Токсическое воздействие облучения приводит к апоптозу фолликулярных клеток с нарушением овофолликулогенеза и развитием овариальной недостаточности [2].

Одним из ключевых регуляторов физиологического овофолликулогенеза является васкуляр-ный эндотелиальный фактор роста (VEGF), который синтезируется многими типами клеток, в том числе - тромбоцитами [3]. Его роль заключается в обеспечении метаболизма клеток яичников [4]. Механизмы действия VEGF в тканях заключаются в модуляции широкого спектра процессов, таких как: неоангиогенез, митоз и миграция клеток, формирование и функционирование гемато-овариального барьера, фенестрация эндотелия, хемотаксис макрофагов и гранулоцитов, вазоди-латация (индукция синтеза оксида азота) и др [5]. На основании перечисленных положительных эффектов VEGF и многих других факторов роста (IGF-1, TGF-P, PDGF и др.) в составе плазмы, обогащенной тромбоцитами (РЯР), ее применение для защиты от токсических эффектов электронотерапии остается малоизученным. Ее предлучевое применение потенциально может снизить диапазон и глубину радиационно-инду-цированного повреждения яичника.

Цель исследования: оценка роли васкулярно-го эндотелиального фактора роста в структурах яичника в модели радиационно-индуцированной овариальной недостаточности.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Животные - крысы породы Вистар (Яайш Wistar; п=40) были поделены на четыре группы:

I группа (п=10) - контрольная;

II группа (п=10) - фракционное локальное облучение электронами в суммарной «очаговой» дозе (СОД) 20 Гр;

III группа (п=10) - интраперитонеальное введение бедной лейкоцитами плазмы, обогащенной тромбоцитами ^Р-РЯР), за 1 час до локального облучения электронами в СОД 20 Гр;

IV группа (n=10) - интраперитонеальное введение LP-PRP.

Животных всех групп выводили из эксперимента путем введения высоких доз анестетика на 7 сутки эксперимента (датой начала эксперимента считали последний день облучения). Все манипуляции выполняли согласно «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (ЕЭС, Страсбург, 1985) и Хельсин-ской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

Морфологическое исследование. После извлечения оценивали внешний вид яичников и состояние паренхимы на разрезе, взвешивали (в граммах) и измеряли. Затем нарезали параллельно сагиттальной плоскости каждые 2 мм, фиксировали в формалине, после проводки (аппарат гистологической проводки тканей, «Leica Biosystems», Германия) заливали в парафиновые блоки, из которых готовили серийные срезы (толщиной 3 мкм), депарафинировали, дегидратировали и окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования.

Морфологический анализ проводили в 10-ти случайно выбранных полях зрения микроскопа при увеличении ><400 в 5-ти рандомных срезах с каждого образца. Цифровые изображения гистологических срезов (отсканированные препараты) для морфометрических исследований получали с помощью системы видео-микроскопии (микроскоп Leica DM3000, Германия; камера DFC450 C; компьютер Platrun LG) и программного обеспечения для обработки и анализа изображений Leica Application Suite (LAS) Version 4.9.0.

Иммуногистохимическое (ИГХ) исследование. В качестве первичных использовали кроличьи поликлональные антитела к VEGF-A (Millipore; клон ABS82; 1:100). Вторичные - универсальные антитела (HiDef Detection™ HRP Polymer system, «Cell Marque», США). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Подсчёт клеток проводили в 10 случайно отобранных полях зрения при увеличении ><400 (в %).

Статистический анализ. Полученные в результате подсчёта данные обрабатывали с использованием компьютерной программы SPSS

крымскии журнал экспериментальном и клиническои медицины

2023, т. 13, № 4

12 for Windows statistical software package (IBM Analytics, США). Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка. Сравнения проводились с использованием дисперсионного анализа. Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ

При гистологическом исследовании яичников контрольной группы наблюдали нормальную ги-стоархитектонику. Воздействие локального облучения электронами в СОД 20 Гр привело к снижению количества примордиальных фолликулов и увеличению числа атретических фолликулов, пикнозу и фрагментации клеток гранулезной оболочки, кровоизлияниям в строме и увеличению объема соединительной ткани. В текальной оболочке обнаружены признаки гиперплазии текаци-тов (эндокринных клеток). Введение облученным животным плазмы, обогащенной тромбоцитами, снижало степень пострадиационного поражения яичников, способствуя частичному сохранению численности примордиальных фолликулов и снижению степени пикноза и фрагментации клеток гранулезной оболочки, а также разрастания соединительной ткани. Кроме того, отмечали визуальное увеличение плотности кровеносных сосудов мелкого и среднего калибров в поле зрения светового микроскопа. В IV-ой группе различий по сравнению с контролем не выявили.

По результатам иммуногистохимического исследования с антителами к VEGF-А на 7 сут-

ки после облучения выявили уменьшение доли ИГХ-позитивных гранулезных клеток (в 1,9 раза) по сравнению с контрольной группой. В желтом теле наблюдали иммуномечение некоторых люте-оцитов, количество которых было ниже по сравнению с контрольной группой в 1,2 раза. В то же время, количество VEGF-позитивных эндотели-оцитов повысилось, что связано с увеличением числа кровеносных сосудов мелкого и среднего калибров на единицу площади (неоваскулоге-нез). Доля интенсивно окрашенных VEGF-А-позитивных текацитов, напротив, увеличилась в 3,0 раза по сравнению с контролем.

Предлучевое введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, привело к интенсификации VEGF-А-иммуномечения: в Ш-ей группе наблюдали повышенное количество иммунопо-зитивных гранулезных клеток, превышающих значения П-ой группы в 1,4 раза. В желтом теле количество VEGF-А-позитивных лютеоцитов и эндотелиоцитов было приближено к контрольным значениям. В текальной оболочке яичника - интенсивное иммуномечение эндокриноцитов, доля которых, тем не менее, была снижена в 1,5 раза по сравнению с группой облученных животных.

В яичниках ГУ-ой группы отмечали увеличение доли иммунопозитивных гранулезных клеток и текацитов в 1,1 раза и в 1,15 раза по сравнению с контрольной группой. В желтом теле экспрессия VEGF-А достоверно не отличалась от контроля.

Таблица 1. Доля VEGF-позитивных клеток в яичниках контрольной и опытных групп, в %. Table 1. The proportion of VEGF-positive cells in the ovaries of the control and experimental groups, in%.

Группы ГК, % ЖТ, % ТК, %

Контроль 33,8±1,1 21,4±0,9 16,5±0,5

Облучение 18,1±0,8a 17,5±0,8a 49,6±2,1a

Облучение + LP-PRP 25,8±1,2b 19,7±0,7b 32,9±1,4b

LP-PRP 37,3±1,6c 22,1±1,0 19,2±0,7c

Примечание: ГК - гранулезные клетки, ЖТ - желтое тело, ТК - тека-клетки, LP-PRP - плазма, обогащенная тромбоцитами. Статистически достоверные различия: а - между контролем и группой облучения (II), b - между группой, которой после облучения вводили LP-PRP (III) и группой облучения (II), с - между группой LP-PRP (IV) и контролем.

Note: ГК - granulosa cells, ЖТ - corpus luteum, ТК - theca cells, LP-PRP - platelet-rich plasma. Statistically significant differences: a - between the control and the irradiation group (II), b - between the group that was administered LP-PRP after irradiation (III) and the irradiation group (II), c - between the LP-PRP group (IV) and the control.

ОБСУЖДЕНИЕ

Данное исследование посвящено оценке экспрессии васкулярного эндотелиального фактора роста в структурах яичника после воздействия фракционного локального облучения электрона-

ми в суммарной дозе 20 Гр и введения плазмы, обогащенной тромбоцитами.

В семействе васкулярного эндотелиального фактора роста принято выделять VEGF-A. VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, которые служат лигандами трансмембранных рецепто-

Контроль

Облучение

Облучение + LP-PRP LP-PRP

Рис. 1. Фрагменты яичников контрольной и опытных групп. Иммуногистохимические реакции с антителом к VEGF-A, докрашивание - гематоксилином, увелич.*400. Fig. 1. Fragments of ovaries of the control and experimental groups. Immunohistochemical reactions with antibody to VEGF-A, staining with hematoxylin, magnification x400.

ров VEGFR-1, -2, -3, экспрессируемых, среди прочего, гранулезными клетками яичников [6]. Биологическое действие VEGF наступает после его связывания с соответствующим рецептором в результате аутофосфорилирования и активации каскадов РВК/АКТ- и Ras/MAPK-путей [7]. Это приводит к индукции неоангиогенеза и увеличению плотности кровеносных сосудов в поле зрения, обнаруженному нами при микроскопическом исследовании, что связано с улучшением биохимических и метаболических процессов в фолликулах вследствие фенестрации эндотелия и увеличения проницаемости гемато-овариального барьера, способствуя поступлению других биологически активных молекул и регенеративных субстратов (в том числе РЯР) к фолликулярным клеткам [8; 9]. Иммуногистохимическое исследование подтвердило высокую экспрессию VEGF

в фолликулярных клетках и текацитах, что позволяет с высокой долей вероятности говорить об активации каскадов этого фактора роста и запуске всех перечисленных выше клеточных механизмов в структурах яичника.

Интенсивное иммуномечение текацитов также могло быть связано с гиперплазией этих клеток в ответ на радиационное воздействие. Это необходимо для замещения эндокринной функции поврежденных клеток яичника и поддержания физиологических уровней половых гормонов в плазме крови, что может быть расценено как компенсаторно-приспособительная реакция яичников в ответ на воздействие электронов [10].

Увеличение экспрессии VEGF эндотелия ге-мокапилляров желтого тела на единицу площади у облученных животных связано с усиленной ва-скуляризацией (неоваскулогенез), которая носи-

2023, т. 13, № 4

крымский журнал экспериментальной и клинической медицины

ла компенсаторно-приспособительный характер. Сохранение в желтом теле количества VEGF-позитивных клеток, близкого к контрольным значениям, обусловлено потенцированием введением дополнительных факторов ангиогенеза в составе плазмы, обогащенной тромбоцитами. Однако, VEGF практически не экспрессировался непосредственно в лютеоцитах, что, вероятно, объясняет низкие значения иммуномечения в желтом теле как полиморфной структуры яичника.

Так, в результате воздействия VEGF в яичниках происходит потенцирование позитивных эффектов факторов роста плазмы, обогащенной тромбоцитами, в том числе - регенеративных, которые необходимы для адекватного и быстрого восстановления ткани в ответ на воздействие фракционного облучения электронами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Предлучевое введение плазмы, обогащенной тромбоцитами, привело к активации неоангиоге-неза и усилению репаративных процессов в яичнике после воздействия фракционного локального облучения электронами в суммарной дозе 20 Гр.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest. The authors have no conflict of interests to declare.

ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES

1. Reiser E., Bazzano M. V., Solano M. E., Haybaeck J., Schatz C., Mangesius J., Ganswindt U., Toth B. Unlaid Eggs: Ovarian Damage after Low-Dose Radiation. Cells. 2022;11(7):1219. doi:10.3390/cells11071219.

2. Kimler B. F., Briley S. M., Johnson B. W., Armstrong A. G., Jasti S., Duncan F. E. Radiation-induced ovarian follicle loss occurs without overt stromal changes. Reproduction. 2018;155(6):553-562. doi:10.1530/REP-18-0089.

3. Guzmán A., Hernández-Coronado C. G., Gutiérrez C. G., Rosales-Torres A. M. The vascular endothelial growth factor (VEGF) system as a key

regulator of ovarian follicle angiogenesis and growth. Mol Reprod Dev. 2023;90(4):201-217. doi:10.1002/ mrd.23683.

4. Wang L., Ying Y. F., Ouyang Y. L., Wang J. F., Xu J. VEGF and bFGF increase survival of xenografted human ovarian tissue in an experimental rabbit model. J Assist Reprod Genet. 2013;30(10):1301-11. doi: 10.1007/s10815-013-0043-9.

5. Middleton K. K., Barro V., Muller B., Terada S., Fu F. H. Evaluation of the effects of platelet-rich plasma (PRP) therapy involved in the healing of sports-related soft tissue injuries. Iowa Orthop J. 2012;32:150-163.

6. Akiyama I., Yoshino O., Osuga Y., et al. Bone morphogenetic protein 7 increased vascular endothelial growth factor (VEGF)-a expression in human granulosa cells and VEGF receptor expression in endothelial cells. Reprod Sci. 2014;21(4):477-482. doi:10.1177/1933719113503411.

7. Pandey A. K., Singhi E. K., Arroyo J. P., et al. Mechanisms of VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) Inhibitor-Associated Hypertension and Vascular Disease. Hypertension. 2018;71(2):e1-e8. doi:10.1161/ HYPERTENSIONAHA.117.10271.

8. Martínez-Peña A.A., Petrik J.J., Hardy D.B., Holloway A.C. Delta-9-tetrahydrocannabinol increases vascular endothelial growth factor (VEGF) secretion through a cyclooxygenase-dependent mechanism in rat granulosa cells. Reprod Toxicol. 2022;111:59-67. doi:10.1016/j. reprotox.2022.05.004.

9. Zhang K., Han E.S., Dellinger T.H., et al. Cinnamon extract reduces VEGF expression via suppressing HIF-1a gene expression and inhibits tumor growth in mice. Mol Carcinog. 2017;56(2):436-446. doi:10.1002/mc.22506.

10. Tajima K., Orisaka M., Mori T., Kotsuji F. Ovarian theca cells in follicular function. Reprod Biomed Online. 2007;15(5):591-609. doi:10.1016/ s1472-6483(10)60392-6.