CC BY
93
УДК: 636.2; 591.392
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА РАЗВИТИЕ ЭМБРИОНОВ СВИНЕЙ IN VITRO*
Г.Н. СИНГИНА, кандидат биологических наук, зав. лабораторией
С.Г. ЕРМАКОВА, аспирант
А.В. ЛОПУХОВ, младший научный сотрудник
Н.А. ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор
ВИЖ Россельхозакадемии
Л. В. ГЕТМАНЦЕВА, научный сотрудник
Донской ГАУ
E-mail: [email protected]
Резюме. Технология экстракорпорального созревания ооци-тов и культивирования эмбрионов свиней широко востребована в сфере исследования механизмов раннего развития, а также в работах по трансплантации эмбрионов, клонированию и созданию трансгенных животных. Однако оптимальные условия получения этих клеток до конца не определены. В представленной работе изучено влияние концентрации кислорода в газовой атмосфере и кратности смены среды культивирования на развитие эмбрионов свиней in vitro. Для этого созревшие и искусственно активированные ооциты инкубировали, используя газовую атмосферу с высокой (5 % СО2 и 20 % О2) и низкой (5 % СО2 и 5 % О2) концентрацией кислорода. В обоих случаях замену эмбриональной среды проводили однократно (на третий день культивирования) или двукратно (на второй и четвертый дни). Наибольший выход бластоцист (25,4 %) наблюдали в случае инкубации искусственно активированных ооцитов в присутствии 5 % СО2 и 20 % О2 при условии двукратной смены эмбриональной среды. Культивирование партеногенетических эмбрионов свиней в газовой атмосфере, содержащей более низкую концентрацию кислорода (5 %), было менее результативным (21,3 % бластоцист). Однократная смена эмбриональной среды оказывала негативное влияние на развитие ооцитов до стадии бластоцисты. При этом отрицательный эффект был более выражен в группе, инкубируемой в присутствии 5 % СО2 и 20 % О2, в которой доля бластоцист снижалась на 12,7 % (р <
0,001). Таким образом, газовая атмосфера с высоким содержанием кислорода более благоприятна для культивирования партеногенетических эмбрионов свиней in vitro при условии двукратной смены среды.
Ключевые слова: эмбрионы свиней, культивирование in vitro, кислород.
Технология экстракорпорального созревания ооцитов и культивирования эмбрионов - надежный и экономичный источник зародышей разных стадий развития. В силу доступности, дешевизны и относительно короткого периода использования, выращенные in vitro половые клетки и эмбрионы - наиболее предпочтительные объекты для исследований в области биологии развития, в работах по трансплантации эмбрионов, клонированию и получению трансгенных животных.
Известно, что эмбрионы, полученные in vitro, отличаются по ряду признаков от эмбрионов, развившихся в естественных условиях. Для них характерны более темная окраска, недостаточная компактность клеточной массы, преждевременное формирование бластоцеля, изменение соотношения между внутриклеточной массой и клетками трофобласта, модификация метаболизма [1...4]. Согласно литературным данным, более низкая компетенция к развитию эмбрионов, полученных in vitro, может быть следствием возраста животного-донора яичников, исходного качества ооцитов, физиологического состояния фолликулов и
ооцит-кумулюсных комплексов [5...9]. Однако главная причина снижения потенции к развитию эмбрионов in vitro - неадекватность искусственно созданных условий, складывающимся при естественном оо- и эмбриогенезе. Кроме того, существует мнение, что в процессе инкубации in vitro отрицательное влияние на развитие эмбрионов оказывают происходящие окислительные процессы, которые, в свою очередь, приводят к образованию свободных радикалов и токсинов [10].
Для кратковременного и длительного культивирования эмбрионов свиней чаще всего используют такие синтетические среды, как NCSU-23 [11], NCSU-37 [12], PZM-3 [13]. При этом для ослабления окислительных процессов в культуре, следовательно, уменьшения количества свободных радикалов и токсинов используют методический прием, основанный на инкубации эмбрионов в газовой атмосфере со сниженной концентрацией кислорода [13, 14]. Однако единого мнения об эффективности такого подхода нет. Например, Machaty с соавторами (1998) сообщали об увеличении доли развития бластоцист и количества ядер в них в случае культивирования в газовой атмосфере, содержащей 5 % CO2 и 20 % О2, по сравнению с состоящей из 5 % CO2, 5 % O2, 90 % N2 Есть также работы, в которых разницы между газовыми режимами не выявлено [16]. Более того, технологически использование газовой атмосферы с низкой концентрацией кислорода создает проблемы, связанные с необходимостью проводить процесс созревания ооцитов и культивирования эмбрионов при разных режимах и, следовательно, в разных инкубаторах, что повышает затраты.
Цель нашей работы состояла в определении зависимости развития партеногенетических эмбрионов свиней от условий культивирования и концентрации кислорода в газовой атмосфере в процессе их инкубации in vitro.
Условия, материалы и методы. Материалом для исследований служили яичники половозрелых свинок и взрослых свиноматок, отобранные после убоя. Транспортировку яичников осуществляли в физиологическом растворе при температуре 28.35 оС в течение 1.2 ч. Выделение ооцит-кумулюсных комплексов (ОКК) проводили методом рассечения видимых фолликулов. Культивировали ОКК группами по 14.25 ооцитов в модифицированной среде ТС199, содержащей 25 мМ HEPES, 2,5 мМ Na-пирувата, 0,57 мМ цистеина, 5 % фетальной сыворотки телят, 0,5 мкг/мл ФСГ и 0,5 мкг/мл ЛГ, 50 мкг/мл гентамицин сульфата (Invitrogen). Через 20 ч. ОКК переносили в свежую среду созревания, из которой были исключены гормоны.
В конце 44 часового периода культивирования ооциты обрабатывали 0,1 %-ным раствором гиалу-ронидазы и механически удаляли прилегающие к ним клетки кумулюса. Активацию созревших предварительно денудированных ооцитов проводили в среде ТС199, содержащей 25 мМ HEPES, 10 % FCS, 50 мкг/мл гентамицин сульфата и 5 цМ иономицина, в течение 5 мин. с последующим культивированием ооцитов в среде NCSU-23.
*Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ, шифр 2012-1.4-12-000-2021-009.
В проведении исследований использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
Таблица. Влияние условий инкубации на развитие партеногенетических эмбрионов свиней in vitro
Группа
Содер-
жание
O, %
Общее
число
активиро-
ванных
ооцитов
Доля раздробившихся ооцитов, % (х ± т)
Доля развившихся бластоцист, __________(%) от числа_________
активированных (x ± m)
раздробившихся (x ± т)
IV
Двукратная смена среды
20 71 83,1± 2,3 25,4 ± 2,7 30,4 ± 2,4
5 74 80,3±2,2 21,3±0,8a 26,7 ± 1,6
Однократная смена среды
20 77 75,4±8,1 12,7±0,9***b 17,9 ± 3,6*
_5___________78 86,2±3,4_______16,9±0,7**__________19,9 ± 0,7*
Достоверные различия, по сравнению с группой I: ***р < 0,001; **р < 0,01;*р < 0,05. Достоверные различия между сравниваемыми группами: а,ь р < 0,01.
Обработанные таким образом ооциты инкубировали в течение 3 ч. в среде ЫС8и-23, содержащей 2мМ 6-ДМАП [17], после чего переносили в среду МСЭи-23 без 6-ДМАП и культивировали еще в течение 6 дн.
Эффективность активации определяли по доле подробившихся и достигших стадии бластоцисты ооцитов, выраженной в процентах.
Инкубацию активированных ооцитов проводили используя газовую атмосферу с высокой (5 % СО2 и 20 % О2) или низкой (5 % СО2 и 5 % О2) концентрацией кислорода. Дополнительно исследовали влияние на развитие партеногенетических эмбрионов однократной (на третий день культивирования, III и IV группы) и двукратной (на второй и четвертый дни культивирования, I и II группы) смены среды.
Эксперимент по культивированию ооцитов, а также их последующему партеногенетическому развитию до стадии бластоцисты выполнен в 4-х независимых повторностях. Данные, выраженные в процентах, подвергали арксинусной трансформации и затем обрабатывали методом двухфакторного дисперсионного анализа при помощи компьютерной программы SigmaStat. Достоверность различий сравниваемых средних значений оценивали с использованием критерия Тьюки.
Результаты и обсуждение. Наибольшая доля развития искусственно активированных ооцитов (см. рисунок, а) до стадии бластоцисты (см. рисунок, б) наблюдалась в случае их инкубации в присутствии 5 % СО2 и 20 % О2 при условии двукратной смены эмбриональной среды (см. табл.). Снижение концентрации О2 до 5 % не улучшало результатов. Более того, наблюдалось
уменьшение доли развития бластоцист на 4,1%. В группах с однократной сменой среды тенденция менялась и доля развития бластоцист в присутствии 5 % СО2 и 5 % О2, была выше, чем при использовании газовой атмосферы, содержащей 20 % О2 но разница была несущественной.
С другой стороны установлено негативное влияние на развитие партеногенети-ческих ооцитов однократной смены среды культивирования, когда инкубирование происходило в присутствии 5 % СО2 и 20% О2. В этом случае доля развития бластоцист, по сравнению с аналогичной группой при двукратной смене, снижалась на 12,7 % (р < 0,001), а с группой эмбрионов инкубируемых при 5 % СО2 и 5 % О2 - на 8,6 % (р < 0,01).
Рисунок. Морфология: а) активированного ооцита свиней; б) бластоцисты (6-ой день культивирования). Объектив 40х, окуляр 10х.
Отрицательный эффект однократной смены среды наблюдался и при культивировании искусственно активированных ооцитов в газовой атмосфере с более низкой концентрацией кислорода Однако наблюдаемое снижение доли развития бластоцист было несущественным.
Выводы. Таким образом, при условии двукратной смены эмбриональной среды в процессе культивирования газовая атмосфера, состоящая из 5 % СО2 и 20 % О2 более благоприятна для культивирования партено-генетических эмбрионов свиней in vitro.
Литература.
1. Gajda B., Smorqg Z. Cells number in pig blastocyst cultured in different media // Annals of Animal Science. - 2004. - V. 4. -P. 315-320.
2. Rubio P.F.J., Teerds K.J., Kidson A., Colenbrander B., Tharasanit T., Aguilar B., Roe- Rubio Pomar F.J., Teerds K.J., Kidson A., Colenbrander B., Tharasanit T., Aguilar B., Roelen B.A.J. Differences in the incidence of apoptosis between in vivo and in vitro produced blastocysts of farm animal species: a comparative study// Theriogenology. - 2005. - V. 63. - P. 2254-2268.
3. Ulloa Ulloa C.M., Yoshizawa M., Komoriya E., Mitsui A., Nagai T., Kikuchi K. The blastocyst production rate and incidence of chromosomal abnormalities by developmental stage in in vitro produced porcine embryos // Journal of Reproduction and Development. -2008. - V. 54. - P. 22-29.
4. Bryia M., Trzcinska M., Wieczorek J. Analysis of in vivo-and in vitro derived pig expanded blastocysts based on DNA fragmentation //Animal Science Papers and Reports. - 2009. - V. 27. - P. 59-68.
5. Motlik J., Fulka J. Factors affecting meiotic competence in pig oocytes// Theriogenology. -1986. - V. 25. - P. 87-96.
6. Yoon K.W., Shin T.Y., Park J.I., Roh S., Lim J.M., Lee B.C., Hwang W.S., Lee E.S.. Development of pocine oocytes from preovulatory follicles of different sizes after maturation in media supplemented with follicular fluid //Reprod. Fertil. Dev. - 2000. - V. 12. - P. 133-139.
7. Hyun S. H., Lee G. S., Kim D. Y., Kim H. S., Lee S. H., et al. Effect of maturation media and oocytes derived from sows or gilts on the development of cloned pig embryos //Theriogenology. - 2003. - V. 59. - P. 1641-1649.
8. Sherrer E.S., Rathbun T.J., Davis D.L. Fertilization and blastocyst development in oocytes obtained from prepubertal and adult pigs// J. Anim.Sci. - 2004. - V. 82. - P. 102-108.
9. Сингина Г.Н., Ермакова С.Г., Лопухов А.В., Зиновьева Н.А. Влияние дбц АМФ на созревание и развитие искусственно активированных ооцитов свиней в зависимости от прилегающих слоев кумулюсных клеток//Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - № 1. - C. 51-55.
10. Gil M.A., Cuello C., Parrilla I., Vazquez J.M., Roca J., Martinez E.A. Advances in swine in vitro embryo production technologies // Reprod. Domest. Anim. - 2010. - V. 45. - P. 40-48.
11. Sage D., Hassel P., Petersen B., Mysegades W., Westermann P., Lucas-Hahn A., Niemann H. Improved in vitro development of porcine embryos produced by nuclear transfer, IVF and parthenogenesis // Reprod. Fertil. Dev. - 2005. - V. 17. - P. 181.
12. Kikuchi K., Onishi A., Kashiwazaki N., Iwamoto M., Noguchi J., Kaneko H., Akita T., Nagai T. Successful piglet productionafter transfer of blastocysts produced by a modified in vitro system //Biol.Reprod. - 2002. - V. 66. - P. 1033-1041.
13. Yoshioka K., Suzuki C., Onishi A. Defined system for in vitro production of porcine embryos using a single basic medium // J.Reprod. Dev. - 2008. - V. 54, № 3. - P. 208-213.
14. Karja N.W., Wongsrikeao P., Murakami M., Agung B., Fahrudin M., Nagai T., Otoi T. Effect of oxygen tension on the development and quality of porcine in vitro fertilized embryos // Theriogenology. - 2004. - V. 62. - P. 1585-1595.
15. Machaty Z., Day B.N., Prather R.S. Development of early porcine embryos in vitro and in vivo // Biol Reprod. - 1998. -V. 59. - P. 451-455.
16. Ock S.A., Kim J.G., Shi L.Y., Jin H.F., Mohana Kumar B., Choe S.Y., Rho G.J. Comparison of development and quality of porcine embryos cultured in different oxygen concentrations// Reprod Fertil Dev. - 2005. - 17. P. 223.
17. Сингина Г.Н., Лопухов А.В, Зиновьева Н.А. Влияние условий искусственной активации на развитие эмбрионов свиней in vitro //Достижения науки и техники АПК. - 2011. - № 10. - С. 53-54.
EFFECTS OF CULTURE CONDITIONS ON PIG EMBRYO DEVELOPMENT IN VITRO
G.N. Singina, S.G. Ermakova, A.V. Lopukhov, N.A. Zinoieva, L.V. Getmantseva
Summary. The technology of oocyte extracorporal maturation and pig embryo culture is widely claimed in the field of research of early development mechanisms as well as in works on embryo transplantation, cloning and producing of transgenic animals. However, optimal conditions for generation of these cells are not fully determined. In the present work, effects of oxygen concentrations in the gas atmosphere and of multiplicity of the culture medium replacement on the pig embryo development in vitro were investigated. For this aim, matured and artificially activated oocytes were incubated using the gas atmosphere with a high (5% СО2 and 20 % О2) and low (5% СО2 and 5 % О2) oxygen concentration. The embryo medium replacement was conducted once (on the third day of culture) or doubly (on the second and fourth days) in both cases. The greatest yield of blastocysts (25.4 %) was observed in the case of incubation of artificially activated oocytes in the presence of 5 % СО2 and 20 % О2 under the condition of double replacement of the culture medium. At the same time culture of pig partenogenic embryos in the gas atmosphere containing a lower concentration of oxygen was less efficient (21.3 % of blastocysts). The single replacement of the embryo medium exerted a negative influence on the oocyte development to the blastocyst stage. Meanwhile, the negative effect was more expressed in the group incubated in the presence of
5 % СО2 and 20 % О2, in which the proportion of blastocysts decreased by 12.7 % (p < 0.001). Thus, the gas atmosphere with the high content of oxygen is more favorable for in vitro culture of pig partenogenic embryos under the condition of double replacement of the embryo medium.
Key words: pig embryos, in vitro culture, oxygen.
УДК 636.92
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ КРОЛИКОВ, ТРАНСГЕННЫХ ПО ГЕНАМ КЛАСТЕРА ГИСТОСОВМЕСТИМОСТИ RCA*
Н.А. ВОЛКОВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией
Н.А.ЗИНОВЬЕВА, академик РАСХН, директор А.В. ДОЦЕВ, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
Л.А. ВОЛКОВА, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник,
ВИЖ Россельхозакадемии Е.А. РУСАКОВА, аспирант,
Оренбургский ГУ Л.К. ЭРНСТ], академик РАСХН Г. БРЕМ, доктор ветеринарных наук, академик РАСХН (иностранный член)
Ветеринарно-медицинский университет E-mail: [email protected]
Резюме. При ксенотрансплантации наиболее перспективным для подавления реакции комплемента представляется получение трансгенных животных с интеграцией и экспрессией в органах и тканях одновременно нескольких генов - ингибиторов. Исследования проводили с целью изучения характера экспрессии экзогенных генов у трансгенных животных этого типа. Объект исследований - кролики, трансгенные по генам кластера комплекса гистосовметимости RCA. Инкубация клеток, выделенных
из различных органов и тканей трансгенных кроликов, с сывороткой человека показала устойчивость таких клеток-мишеней к лизису, по сравнению с контролем. Цитотоксическое действие сыворотки человека было установлено только в отношении клеток сердца: лизис клеток наблюдали в 2 из 14 проведенных опытов. Устойчивость клеток трансгенного происхождения к сыворотке крови человека была установлена также в экспериментах in vitro на первичных культурах клеток сердца, почек, кишечника, щитовидной и поджелудочной желез. При использовании сыворотки человека в концентрации 10 % цитотоксическое действие на клетки трансгенного происхождения не проявлялось, в то время как при культивировании клетокв среде, содержащей 50% сыворотки человека, часть из них погибало. При этом культуры клеток, полученные от трансгенных кроликов, были более устойчивы клизису: количество клеток в культурах трансгенного происхождения оказалось на 16...21,8 % выше, чем в контроле, что свидетельствует
об их повышенной устойчивости к цитотоксическому действию сыворотки крови человека.
Ключевые слова: ксенотрансплантация, трансгенез, кролики, экспрессия трансгена.
Ксенотрансплантацию рассматривают как одно из альтернативных решений проблемы нехватки внутренних органов для больных, нуждающихся в пересадке донорских органов и тканей. В качестве перспективных для трансплантологии рассматриваются гены, контролирующие
* Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ, шифр проекта 2012-1.4-12-000-2021-009. В проведении исследований было использовано оборудование ЦКП «Биоресурсы и биоинженерия сельскохозяйственных животных» ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.
