CC BY
36
MICROBIOLOGY
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Игнатова Н. И., Александрова Н. А., Заславская М. И., Абрамычева Д. В.
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА ИНТЕНСИВНОСТЬ БИОПЛЁНОКООБРАЗОВАНИЯ ШТАММАМИ KLEBSIELLA PNEUMONIAE
ФГБОУ ВО «Приволжский исследовательский медицинский университет» Минздрава РФ, 603005, Нижний Новгород, Россия
В связи с распространённостью биоплёночных инфекций, вызванных Klebsiella pneumoniae, большую значимость в лабо-раторно-диагностической практике представляет получение стандартизированной модели клебсиеллёзной биоплёнки для изучения воздействия на неё антимикробных, в т. ч. антибиоплёночных препаратов и оценки их эффективности. Описан метод выращивания биоплёнок клебсиелл in vitro. Оценку интенсивности биоплёнкообразования проводили стандартным методом по способности бактерий связывать кристаллический виолет. Степень пленкообразования измеряли в единицах оптической плотности. Наличие межклеточного матрикса подтверждали путём окрашивания биоплёнки концентрированным раствором Конго-красного с последующей световой микроскопией. Исследовано воздействие различных экзогенных и эндогенных факторов на биоплёнкообразование штаммами K. pneumoniae. Изучалось влияние состава культуральной среды, возраста культуры («суточная», «недельная»), температурного режима, присутствия кислорода в среде на интенсивность биоплёнкообразования. При изучении влияния условий культивирования на биоплёночную активность штаммов K. pneumoniae установлено, что состав питательной среды существенно влиял на интенсивность образования биоплёнки K. pneumoniae: среда DMEM стимулировала биоплёнкообразование in vitro у большинства штаммов по сравнению с ТСБ. Возраст культуры («суточная», «недельная»), используемой для выращивания биоплёнок, не оказывал существенного влияния на биоплёночную активность клебсиелл. Температура культивирования, наличие кислорода могут, как стимулировать, так и угнетать биоплёнкообразование в зависимости от исследуемого штамма. Большинство штаммов клебсиелл лучше формируют биоплёнку в аэробных условиях при 37° C.
Ключевые слова: биоплёнка; Klebsiella pneumonia; питательные среды; физические факторы. Для цитирования: Игнатова Н.И., АлександроваН.А., Заславская М.И., Абрамычева Д.В. Влияние условий культивирования на интенсивность биоплёнокообразования штаммами Klebsiella pneumoniaе. Клиническая лабораторная диагностика. 2020;65 (8): 512-515. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-8-512-515 IgnatovaN. I., AlexandrovaN. A., ZaslavskayaM. I., AbramychevaD. V.
EVALUATION OF THE INFLUENCE OF CULTURING ON THE INTENSITY OF BIOFILM FORMATION BY KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education «Privolzhsky Research Medical University» of the Ministry of Health of the Russian, 603005, Nizhny Novgorod, Russia
Due to the prevalence of biofilm infections caused by Klebsiella pneumoniae, in laboratory diagnostic practice it has a great importance to obtain a standard model of Klebsiella biofilm for evaluating the bactericidal effect and effectiveness of antimicrobial drugs. Describes the method of Klebsiella biofilms formation in vitro. The intensity of biofilm formation was evaluated by the ability of bacteria to bind the crystal violet. The degree of film formation was measured by optical density. The presence of an intercellular matrix was confirmed by staining of Congo-red solution followed by light microscopy. The effect of exogenous and endogenous factors on biofilm formation by K. pneumoniae strains was investigated. The influence of the nutrient composition, the age of the culture («daily», «weekly»), the presence of oxygen and the temperature conditions were studied. The nutrient composition of the medium significantly influenced on biofilm formation ofK. pneumoniae: DMEM stimulated biofilm formation in most strains in vitro compared to TSB. The age of the culture (daily, weekly) did not significantly affect the biofilm formation of Klebsiella. At the same time, the temperature of culturing and the presence of oxygen can both stimulate and inhibit biofilm formation, depending on the strain under study. Most strains of Klebsiella better form a biofilm under aerobic conditions at 37°C.
Keywords: biofilm; Klebsiella pneumonia; media for cultivation; physical factors.
For citation: Ignatova N.I., AlexandrovaN.A., ZaslavskayaM.I., Abramycheva D.V. Evaluation of the influence of culturing on the intensity of biofilm formation by Klebsiella pneumoniae strains. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2020;65 (8): 512-515 (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-8-512-515
For correspondence: Ignatova N.I., PhD, Associate Professor, Department of epidemiology, microbiology and evidence-based medicine; e-mail: [email protected]
Information about authors:
Ignatova N. I., https://orcid.org/0000-0002-4570-9342; Alexandrova N. A., https://orcid.org/0000-0003-4845-8056; Zaslavskaya M. I., https://orcid.org/0000-0003-1895-0699; Abramycheva D. V., https://orcid.org/0000-0002-6380-9953. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsorship.
Received 27.03.2020 Accepted 29.03.2020
Для корреспонденции: Игнатова Надежда Ивановна, канд. биол. наук, доц. каф. эпидемиологии, микробиологии и доказательной медицины; e-mail: [email protected]
Введение. Широкая распространенность хронических заболеваний дыхательных путей, катетер-ассоци-ированных инфекций, дисбиозов и других патологий, которые имеют в своей основе биопленочный процесс [1, 2], определяет актуальность лабораторных исследований с использованием биопленок. Биоплёнка представляет сообщество взаимодействующих бактерий, погруженных в слизисто-полимерный матрикс и имеющих изменённый фенотип [3, 4], что делает данные микроорганизмы более устойчивыми к воздействию ряда факторов, в том числе, к антибиотикам [5, 6].
Среди биоплёнкообразующих бактерий - возбудителей инфекций - всё чаще отмечается Klebsiella pneumoniae [2, 7]. Представляет интерес получение стандартизированной модели клебсиеллёзной биоплёнки для дальнейшего изучения воздействия на неё антимикробных, в том числе антибиоплёночных препаратов и оценки их эффективности. Исследование действия факторов, способных повлиять на биоплёночную активность штаммов K. pneumoniae, позволит подобрать оптимальный режим моделирования биоплёночного процесса.
Материал и методы. Исследование проводили на чистых культурах клинических изолятов K. pneumoniae (штаммы: 1; 2; 101; 369; 813; 839; 945-1; 945-3; 952-1; 952-3; 952-4; 946; 3824; 3833). Видовую принадлежность штаммов определяли методом масс-спектрометрии MALDI-ToF (MALDI ToF Autoflex speed, Bruker Daltonik GmbH, Германия). Оценку способности исследуемых бактерий к биоплёнкообразованию проводили стандартным методом [8, 9]. Интенсивность биоплёнкообразо-вания оценивали по способности связывать кристаллический виолет. Осуществляли посев исследуемых штаммов в концентрации 0,7 по McFarl, в объёме 2 мл питательной среды на 12-луночные планшеты (Corning, США). Биоплёнки выращивали на питательной среде ТСБ (Trypticase Soy Broth, Becton, Dickinson and Company, США) или среде DMEM (ПанЭко, Россия) в течение 2-х суток. Контролем служила питательная среда без внесения микроорганизмов в лунки планшетов. Для подтверждения биоплёночного процесса биоплёнки окрашивали концентрированным раствором Конго-красного (15 мин), после чего образцы трёхкратно отмывали дистиллированной водой, высушивали и докрашивали раствором карболового фуксина [8, 10] с последующей световой микроскопией Leica DMIL (Leica, Германия). Степень плёнкообразования измеряли в единицах оптической плотности. Статистическую обработку проводили с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни [4].
Оценивали влияние температуры, присутствия кислорода, возраста культуры на биоплёнкообразование. Значение температурного фактора оценивалось путём сравнения роста биоплёнки у исследуемых штаммов при 37°С или 22°С на питательной среде. Для создания анаэробных условий на поверхность питательной среды (в лунке планшета) непосредственно перед культивированием наслаивали 0,5 мл стерильного вазелинового масла. Для приготовления бактериальной суспензии использована чистая культура бактерий сразу после 24-часового культивирования (37°C) («суточная» культура) или чистая культура бактерий после 6-дневной экспозиции при 4°C («недельная» культура).
Результаты. Оценивали влияние состава стандартных питательных сред на способность K. pneumoniae к
МИКРОБИОЛОГИЯ
биоплёнкообразованию (37° C, 2 сут). Установлено, что десять из тринадцати исследуемых штаммов (77%) более интенсивно образуют биоплёнку в среде DMEM. Интенсивность биоплёнкообразования выше, в среднем, в 2,3 раза (p<0,05) (см.таблицу). При культивировании микроорганизмов в ТСБ в большинстве случаев наблюдали более интенсивный рост планктонной формы бактерий, в DMEM - колонизацию дна лунки планшета. Штамм K. pneumoniae 945-3 не показал значимых различий интенсивности формирования биоплёнки при смене среды культивирования. K. pneumoniae 101 и 3833 лучше формировали биоплёнку при культивировании в среде ТСБ (см.таблицу). Характерный для биоплёнки полисахаридный матрикс наиболее выражен при культивировании микроорганизмов в среде DMEM, что обнаруживалось при окрашивании Конго-красным.
Для оценки возраста культуры, влияния температуры, присутствия кислорода отобраны штаммы, показавшие высокую интенсивность образования биоплёнки на среде DMEM: 1, 2; 369; 813; 952-3, 3824.
Влияние фаз жизненного цикла на биоплёнкообра-зование оценивалось у бактерий «суточной» и «недельной» культур. Бактериальная культура, взятая в экспоненциальной фазе роста («суточная» культура) образовывала более плотную биоплёнку, чем культура бактерий, находящаяся, преимущественно, в стационарной фазе («недельная» культура), но различия не были статистически значимы (p>0,05). При оценке температурного фактора установлено, что для большинства штаммов понижение температуры культивирования до 22°C не влияло на интенсивность образования биоплёнки. Статистически значимое снижение биоплёнкообра-зования при 22° C отмечено для штамма 369, усиление -для штамма 3824. Рост бактерий в анаэробных условиях давал незначительное снижение биоплёнкообразования по сравнению с аэробными условиями для большинства штаммов (p>0,05). Единственный штамм, показавший достоверное (p<0,05) усиление биоплёнкообразования в анаэробных условиях - K. pneumoniae 3824.
Обсуждение. В результате анализа влияния питательной среды на интенсивность биоплёнкообразования штаммами K. pneumoniae установлено, что для большинства штаммов имеет существенное значение состав питательной среды. При сравнении субстратов для культивирования, лучшей средой для стимуляции биоплёночного процесса показала себя среда DMEM. Биоплёнка формируется бактериями чаще всего с целью защиты и выживания микроорганизмов в неблагоприятной или агрессивной среде [11]. Дефицит питательных веществ в субстратах может активировать «чувство кворума» (англ. quorum sensing), помогающее бактериям совместно адаптироваться к более «голодной» среде. С этой точки зрения, отсутствие высокомолекулярных пептидов в среде DMEM (в отличие от ТСБ) может служить сигналом для общения и координации между бактериями, нацеленными на выживание популяции. Quorum sensing у многих бактерий связан с процессами агрегации клеток, производством экзополисахаридов и формированием биоплёнок [12].
Чистая культура K. pneumoniae достаточно стабильна и может сохранять свою жизнеспособность при длительном хранении на питательной среде. В 1-е сутки культивирования на искусственных питательных средах популяция находится в экспоненциальной фазе роста. Спустя 2 суток и более, при отсутствии поступления
MICROBIOLOGY
Биоплёночная активность K. pneumoniae в зависимости от питательной среды, M±m
Штаммы клебсиелл Средняя оптическая плотность элюата (ед. опт. плотности) Кратность изменения биоплёнкообразования (ДМЕМ/ТСБ)
Культивирование в ТСБ Культивирование в DMEM
K. pneumoniae 1 0,32±0,05 0,65±0,03* 2,10±0,24*
K. pneumoniae 2 0,13±0,02 0,47±0,02* 3,72±0,59*
K. pneumoniae 101 0,65±0,09 0,45±0,02* 0,69±0,13*
K. pneumoniae 369 0,15±0,09 0,54±0,06* 2,99±1,18*
K. pneumoniae 813 0,20±0,07 0,35±0,09* 1,77±0,43*
K. pneumoniae 839 0,14±0,04 0,29±0,01* 2,22±0,54*
K. pneumoniae 945-1 0,24±0,07 0,05±0,01* 0,21±0,02*
K. pneumoniae 945-3 0,16±0,07 0,18±0,05 1,23±0,45
K. pneumoniae 946 0,30±0,09 1,0±0,26* 3,82±1,90*
K. pneumoniae 952-1 0,20±0,05 0,39±0,04* 1,97±0,59*
K. pneumoniae 952-3 0,19±0,03 0,45±0,21* 2,26±0,71*
K. pneumoniae 952-4 0,22±0,03 0,47±0,02* 2,18±0,19*
K. pneumoniae 3824 0,37±0,09 1,27±0,26* 3,73±1,42*
K. pneumoniae 3833 0,28±0,03 0,13±0,05* 0,47±0,14*
Примечание. * - статистически значимые отличия относительно биопленки, культивированной в ТСБ.
новых питательных веществ, популяция неизбежно переходит в стационарную фазу, затем фазу отмирания. Установлено, что для биоплёнкообразования штаммами K. pneumoniae не имеет существенного значения в какой фазе изначально находилась популяция бактерий. Попадая в новые условия, бактерии «недельной» культуры быстро адаптируются и начинают формировать биоплёнку, незначительно уступая по этой способности бактериям, взятым из «суточной» культуры.
У большинства штаммов K. pneumoniae не отмечено значительных изменений в биоплёночном процессе при изменении температуры культивирования. У штамма 3824, выделенного с поверхности вагинального эпителия, отмечалось достоверное усиление биоплёнкообразо-вания при температуре 22°C. Штамм 369, полученный из гнойной раны, формировал биоплёнку лучше при 37°C и достоверно снижал свою биоплёночную активность при 22°C. Можно предположить, что зависимость биоплёнко-образования у вышеуказанных штаммов от температуры является следствием их длительной адаптации к определённым экологическим нишам. Последним биотопом для штамма 3824 являлась вагина, имеющая температуру ниже 37°C. Лучшая адаптация штамма 369 к температуре 37°C, возможно, связана с его высокой способностью к паразитизму во внутренних тканях организма человека.
K. pneumoniae относится к факультативно-анаэробным микроорганизмам, что позволяет им комфортно чувствовать себя как в аэробной, так и анаэробной среде посредством переключения метаболических путей. Продемонстрировано незначительное снижение интенсивности биоплёнкообразования в анаэробных условиях у большинства штаммов, т. е. наблюдалось небольшое усиление биоплёночного процесса в присутствии кислорода. Единственный из исследуемых штаммов, показавший значительное увеличение биоплёнкообразования в анаэробных условиях - K. pneumoniae 3824, выделенный из биотопа влагалища. Формирование биоплёнки может быть связано не только с кислород-зависимыми процессами, но и вполне способно осуществляться в состоянии анаэробного метаболизма.
Выводы.
1. Состав питательной среды влияет на интенсивность образования биоплёнки K. pneumoniae: среда
DMEM стимулирует биоплёнкообразование in vitro у большинства штаммов по сравнению с ТСБ.
2. Изолированные клетки K. pneumoniae, полученные из «суточной» культуры бактерий, незначительно превосходят бактерии «недельной» культуры по способности формировать биоплёнку in vitro.
3. Чувствительность биоплёночного процесса к присутствию кислорода и температуре является штамм-зависимым признаком для K. pneumoniae. Большинство штаммов клебсиелл лучше формируют биоплёнку в аэробных условиях при 37° C.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА (пп .1-3, 5, 6, 9, 11 см .REFERENCES)
4. Колчанова Н.Э., Окулич В.К., Шилин В.Е. Определение образования микробной биоплёнки бактериями периодонтального кармана и её устойчивости к химическим и биологическим объектам. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2015; 3:56-61.
7. Осипова Е.В., Шипицына И.В. Информационная характеристика микробных биоплёнок, формируемых in vitro на поверхности покровного стекла клиническими штаммами Klebsiella pneumoniae. Гений Ортопедии. 2018; 4(24): 478-81.
8. Окулич В.К., Кабанова А.А., Плотников Ф.В. Микробные биоплёнки в клинической микробиологии и антибактериальной терапии. Витебск: ВГМУ; 2017.
10. Титова С.В., Веркина Л.М., Моделирование биоплёнок холерного вибриона на твёрдых поверхностях (стекло и пластик) и визуализация их в световом и люминесцентном микроскопах. Клиническая лабораторная диагностика. 2016;61(4): 238-41. 12. Плакунов В. К., Мартьянов С. В., Тетенева Н. А., Журина М. В. Управление формированием микробных биоплёнок: анти- и пробиоплёночные агенты. Микробиология. 2017; 4(86): 402-20.
REFERENCES
1. Venkatesan N., Perumal G., Doble M. Bacterial resistance in bio-film-associated bacteria. Future Microbiol. 2015; 10(11):1743-50. doi: 10.2217/fmb.15.69.
2. Desai S., Sanghrajka K., Gajjar D. High adhesion and increased cell death contribute to strong biofilm formation in Klebsiella pneumoniae. Pathogens. 2019; 8(4). pii: E277. doi: 10.3390/patho-gens8040277.
МИКРОБИОЛОГИЯ
3. Jakobsen T.H., van Gennip M., Christensen L.D., Bjarnsholt T., Givskov M. Qualitative and quantitative determination of quorum sensing inhibition in vitro. Quorum sensing: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 2011; 692: 253-63.
4. Kolchanova N.E., Okulich V.K., Shilin V.E. Determination of the periodontal pocket bacteria's to form microbic communities and its chemical and biological objects resistance. Immunopatologiya, al-lergologiya, infektologiya. 2015; 3:56-61. (in Russian)
5. De Campos P.A., Royer S., da Fonseca Batistao D.W., Araujo B.F., Queiroz L.L., de Brito C.S., Gontijo-Filho P.P., Ribas R.M. Multidrug resistance related to biofilm formation in Acinetobacter baumannii and Klebsiella pneumoniae clinical strains from different pulsotypes. Curr. Microbiol. 2016; 72: 617-27. doi: 10.1007/s00284-016-0996-x.
6. Vuotto C., Longo F., Pascolini C., Donelli G., Balice M.P., Libori M.F., Tiracchia V., Salvia A., Varaldo P.E. Biofilm formation and antibiotic resistance in Klebsiella pneumoniae urinary strains. J. Appl. Microbiol. 2017; 123: 1003-18. doi: 10.1111/jam.13533.
7. Osipova E. V., Shipitsyna I. V. Informational characteristics of microbial biofilms formed by clinical strains of Klebsiella pneumoniae in vitro on the surface of the cover glass. Geniy ortopedii. 2018; 4(24): 478-81. (in Russian)
8. Okulich V.K., Kabanova A.A., Plotnikov F.V. Microbial biofilms in clinical microbiology and antibiotic therapy. [Mikrobnye bioplenki v klinicheskoy mikrobiologii i antibakterial'noy terapii]. Vitebsk: VGMU; 2017. (in Russian)
9. Cadavid E., Echeverri F. The search for natural inhibitors of biofilm formation and the activity of the autoinductor C6-AHL in Klebsiella pneumoniae ATCC 13884. Biomolecules. 2019; 9(2). pii: E49. doi: 10.3390/biom9020049.
10. Titova S.V., Verkina L.M. The modeling of biofilms of comma bacillus on solid surfaces (glass and plastic) and their visualization in light and luminescent microscopes. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2016; 61 (4): 238-41. (in Russian)
11. Desai S.K., Kenney L.J. Switching lifestyles is an in vivo adaptive strategy of bacterial pathogens. Front Cell Infect. Microbiol. 2019; 9:421. doi: 10.3389/fcimb.2019.00421.
12. Plakunov V.K., Mart'yanov S.V., Teteneva N.A., Zhurina M.V. Controlling of microbial biofilms formation: Anti- and probiofilm agents. Mikrobiologiya. 2017;4(86): 423-38. (in Russian)
Поступила 23.03.20 Принята к печати 29.03.20
