CC BY
39
Вісник Дніпропетровського університету. Біологія. Медицина. - 2010. - Вип. 1, т. 1. - С. 50-54. Visnyk of Dnipropetrovsk University. Biology. Medicine. - 2010. - Vol. 1, N 1. - P. 50-54.
УДК 576.311.34
А. М. Гончаров, В. Г. Гаврилюк, О. В. Мацелюх, А. І. Вінніков
Дніпропетровський національний університет ім. Олеся Гончара
ВПЛИВ УМОВ КУЛЬТИВУВАННЯ НА БІОСИНТЕЗ ПРОТЕОЛІТИЧНИХ ФЕРМЕНТНИХ КОМПЛЕКСІВ YARROWIA LIPOLYTICA
Встановлено, що на продукцію протеолітичних ферментів дріжджоподібними грибами впливають джерела вуглецю, нітрогену та енергії. Вивчено вплив різних органічних сполук на протео-, фібрино-, желатино- та гемоглобінолітичну активність ферментів Yarrowia lipoytica 2061. Показано позитивний вплив унесення галактози та желатину з гліцином до культурального середовища. Встановлено оптимальну температуру, pH та інші параметри культивування для отримання ферментних комплексів.
А. М. Гончаров, В. Г. Гаврилюк, Е. В. Мацелюх, А. И. Винников
Днепропетровский национальный университет им. Олеся Гончара
ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НА БИОСИНТЕЗ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТНЫХ КОМПЛЕКСОВ YARROWIA LIPOLYTICA
Установлено, что на продукцию протеолитических ферментов дрожжеобразными грибами оказывают влияние источники углерода, азота и энергии. Изучено влияние различных органических соединений на протео-, фибрино-, желатино- и гемоглобинолитическую активность ферментов Yarrowia lipolytica 2061. Показано позитивное влияние внесения галактозы и желатина с глицином в культуральную среду. Установлены оптимальные температура, pH и другие физические параметры культивирования для получения ферментных комплексов.
A. M. Goncharov, V. G. Gavriljuk, E. V. Matseljukh, A. I. Vinnikov
Oles’ Gonchar Dnipropetrovsk National University
CULURAL PARAMETERS EFFECT OF BIOSYNTHESIS OF PROTEOLYTIC ENZYME COMPLEXES FROM YARROWIA LIPOLYTICA
It was established, that production of proteolytic enzymes from yeasts is effected by sources of Carbon, Nitrogen and energy. The impact of different organic substances to proteo-, fibrino-, gelatine- and haemoglobinolytic enzyme activity from Yarrowia lipoytica 2061 is established. Positive effect of addition galactose and gelatin with glycine in cultural liquid is revealed. Optimal temperature, pH and other physical parameters for getting proteolityc enzyme complexes is defined.
Вступ
Нині у багатьох галузях господарства застосовуються технології, пов’ язані з перетворенням складних органічних речовин на прості гідролітичним шляхом. У зв’ язку з цим перспективне застосування гідролітичних ферментів, які продукуються мікро-
© А. М. Гончаров, В. Г. Гаврилюк, О. В. Мацелюх, А. І. Вінніков, 2010 50
організмами. Але для їх широкого промислового застосування необхідне детальне дослідження процесів синтезу та механізмів дії. Особливо важлива оптимізація умов культивування продуцентів із метою отримання максимального виходу кінцевого продукту за мінімальних затрат. Один із перспективних продуцентів протеолітичних ферментів - дріжджоподібні гриби роду Уаггом>іа [5; 8; 13]. Вони добре вивчені у фізіологічному та генетичному аспектах, не вибагливі до умов існування. Для них розроблені схеми селекційного пошуку, а головне - вони продукують велику кількість протеолітичних ферментів, які можна легко виділити та очистити для подальшого практичного застосування [1; 3]. Мета даної роботи - оцінити вплив складу живильного середовища та умов культивування на приріст біомаси та синтез протеолітичних ферментних комплексів штаму У. ІіроІуііса 2061.
Матеріал і методи досліджень
Об’єкт досліджень - штам У. ІіроІуііса 2061 - продуцент протеолітичних ферментів. Для вирощування накопичувальної культури використовували живильне середовище для дріжджів такого складу (г/л): глюкоза - 20,00, сечовина - 1,00, дріжджовий автолізат - 0,30, КН2Р04 - 0,50,MgS04■7H20 - 0,25, КСІ- 0,30;рН = 6,0.
Для дослідження впливу концентрації джерел вуглецю та енергії на продукцію протеолітичних комплексів штам У. ІіроІуііса 2061 висівали на живильне середовище зі змінними концентраціями глюкози та галактози (1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 та 30 г/л). Культуру вирощували при інтенсивному перемішуванні протягом 48 годин. У культураль-ній рідині визначали вміст білка за Лоурі [2; 6; 12], загальну протеолітичну активність -за Ансоном та фібринолітичну активність [3; 5; 11]. Статистичну обробку експериментальних даних проводили з використанням критерію Стьюдента (і) на 5 % рівні значимості. На рисунках і в таблицях наводяться середні дані 3 визначень.
Результати та їх обговорення
Для вибору оптимального джерела вуглецю та енергії, яке забезпечить максимальну продукцію ферментів, проведено аналіз впливу концетрації глюкози та галактози на приріст білка, протеолітичну та фібринолітичну активність. Зі збільшенням концентрації глюкози зростає вміст білка до 0,486 мг/мл, а ферментативна активність досягає максимуму при концентрації глюкози 20 г/л. При більших її концентраціях синтез ферментів зменшується з 4-10-2 до 4-10-3 од./мл, із чого можна зробити припущення про катаболітну репресію синтезу ферментів глюкозою (табл. 1). Щодо впливу концентрації глюкози на ферментативну активність культуральної рідини, то вона також пригнічується при вмісті глюкози понад 20 г/л. При нижчих концентраціях відмінність за рівнем активності незначна (0,015 ± 0,005 од./мг).
Альтернативне джерело вуглецю та енергії - галактоза, тому для неї також проведене дослідження впливу концентрації на біосинтетичну активність (табл. 2). При концентраціях галактози понад 20 г/л також відбувається зменшення протеолітичної активності. Фібринолітична активність не пригнічується при вищій концентрації галактози (на відміну від глюкози) і залишається на рівні 0,25 ± 0,05 од./мл. Це можна пояснити тим, що глюкоза частіше за інші вуглеводи викликає катаболітну репресію синтезу ферментів [6; 7; 9]. Таким чином, загальний вміст білка зростає при підвищенні концентрації обох вуглеводів. Протеолітична активність пригнічується як глюкозою, так і галактозою при їх концентраціях понад 20 г/л; фібринолітична - лише відповідними концентраціями глюкози.
Вплив змінних концентрацій глюкози на ферментативну активність протеолітичних комплексів Yarrowia lipolytica 2061
Концентрація глюкози, г/л Вміст білка, мг/мл Протеолітична активність Фібринолітична активність
од./мл середовища од./мг білка од./мл середовища од./мг
1 0,215 ± 0,0010 0,012 ± 0,0006 0,055 ± 0,0027 0,001 ± 0,0000 0,005 ± 0,0003
2 0,210 ± 0,0010 0,015 ± 0,0007 0,070 ± 0,0035 0,002 ± 0,0001 0,010 ± 0,0005
5 0,260 ± 0,0013 0,018 ± 0,0009 0,070 ± 0,0035 0,003 ± 0,0002 0,014 ± 0,0007
10 0,245 ± 0,0012 0,022 ± 0,0011 0,089 ± 0,0044 0,007 ± 0,0004 0,027 ± 0,0013
15 0,238 ± 0,0012 0,016 ± 0,0008 0,069 ± 0,0035 0,006 ± 0,0003 0,024 ± 0,0012
20 0,331 ± 0,0016 0,013 ± 0,0006 0,040 ± 0,0020 0,005 ± 0,0002 0,014 ± 0,0007
25 0,371 ± 0,0018 0,006 ± 0,0003 0,015 ± 0,0007 0,012 ± 0,0006 0,031 ± 0,0015
30 0,486 ± 0,0019 0,002 ± 0,0001 0,004 ± 0,0002 0,002 ± 0,0001 0,003 ± 0,0002
Таблиця 2
Вплив концентрації галактози на ферментативну активність протеолітичних комплексів Yarrowia lipolytica 2061
Концентрація галактози, г/л Вміст білка, мг/мл Протеолітична активність Фібринолітична активність
од./мл середовища од./мг білка од./мл середовища од./мг білка
1 0,125 ± 0,0062 0,016 ± 0,0008 0,130 ± 0,0065 0 0
2 0,120 ± 0,0060 0,024 ± 0,0012 0,204 ± 0,0102 0,003 ± 0,00015 0,025 ± 0,0012
5 0,125 ± 0,0062 0,042 ± 0,0021 0,343 ± 0,0171 0,003 ± 0,00015 0,026 ± 0,0013
10 0,145 ± 0,0072 0,040 ± 0,0020 0,281 ± 0,0141 0,004 ± 0,00020 0,027 ± 0,0014
15 0,103 ± 0,0051 0,036 ± 0,0018 0,357 ± 0,0179 0,003 ± 0,00015 0,032 ± 0,0016
20 0,215 ± 0,0107 0,040 ± 0,0020 0,190 ± 0,0095 0,003 ± 0,00015 0,017 ± 0,0008
25 0,215 ± 0,0107 0,002 ± 0,0001 0,009 ± 0,0005 0,004 ± 0,00020 0,018 ± 0,0009
30 0,198 ± 0,0099 0,002 ± 0,0001 0,010 ± 0,0005 0,004 ± 0,00020 0,020 ± 0,0010
На наступному етапі проводили дослідження впливу джерел нітрогену на рівень продукції протеолітичних ферментних комплексів. Додавання до живильного середовища У. ІіроІуґіса 2061 неорганічних джерел нітрогену не впливало на рівень протеолітичної активності. Використання як єдиного джерела нітрогену пептону або гліцину з желатином призводило до збільшення загальної протеолітичної активності продуцента на 87, 122 та 156 % відповідно, порівняно з контролем, який містив сечовину як єдине джерело нітрогену (рис. 1). Використання комбінацій желатину з неорганічними сполуками не викликало підвищення активності порівняно із застосуванням желатину. Але комбінація пептону та гліцину з желатином дає можливість збільшити протеолітичну активність культуральної рідини на 196 і 222 % відповідно. Таким чином, для синтезу протеолітичного комплексу У. їіроїуґіса 2061 оптимальне джерело нітрогену у живильному середовищі - суміш гліцину з желатином [9].
Оптимальний склад живильного середовища для забезпечення максимального біосинтезу позаклітинного протеолітичного комплексу У. їіроїуґіса 2061 такий (г/л): желатин - 10,0, гліцин - 1,00, галактоза - 20,00, дріжджовий автолізат - 0,30, КН2Р04 -
0,50, MgS04■7H20 - 0,25, КСІ - 0,30. Завдяки оптимізації джерел нітрогену живильного середовища вдалося підвищити активність протеолітичних комплексів У. ІіроІуґіса 2061 у 2,4 раза. Для визначення впливу речовин білкової природи на синтез протеолітичних комплексів вивчено дію різних індукторів: гемоглобіну, казеїну, желатину, бичачої крові (рис. 2).
При вирощуванні У. ІіроІуґіса 2061 на середовищі з додаванням казеїну відбувалася активація синтезу протеолітичного комплексу, при цьому в 2,5 раза порівняно з контролем зростала загальна протеолітична та гемоглобінолітична ак-
тивність. Рівень гемоглобінолітичної активності на середовищах із бичачою кров’ю та желатином в 1,6—1,8 раза вищий, ніж у контролі. Під час культивування У. їіроїуґіса 2061 на середовищах із казеїном і желатином вдавалося досягти високих показників питомої фібринолітичної активності (0,15-0,16 од./мг), що майже удвічі вище порівняно з контролем.
& 0,35 ---------------------------------------------------------------------
ІЗ
■а
0,30
0,25
0,20
Й 0,15 -
1 0,10 -53
0,05 -
&
із
4
5
6
її
.5
о
<
0,40
0,35
0,30
0Д5
0Д0
0,15
0,10
0,05 -|-
0,00
контроль казеїн бичача кров гемоглобін желатин
Рис. 2. Вплив речовин білкової природи на продукцію протеолітичних ферментів:
1 - протеолітична, 2 - гемоглобінолітична, 3 - фібринолітична, 4 - желатиназна активність
На активність протеолітичних ферментних комплексів, окрім складу середовища, впливають також умови культивування продуцентів: рН, температура, об’єм живильного середовища та кількість посівного матеріалу. Вивчення впливу різних факторів дозволить керувати процесами, що протікають у клітині мікроорганізму. Для подальшого підвищення активності досліджено вплив різних умов ферментації на біосинтез протеолітичних ферментних комплексів [5]. Збільшення об’єму живильного середовища та викликане цим зниження швидкості розчинення кисню викликає збільшення активності всіх ферментів. Показано, що культивування продуцента в об’ємі середовища 150-200 мл оптимальне для синтезу ферментів.
Дослідження ефективності перемішування та впливу температури показало, що максимальна активність культуральної рідини Y. lipolytica 2Q61 спостерігається під час культивування в умовах качалки при 220 об./хв. Тому підбір температурного режиму проводився саме при такій швидкості перемішування. Виявлено, що в діапазоні температур +28...+30 °С відмічався максимальний рівень активності протеаз штаму Y. lipolytica 2Q61.
Висновки
Встановлено оптимальні умови культивування Y. lipolytica 2Q61, за яких активність протеолітичного комплексу найвища: рН 6,0, температура +28...+30 °С, об’єм живильного середовища 150 мл, об’єм посівного матеріалу 20 мл, джерело вуглецю -галактоза, джерело нітрогену - желатин із гліцином.
Бібліографічні посилання
1. Влияние координационных соединений германия на активность ряда гликозидаз / Л. Д. Вар-банец, О. Н. Рзаева, Е. В. Мишак и др. // Мікробіол. журн. - 2007. - Т. 69, № 3. - С. ІІ-І8.
2. Долгих М. С. Протеолитическая активность дрожжеподобных грибов рода Candida - продуцентов белка / М. С. Долгих, Э. Г. Кравцов, А. В. Ермолаев // Микология и фитопатология. -І990. - Т. 24, № 3. - С. 229-235.
3. Петрова И. С. Определение протеолитической активности ферментных препаратов микробного происхождения / И. С. Петрова, М. Н. Винцюнайте // Прикл. биохимия и микробиология. -І966. - Т. 2, № І. - С. 322-327.
4. Полыгалина Г. В. Определение активности ферментов / Г. В. Полыгалина, В. С. Чередниченко, Л. В. Римарева. - М. : ДеЛипринт, 2003. - 250 с.
5. Andrews P. Estimation of the molecular weights of proteins by Sephadex gel-filtration // Biochem. J. -І964. - Vol. 9І, N 2. - P. 222-232.
6. Balaraman K. Production and purification of fibrinolytic enzyme (trombinase) from Yarrowia lipolytica / K. Balaraman, G. Prabokaran // Indian J. Med. Res. - 2007. - Vol. І26, N 5. - P. 459-464.
7. Barett A. J. Proteolytic enzymes: aspartic and metalloproteases // Meth. Enzymol. - І995. -Vol. 248. - P. І83-І97.
8. Genetic control of extracellular protease synthesis in the yeast Yarrowia lipolytica / C. I. Gonzalez-Lopez, R. Szabo, S. Blanchin-Rolanda, C. Gaillardina // Genetics. - 2002. - Vol. І60. - P. 417-427.
9. Growth and proteolytic activity of hairy roots from Yarrowia lipolytica: effect of nitrogen and sucrose / P. M. L. Lourengo, S. de Castro, T. M. Martins et al. // Enzyme and Microbial Technology. -2002. - Vol. 3І, N 3. - P. 242-249.
10. ^Я-regulated expression of the acid and alkaline extracellular proteases of Yarrowia lipolytica / D. J. Glover, R. K. McEven, C. R. Thomas, T. W. Young // Microbiology. - І997. - Vol. І43. -P. 3045-3054.
11. The intracellular proteolytic system of Yarrowia lipolytica and characterization of an aminopeptidase / Z. Hernandez-Montanez, J. Araujo-Osorio, Y. Noriega-Reyes et al. // FEMS Microbiol. Lett. - 2007. - Vol. 268, N 2. - P. І78-І86.
12. Protein measurement with the folin phenol reagent / O. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Farr, R. J. Randall // J. Biol. Chem. - І95І. - Vol. І93, N І. - P. 265-275.
13. Protein expression and secretion in the yeast Yarrowia lipolytica / J. M. Nicaud, C. Madzak, P. van den Broek et al. // FEMS Yeast Res. - 2002. - Vol. 2, N 3. - P. 37І-379.
Надійшла до редколегії Q5.Q6.2Q1Q
