CC BY
139
ВЛИЯНИЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ОСТРОВКОВЫХ КЛЕТОК ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПЛОДОВ КРОЛИКА НА ТЕЧЕНИЕ ИНДУЦИРОВАННОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА У ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ
12 3
И.К. Абдрахманов , Н.Б. Савенко , Ю.А. Кузнецов ,
4
3
М.А. Селюгин , Л.П. Дьяконов
'Кафедра анатомии, физиологии животных и хирургии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8/2, Москва, Россия, 117198
2ОАО «Российский научно-технический центр по чрезвычайным ситуациям в агропромышленном комплексе» ул. Садовая-Спасская, 11/1, Москва, Россия, 107139
3Ветеринарная клиника «Аверс-вет» Машкинское ш., 15, Москва, Россия, 125466
4ВНИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко Рязанский просп., 24, Москва, Россия, 109428
В данной работе показан опыт по трансплантации островковых клеток поджелудочной железы плодов кролика лабораторным мышам со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом. Клетки были трансплантированы в печень в дозе 105 кл./0,5 мл. В течение 2 месяцев после ксе-нотрансплантации у мышей отмечалась стойкая нормогликемия.
Ключевые слова: сахарный диабет, ксенотрансплантация, бета-клетки, островковые клетки поджелудочной железы, плоды кролика, стрептозотоцин, лабораторные мыши.
Введение. Вследствие повреждения островковой ткани поджелудочной железы инсулинозависимый сахарный диабет является тяжелейшим заболеванием; он сопровождается абсолютной инсулиновой недостаточностью с выраженной гипергликемией и сопутствующими осложнениями в виде ангио-, нефро- и рети-нопатий.
Трансплантация в организм больного инсулинозависимым сахарным диабетом культуры островковых клеток поджелудочной железы является перспективным способом достижения гликемического контроля, поступления эндогенного инсулина, предотвращения тяжелых гипогликемий и сопутствующих осложнений [10].
Материалом для трансплантации в-клеток поджелудочной железы могут служить клетки как животных одного вида (например, собака ^ собака (аллотранс-плантация)), так и разных видов (кролик ^ собака (ксенотрансплантация)).
Использование кроликов в качестве источника островковых клеток для трансплантации определяется биодоступностью материала и позволяет получать значительное количество трансплантируемых клеток.
Одним из самых перспективных направлений в трансплантации островковых клеток является поиск иммунологически привилегированных зон для транспланта-
ции, позволяющих достигать длительного функционирования трансплантированных ксеногенных ß-клеток без назначения иммунодепрессантов. При этом отмечается, что наиболее подходящими зонами для трансплантации островковых клеток являются тимус, семенники, костный мозг, почки, печень [2; 8; 10; 12].
Трансплантация ß-клеток в печень признается наиболее эффективной многими авторами [6; 7; 10; 12; 14; 16; 18; 20], что объясняется «родственностью» этих тканей в эмбриогенезе: они берут свое начало от одного типа стволовых клеток. Кроме того, в работах по получению и дифференцировке стволовых клеток протокового эпителия поджелудочной железы показана дифференцировка этих клеток не только в ß-клетки и ацинарную ткань поджелудочной железы, но и в овальные клетки печени [13].
В данной экспериментальной работе нами исследовалась перспектива использования ксеногенной культуры островковых клеток, полученной из поджелудочных желез плодов кролика, для обеспечения поступления инсулина в организм мышей с экспериментальным (стрептозотоциновым) сахарным диабетом.
Методы. Животные. В работе были использованы мыши породы BALB/c весом 25—30 г, самки, в количестве 30 голов (РОНЦ РАМН). Все эксперименты проводились согласно требованиям Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.
Все животные содержались на базе вивария РОНЦ РАМН. Лабораторный диабет у мышей вызывали внутривенным введением стрептозотоцина (STZ) (Sigma, # S 0130) в дозе 150 мг/кг веса. Через 10 дней после введения стрептозотоцина производили контроль гликемии в крови глюкометром (Accu-Chek Active, Roshe) и при уровне глюкозы выше 10,0 ммоль/л производили ксенотрансплантацию культуры фетальных островковых клеток. Две мыши к этому сроку погибли от гипергликемии. Все животные были разделены на 3 группы:
— здоровые животные без трансплантации (10 гол.) (контроль);
— животные с лабораторным диабетом без трансплантации (9 гол.) (диабет);
— животные с лабораторным диабетом с трансплантацией ß-клеток (9 гол.) (диабет + трансплантация).
Получение и культивирование фетальных островковых клеток. Фетальные островковые клетки кролика выделяли из плодов 25—30 сут. развития. Материал для выделения получали в питомнике по выращиванию кроликов ООО «Алькона» (пос. Дубровицы, Московская обл.). Поджелудочные железы плодов стерильно извлекали, измельчали и инкубировали в среде 199 с добавлением 1,5 мг/мл коллаге-назы (Sigma, # C-0130). После этого суспензию клеток пипеттировали и переносили в культуральные флаконы (Corning), содержащие среду 199 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки. Клетки культивировали в течение 7—10 дней до трансплантации. При этом клетки проверялись на бактериальную, вирусную и микоплазменную загрязненность. Кроме того, данные клетки тестировались нами на туморогенность in vitro по характеру роста культуры и in vivo на иммуно-дефицитных мышах.
Цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание клеток. Цитохимическое окрашивание ß-клеток на инсулин проводили альдегид-фуксином по методу Гомори. Иммуноцитохимию осуществляли с использованием первичных ан-
тиинсулиновых мышиных антител (Sigma, # I-2018) и вторичных антивидовых антител, меченных FITC (Sigma, # F-8771). Детекцию окрашенных клеток проводили на флуоресцентном инвертированном микроскопе Olympus.
Трансплантация. Перед трансплантацией клетки отмывали от питательной среды и сыворотки, снимали с культурального пластика, центрифугировали и ре-суспендировали в физиологическом растворе и помещали в инсулиновый шприц из расчета 105 кл./0,5 мл раствора на животное.
Под общей анестезией (рометар, золетил) мышам делали лапаротомию и инт-рапаренхиматозно вводили суспензию клеток (3 инъекции иглы на печень). После этого мышечный и кожный слои раны ушивали. Оценку эффективности трансплантации оценивали измерением уровня глюкозы в крови глюкометром (Accu-Chek Active, Roshe) на 1-й, 3-й, 7, 14, 21, 28, 35, 42, 49-й, 56-й дни после трансплантации.
Результаты исследования. Нами была получена культура ß-клеток плодов кролика, представляющая собой популяцию мелких, округлых клеток, плотно упакованных в кластеры различного размера, свободно плавающих в суспензии либо прикрепляющихся к субстрату на 7—10-й день культивирования (рис. 1, 2). Цитохимическое и иммуноцитохимическое окрашивание показало высокое содержание инсулина в цитоплазме этих клеток (рис. 3).
Рис. 1. ß-клетки плода кролика, 5-е сутки культивирования (нативный препарат, ув. х100)
Рис. 2. ß-клетки плода кролика, 10-е сутки культивирования (нативный препарат, ув. х100)
Рис. 3. Иммуноцитохимическое окрашивание в-клеток на инсулин (краситель Р!ТО, ув. х100)
Определение содержания глюкозы в крови через 10 дней после введения STZ показало, что у всех 18 оставшихся в живых мышей уровень глюкозы был значительно выше нормы и превышал 20 ммоль/л, что позволило говорить о стойкой гипергликемии (табл.).
Таблица
Характеристики экспериментальных групп
Сут. после трансплантации Группы и показатели
контроль диабет диабет + трансплантация
уровень глюкозы, ммоль/л вес, г уровень глюкозы, ммоль/л вес, г уровень глюкозы, ммоль/л вес, г
-1 7,1 ± 0,3 27 ± 0,4 20,3 ± 0,5 23,4 ± 0,4 20,8 ± 0,5 22,8 ± 0,4
1 7,0 ± 0,2 27,2 ± 0,5 23,5 ± 0,7 23,7 ± 0,5 21,3 ± 0,8 23,4 ± 0,5
3 7,5 ± 0,3 26,8 ± 0,4 25,8 ± 0,3 21,9 ± 0,4 17,5 ± 0,7 23,0 ± 0,5
7 7,3 ± 0,4 28,1 ± 0,3 38,2 ± 0,5 20,4 ± 0,2 12,8 ± 0,6 23,5 ± 0,4
14 7,1 ± 0,4 27,8 ± 0,5 — — 10,4 ± 0,3 23,7 ± 0,3
21 7,4 ± 0,3 28,2 ± 0,4 — — 8,2 ± 0,7 24,1 ± 0,4
28 7,4 ± 0,2 28,0 ± 0,3 — — 8,3 ± 0,4 25,1 ± 0,5
35 7,0 ± 0,3 28,0 ± 0,4 — — 7,9 ± 0,3 27,2 ± 0,6
42 7,8 ± 0,4 29,4 ± 0,5 — — 7,8 ± 0,5 28,0 ± 0,4
49 7,2 ± 0,3 29,5 ± 0,3 — — 7,1 ± 0,4 27,2 ± 0,5
56 7,3 ± 0,3 29,3 ± 0,4 — — 6,9 ± ,4 28,4 ± 0,4
После трансплантации в печень суспензии в-клеток у 7 из 8 мышей (88%) группы «диабет + трансплантация» на 21-е сутки установилась нормогликемия (8,2 ± 0,7), что, в принципе, говорило о сохранившейся способности трансплантированных в-клеток к выделению инсулина. Одновременно произошла стабилизация массы тела и нормализация потребления воды. Эти животные оставались нормогликемическими в течение 8 недель без всякой иммуносупрессии.
В группе «диабет» (животные с экспериментальным диабетом без трансплантации) отмечалось ухудшение общего состояния животных, нарастание всех признаков диабета, стойкая гипергликемия (20—38 ммоль/л). Одна мышь погибла на 13-й день после введения STZ, 3 мыши — на 14-й день, 5 мышей погибли к 17-у дню эксперимента. Вес больных животных (20—23 г) снизился с начала эксперимента на 20—25%.
В группе «контроль» все животные не имели изменений общего состояния и веса, анализ крови показывал стойкую нормогликемию (7,1—7,8 ммоль/л).
Динамика изменений средних значений уровня глюкозы в крови лабораторных мышей в экспериментальных группах отражена на рис. 4.
Рис. 4. Динамика изменения уровня глюкозы в крови лабораторных мышей с индуцированным (STZ) сахарным диабетом
Заключение. Данные, представленные в научной литературе, и наши эксперименты показали, что Р-клетки плодов кролика в культуре формируют гомогенную популяцию клеток, активно накапливающих в своей цитоплазме инсулин.
Показано, что трансплантация культуры фетальных кроличьих Р-клеток животным с экспериментальным сахарным диабетом позволяет добиться снижения уровня сахара в крови и его нормализации на протяжении всего срока наблюдения (60 дней) без введения экзогенного инсулина. Кроме того, нормализация уровня глюкозы после трансплантации происходит без применения каких-либо иммуно-супрессантов. Таким образом, очищенные путем культивирования островковые клетки плодов кролика могут быть использованы для ксенотрансплантации животным при лечении инсулинозависимого сахарного диабета.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Дедов И.И., Балаболкин М.И., Клебанова Е.М. Современные аспекты трансплантации островков поджелудочной железы при сахарном диабете / Материалы 3-го Всеросс. диа-бетологич. конгр. — М., 2004.
[2] Леонович С.И., Слука Б.А., Игнатович И.Н., Горанов В.А. Трансплантация культуры островковых клеток поджелудочной железы в красный костный мозг // Белорусск. мед. журн. — 2004. — № 1. — С. 44.
[3] Скалецкий H.H., Кирсанова Л.А., Блюмкин В.Н. // Проблемы трансплантологии и искусственных органов. — М., 1994. — С. 73—80.
[4] Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Игнатенко С.Н. и др. // Пробл. эндокринол. — 1985. — № 5. — С. 67—70.
[5] Шумаков В.И., Блюмкин В.Н., Скалецкий Н.Н. и др. Трансплантация островковых клеток поджелудочной железы. — М.: Канон, 1995.
[6] Alejandro R., Caulfield A., Fround Т. et al. // Cell Transplant. — 2001. — Vol. 10. — P. 520.
[7] Alejandro R., Ferreira J.V., Caulfield A. et al. // Am. J. Transplant. — 2002. — Vol. 2. — Suppl. 3. — P. 227.
[8] Berney T., Buhler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. Transplantation of islets of Langer-hans: new developments // Swiss. Med. Wkly. — 2002. — 132. — P. 671—680.
[9] Bretzel R.G., Manus E., Schomber C. The liver as a site for implantation of islets of Langerhans in experimental diabetes // Morphologic and metabolic observation. — Acta Endocrinol. — 1978. — 87. — Suppl. 215. — P. 69.
[10] Federlin K., Pozza G. Indications for clinical islet transplantation today and in the foreseeable future — the diabetologisfs point of view // J. Mol. Med. — 1999. — 77. — P. 148—152.
[11] Henryk Zulewski, Elizabeth J. Abraham, Melissa J. Gerlach, et al. Multipotential Nestin-Positive Stem Cells Isolated From Adult Pancreatic Islets Differentiate Ex Vivo Into Pancreatic Endocrine, Exocrine, and Hepatic Phenotypes // Diabetes. — 2001. — Vol. 50.
[12] Kolb E., Largiader F. Clinical islet transplantation // Transpl. Proc. — 1980. — 12. — № 4. — P. 205—207.
[13] Lechner A., Habener J. Stem/progenitor cells derived from adult tissues: potential for the treatment of diabetes mellitus // AJP-Endocrinol Metab. — 2003. — V. 284.
[14] Najarian J.S., Sutherland D.E.R. et al. Human islet autotransplantation. A preliminary report // Transplant. Proc. — 1977. — 9. — № 1. — P. 233—236.
[15] Nielsen J., Svensson C., Galsgaard E. Beta cell proliferation and growth factors // J. Mol. Med. — 1999. — 77. — P. 62—66.
[16] Oberholzer et al. в Cell Replacement for the Treatment of Diabetes // Annals of the New York Academy of Sciences. — 2001. — 944. — P. 373—387.
[17] Richardt M., Menden A., Bretzel R. Islet transplantation in experimental diabetes of the rat // Hormone and metab. Res. — 1984. — 16. — № 10. — P. 551—552.
[18] Shapiro A.M., Lakey J.R., Ryan E.A. et al. // N. Engl. J. Med. — 2000. — V. 27. — P. 230—238.
[19] Song K. et al. In vitro transdifferentiation of adult pancreatic acinar cells into insulin-expressing cells // Biochem Biophys Res Commun. — 2004. — 316. — P. 1094—1100.
[20] Valente U., Ferro M., Barocci S. Report of clinical cases of human fetal transplantation // Transplant. Proc. — 1980. — 12. — № 4. — P. 213—214.
[21 ] Vijayakumar K., Ramiy A., Maraist Met al. Reversal of insulin-dependent diabetes using islets generated in vitro from pancreatic stem cells // Nature Medicine. — 2000. — V. 6. — № 3.
[22] Berney T., Buhler L., Caulfield A., Oberholzer J., Toso Ch., Alejandro R. Transplantation of islets of Langer-hans: new developments // Swiss. Med. Wkly. — 2002. — 132. — P. 671—680.
EFFECT OF TRANSPLANTATION OF FETAL RABBIT ISLETS OF LANGERHANS TO STREPTOZOTOCIN-INDUSED DIABETIC MICE
I.K. Abdrakhmanov1, N.B. Savenko2, Yu.A. Kuznetsov3,
M.A. Selyugin3, L.P. Dyakonov
'Department of anatomy, physiology of animals and surgery Russian People's Friendship University
Miklukho-Maklaya Str., 8/2, Moscow, Russia, 117198
2JSC «Russian R&D Center of agriculture emergency» Sadovaya-Spasskaya Str., 11/1, Moscow, Russia, 107139
3Veterinary clinic «Avers-vet» Mashkinskoe shosse, 15, Moscow, Russia, 125466
4Kovalenko Institute of experimental veterinary Russian People's Friendship University
Ryazansky prospect, 24, Moscow, Russia, 109428
4
This article is about the trial of transplantation of fetal cells of pancreas to laboratory mice with streptosotozin diabetes. Cells were infused into liver in the dose of 105 cells/0,5 ml. Mices that received rabbit P-cells had normal level blood glucose within 2 months after xenotransplantation.
Key words: diabetes, xenotransplantation, beta cells, pancreatic islet cells, rabbit embryo, strep-tozotocin, laboratory mice.
