CC BY
40
_Успехи в химии и химической технологии. ТОМ XXIX. 2015. № 8_
УДК 577.15.08+606.61
М.А. Кульметьева, Э.Э. Досадина, О.Э. Дубовикова, А.А.Белов*
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия 125480, Москва, ул. Героев Панфиловцев, д. 20 , корп. 1
* e-mailABelov2004@ yandex.ru
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ И РАЗЛИЧНЫХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ НА СОХРАНЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТОВ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО КОМПЛЕКСА ИЗ ГЕПАТОПАНКРЕАСА КРАБА ИММОБИЛИЗОВАННОГО НА ПОЛИСАХАРИДНЫЕ НОСИТЕЛИ
Изучено влияние температуры и условий иммобилизации на хитозансодержащие целлюлозные носители на ферментативную активность протеолитического комплекса из гепатопанкреаса краба. Рассчитаны эффективные константы скорости инактивации иммобилизованных форм при различных условиях. Установлена стабилизация хитозаном ферментов протеолитического комплекса гепатопанкреаса краба.
Ключевые слова: хитозан, целлюлоза, диальдегидцеллюлоза, протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба, иммобилизация, глицерин.
Проблема создания биологически активных волокнистых материалов в последние десятилетия вызывает опять возрастающий интерес. Широкое развитие исследований по приданию необходимых функциональных свойств (биологической
активности) именно целлюлозным волокнистым материалам обусловлено тем, что целлюлоза является доступным и распространенным в природе и широко применяемым в медицине полимерным материалом. Исследования, посвященные синтезу производных целлюлозы, содержащих антимикробные или другие лекарственные (терапевтические) вещества, разработке научных основ получения целлюлозных волокнистых материалов с заданными лечебными свойствами, методов и технологии их изготовления, а также изучению свойств и наиболее эффективных областей применения указанных материалов имеют большое научное и практическое значение [1-4].
Иммобилизованные ферменты являются перспективными средствами медикаментозного лечения вследствие их чрезвычайно высокой биологической активности и специфичности, они не обладают аллергены ми свойствами и являются более высокоэффективными средствами по сравнению с традиционными методами лечения [1,3]. В подавляющем большинстве случаев активность ферментов при иммобилизации снижается. Инактивация может наступить в результате модификации важных для катализа аминокислотных остатков, расположенных в активном центре или непосредственной близости от него. Причины этих явлений достаточно изучены [1]. Изменение активности ферментов в результате иммобилизации может происходить и из-за изменения пространственной структуры фермента.
В работе использовали - протеолитический комплекс из гепатопанкреаса краба (ПК)(ТУ 9281004-11734126-00, НПО "Биопрогресс" МО г.
Щелково, Россия), хитозан (Хт) производства НПО "Биопрогресс" (ТУ 9289-067-00472124-03, г. Щелково, МО, РФ) (влажность препарата 10%, степень деацилирования 80,0%; кинематическая вязкость не менее 383,7 сСт; молекулярная масса 478 кДа). Все остальные реактивы, если не оговорено особо, отечественного производства, квалификации не ниже "ХЧ". Активацию целлюлозного носителя в виде тканых полотен (медицинской марли) проводили перйодатом натрия, в результате чего получали диальдегидцеллюлозу (ДАЦ) требуемой степени модификации вторичных спиртовых групп [5,6]. Количество альдегидных групп на носителях определяли аналогично [1,6] окислением последних раствором йода в слабощелочной среде (0,1Н. раствор Na2B4O7), либо с помощью 3,5-динитросалициловой кислотой (ДНСК) [7] и выражали в мМ/г с учетом влажности носителя. Иммобилизацию поводили аналогично [1]. Было исследовано изменение ферментативной активности (ФА) в процессе иммобилизации, высушивании и хранении иммобилизованных препаратов ПК. На рисунке 1 приведены зависимости изменения ФА иммобилизованных (стабилизированных)
препаратов. Ферментативную активность иммобилизованных препаратов определяли, как описано в [1], в 1/15М фосфатном буферном растворе (1/15М ФБ) рН-8,0; используя в качестве субстрата либо азоколл, либо казеин, либо синтетический субстрат паранитроанилид К-бензоил^Т-аргинина (BApNA). В табл. 1 и 2 приведены полученные данные о влиянии глицерина (при получении иммобилизованного препарата) на ФА при хранении при различных температурах.
Можно условно выделить, для наших образцов, три основных стадии изменения ФА иммобилизованного препарата в процессе иммобилизации, высушивания и хранения.
Рис. 1. Изменение ферментативной активности ферментов ПК в процессе высушивания и хранения при г.! Таблица 1. Эффективные константы скорости инактивации ( мес-1) модифицированных и немодифицированных
Препарат к, к1 к2
ПК* 3,9 0,55 0,033
ПК-Хт (иммоб)* 1,0 0,14 0,012
ПК-Хт (гель)* 1,3 0,23 0,011
ПК-Хт+2%Гл (гель)* 0 0 0,073
ПК-Хт+5%Гл (гель)* 0 0 0,033
ДАЦ(0,32)-Хт-ПК* 30,1 0,38 0,074
Ц(0,008)-ПК** 20,9 0,14 0,060
ДАЦ(0,22)-ПК** 24,6 0,3 0,04
Ц(0,008)-Хт-ПК** 9,85 0,10 0,057
ДАЦ(0,20)-Хт-ПК** 23,3 0,07 0,04
ДАЦ(0,35)-Хт-ПК*** 12,0 0,12 0,089
-субтрат азоколл, **-субстрат казеин, ***-субстрат ВАрКа; в скобках содержание альдегидных групп-мМ. Таблица 2. Эффективные константы скорости инактивации ( мес-1) иммобилизованных образцов в процессе хранения
Препарат ДАЦ(0,32)-Хт-ПК ДАЦ(0,32)-Хт(5%Гл)-ПК
Температура хранения, °С 5 25 37 5 25 37
к1 (казеин), мес-1 0 0,10 0,45 0 0,056 0,12
к2 (казеин), мес-1 0 — — 0 — —
к, (ВАрШ), мес-1 0 0,0063 0,083 0 0,023 0,079
к2 (ВАрШ), мес-1 0 — — 0,049 — —
Кинетика инактивации иммобилизованных ферментов, в процессе хранения, описывается характерной для гидролаз сложной
экспоненциальной (Ат/Ао= е-кат + а1*е-к1т + а2*е-к2т) зависимостью [1], где к1 характеризует лабильную часть ПК, а к2- стабильную.
В Хт присутствуют функциональные группы, такие как: -ОН; -КЫСОСИз; -КШ. Для того чтобы белки взаимодействовали с Хт, их pI должна быть ниже pKa Хт, чтобы их заряды были противоположными. Значения pKa Хт, которые встречаются в литературе, варьируют от 6,2 до 7,0. Это зависит от Хт и условий измерения. Белки являются заряженными молекулами, поэтому их взаимодействие (адсорбция, образование
ковалентных или нековалентных коньюгатов) с молекулой Хт, Ц, ДАЦ будет зависеть по-видимому от их заряда. Адсорбция - это процесс в котором принимают участие ионные взаимодействия, водородные связи, силы Ван-дер-Ваальса и гидрофобные взаимодействия. Многие данные говорят о том, что максимум адсорбции белка в водной среде на не- заряженный полисахарид происходит при рН раствора близком к изоэлектрической точке белка. Ковалентная связь между белком и полисахаридом является специфическим, сильным и устойчивым
взаимодействием. Ковалентная связь между двумя биополимерами имеет целью образование стабильного коньюгата, который сочетает свойства
гидрофобного белкового компоненита и гидрофильного полисахарида. Нековалентные взаимодействия проявляются как сумма множественных взаимодействий между группами биополимеров. Эти взаимодействия могут быть ионными, биполярными, силами Ван-дер-Ваальса, водородными мостиками или гидрофобными. Результатом может быть слабая связь (обратимая) или сильная (слабо обратимая). Это зависит от условий водной среды. Условиями для образования комплексов являются следующие: значение рН, вид полимера, концентрация полимера, температура, время реакции ии ионная сила. Когда белок реагирует
с противоположно заряженным полиэлектролитом с образованием полиэлектролитного комплекса, происходит структурное изменение: дестабилизация или стабилизация [8].
Из полученных данных видно, что добавление Гл уменьшает количество иммобилизованных белков ПК, и как следствие снижение ферментативной активности препарата. Добавки Гл способствуют сохранению ФА иммобилизованных форм при хранении, особенно при повышенных температурах и длительном хранении.
Кульметьева Маргарита Анатольевна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Досадина Элина Эльдаровна, студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Дубовикова Олеся Эдуардовна студент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва Белов Алексей Алексеевич д.т.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
1. Belov A.A. Textile materials containing immobilized hydrolases for medical and cosmetic purposes. Production. Properties. Application. //LAP LAMBERT Acad. Pub., GmbH &Co. KG, Germany. - 2012. - P. 242;
2. Тлупова З.А. Новые композиционные материалы на основе диальдегидцеллюлозы и гуанидин-содержащих соединений: авторефер. дис. ... канд хим. наук./ Тлупова З.А. - Нальчик, 2013. - 22 с.
3. Назаренко Г.И. Рана. Повязка. Больной. / Г.И.Назаренко, И. Ю. Сугурова, С.П.Глянцев - Медицина. - 2002. - С. 469.
4. Boateng J.S., Matthews K.H., Stevens H.N.E., Eccleston G.M. Wound Healing Dressings and Drug Delivery Systems:A Review // J. of Pharmaceutical Sciences - 2008. - Vol. 97. - №.8. - P. 2892-2923.
5. Роговин З.А. Химия целлюлозы. - М.: Химия, 1972. - С.125-244.
6. Rutherford H.A., Minor F.W., Martin A.R. and Harris M. Oxidation of cellulose: the reaction of cellulose with periodic acid //J. of res. of the N. B. S.-1942. -Vol. 29. - P. 131-143.
7. Miller G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar // Anal. Chem. - 1959, Vol.31, №3.- P. 426- 428.
8. Хитин и хитозан: Природа, получение и применение. Материалы проекта CYTED IV. 14: «Хитин и хитозан из отходов переработки ракообразных» Под ред. M.Sc. Ana Pastor de Abram (Перу), РХО, Щелково, 2010, с.292.
Kulmetieva Margarita Anatolievna, Dosadina Elina El'darovna, Dubovikova Olesya Eduardovna, Belov Alexey Alexeevich
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. *e-mail: ABelov2004@ yandex.ru
TEMPERATURE AND DIFFERENT PHYSIOLOGICALLY ACTIVE COMPOUNDS INFLUENCE ON THE ENZYMATIC ACTIVITY PRESERVATION OF THE ENZYMES OF PROTEASE COMPLEX FROM HEPAROPANCREAS OF CRAB IMMOBILIZED ON THE POLYSACCHARIDE CARRIERS
Abstract
Influence of temperature and immobilization on the chitosan containing cellulose carriers on the enzymatic activity of protease complex from hepatopancreas of crab was studied. The effective rate constants of immobilizated forms were calculated under different conditions. It was stated that chitosan stabilizes the enzymes of protease complex from hepatopancreas of crab.
Key words: chitosan, cellulose, dialdehyde cellulose, protease complex from hepatopancreas of crab, immobilization, glycerin.
