CC BY
32
УДК 582.84
ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО СТРЕССА НА РАЗВИТИЕ КУЛЬТУР РЕДКИХ ВИДОВ КСИЛОТРОФНЫХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ
Ильин Д. Ю., канд. биол. наук, доцент; Ильина Г. В., доктор биол. наук, профессор; Морозова М. И., аспирант; С. А. Сашенкова, канд. биол. наук, доцент; Л. В. Гарибова*, доктор биол. наук, профессор
ФГБОУ ВПО «Пензенская ГСХА», Россия; * ФГБОУ ВПО «МГУ им. М. В. Ломоносова», Россия, е-таИ: [email protected]
Приводится информация, полученная при исследовании адаптивных свойств культур редких видов ксилотрофных базидиомицетов в лабораторных условиях. Авторами было проведено моделирование условий температурного стресса мицелия. В ходе исследований изучено влияние повышенных температур и воздействие температурных градиентов на растущий мицелий (проведено культивирование при разных темпах возрастания температуры). При культивировании штаммов изученных видов грибов при +32°С наблюдалось угнетение дегидрогеназной активности мицелия, изменение жирнокислотного состава в сторону увеличения доли насыщенных жирных кислот. Установлена взаимосвязь между темпами возрастания температуры и интенсивностью окислительного стресса культур.
Действие такого фактора, как температурный стресс, стимулирует формирование на мицелии покоящихся вегетативных структур, которые, прорастая, дают начало мицелию, склонному к формированию телеоморфы. В лабораторных условиях доказана связь между окислительным стрессом мицелия и стимуляцией процессов плодообразования. Это дает основания предполагать связь между действием факторов ненаправленного действия (засуха, пирогенный фактор) и процессами плодообразования у редких видов ксилотрофных базидиомицетов в природе.
Ключевые слова: ксилотрофные базидиомицеты, охрана редких видов, окислительный стресс, жирные кислоты.
Введение.
На территории Пензенской области отмечены локальные популяции редких видов ксилотрофных базидиомицетов, включенных в Красные книги РФ и Пензенской области [1, 2, 3]. Среди них, как в экологическом плане, так и с позиций биотехнологии, особое значение имеют Ganoderma lucidum (Curtis) P. Karst. (трутовик лакированный), Sparassis crispa (Wulfen) Fr. (спа-рассис курчавый, грибная капуста) и Grifola frondosa (Dicks.) Gray (грифола курчавая, гриб-баран). Плодоношение практически всех видов из перечня редких для Пензенской области отмечено в 2010, а некоторых - в 2010 и 2011 гг. На наш взгляд, процесс плодоношения был стимулирован влиянием аномально высоких температур и пиро-генным эффектом (на территории большинства местообитаний в 2010 г. происходили обширные низовые пожары) [4]. Ба-зидиома S. nemecii, вида, впервые описанного на территории Пензенской области и РФ, была обнаружена на практически выгоревшей территории. Установленные закономерности свидетельствуют, что плодоношение редких видов связано с дейст-
вием климатических факторов, сочетания которых можно рассматривать как стрессо-генные, а также стимулировать наступление стадии телеоморфы у таких видов могут стрессовые факторы ненаправленного действия (в частности, пирогенный фактор). Правильность этих предположений может быть подтверждена или опровергнута в ходе лабораторных исследований, связанных с моделированием условий температурного стресса.
Методы исследований.
В цикл лабораторных экспериментов были включены три природных изолята G. lucidum (штаммы Gl+, GD-10, GM-11), выделенные соответственно в 2005, 2010 и 2011 гг.; три изолята S. crispa (штаммы SC-10, АИ-10, АИ-11), выделенные в 2010 и 2011 гг. Также объектом исследований стал изолят G. frondosa (штамм Grf-11), выделенный в 2011 г. из плодового тела, найденного впервые после 25-летнего, согласно наблюдениям А. И. Иванова, отсутствия плодоношения вида в единственном известном местообитании [5-8].
При сборе плодовых тел использовались маршрутные методы полевых ис-
следований. Определение грибов проводили с использованием определителей [9-12]. Систематическое положение видов определялось по системе, приведенной на сайте Index Fungorum [13]. Выделение, оценка ростовых показателей и хранение чистых культур для лабораторных исследований проводились по общепринятым методикам [14]. Определение уровня окислительного стресса культур проводили при помощи определения маркерного соединения - малонового диальдегида (МДА). МДА - продукт перекисного окисления липидов. Этот бифункциональный альдегид способен образовывать основания с аминогруппами белка, выступая в качестве сшивающего агента. Для определения концентрации МДА в мицелии использовали метод, основанный на взаимодействии МДА и тиобарбитуровой кислоты [15]. Дегидрогеназную активность мицелия оценивали при помощи гистохимической реакции с нитросиним тетразо-лием [16,17]. Качественную реакцию на наличие липидных перекисей проводили с использованием 2,7-диаминофлуорена [16]. Стрессовую реакцию получали при экспозиции мицелиальных культур в условиях температурных градиентов различной временной протяженности.
Статистическая обработка проводилась с помощью программы для обработки и анализа данных «Statistica 6.0».
Результаты исследований.
В ходе исследований, положенных в основу настоящей работы, стрессовую реакцию у грибов получали культивированием мицелия при повышенных температурах (+32°С), тогда как контрольные варианты выращивали при обычной средней, оптимальной для грибных культур температуре (+22°С). Еще одна серия экспериментов заключалась в экспозиции мицелиальных культур в условиях температурных градиентов различной временной протяженности.
В качестве маркера окислительного стресса использовали малоновый диаль-дегид (МДА). Предварительно проведенный методом газовой хроматографии анализ жирнокислотного состава мицелия выявил достаточное содержание ненасыщенных жирных кислот (моноено-вых, диеновых), являющихся потенциальными мишенями окислительной деструкции, в ходе которой, как промежуточный продукт, образуется МДА (табл. 1) [18]. Установлены некоторые отличия в жирнокислотном составе мицелия между штаммами изученных видов.
Таблица 1
Общий жирнокислотный состав мицелия (% от сухой массы) некоторых штаммов изученных видов (р<0,05, повторность трехкратная)
Жирная кислота Вид, штамм
G. lucidum, Gl+ S. crispa AI-10 G. frondosa, Grf-11
С 12:0 0,005 нет* нет
С 14:0 0,012 нет 0,015
С 15:0 0,014 нет 0,012
С 16:0 0,142 0,354 0,116
С 16:0 (2-ОН) 0,009 нет 0,001
С 16:1 0,019 0,013 0,015
С 18:0 0,128 0,033 0,045
С 18:1 0,156 0,028 0,089
С 18:2 0,312 0,299 0,186
С 18:3 0,009 0,015 0,012
С 20:1 0,006 нет 0,019
С 22:0 0,001 нет нет
С 24:0 0,011 нет нет
концентрация ниже обнаружения прибором
При культивировании штаммов изученных видов в течение 15 суток при +32°С наблюдалось замедление роста мицелия, стабильное угнетение дегидрогеназной активности. Нарастание концентраций МДА отмечалось до пятых-седьмых (у разных штаммов) суток развития, а затем они последовательно снижались на фоне направленного изменения пропорций жирных кислот в сторону увеличения доли насыщенных. С учетом уменьшения доли ненасыщенных жирных кислот, концентрации МДА, которые в опытных вариантах постепенно вышли практически на уровень контрольных, тем не менее следует рассматривать как иллюстрацию стресса (табл. 2).
Помимо снижения скоростей роста мицелия у всех изученных штаммов другими достаточно объективными свидетельствами стрессовой реакции служили снижение базофилии протоплазмы, а также активное формирование анаморфных структур культурами G. lucidum (бластоконидии) и S. crispa (бластоконидии, хламидоспоры) и появление артроспор у G. frondosa.
Однако наиболее существенные результаты получены в серии экспериментов с экспонированием мицелиальных культур в условиях температурных градиентов. Культуры сначала подращивались до стационарной фазы роста, после чего помещались в условия холодильника, где выдерживались в течение 168 ч. При выдерживании культур в условиях пониженных температур во всех случаях достоверно возрастала доля ненасыщенных жирных
Нива Поволжья № 4 (29) 2013 15
Таблица 2
Реакция мицелия на воздействие повышенных температур культивирования (сусло-агар, 32°С, 15 суток, р<0,05, повторность трехкратная, контроль - 22°С)
Оцениваемый показатель Сутки развития
3 5 7 9 11 13 15
G. lucidum, GD-10
Средняя скорость роста, % от контроля 98,5 78,5 77,4 43,9 37,2 33,0 30,1
Активность дегидрогеназ, баллы 5 4 4 3 3 2 2
Концентрация МДА, % от контроля 122,8 147,3 109,5 99,4 67,4 53,3 51,1
Доля непредельных жирных кислот, % от контроля 102,1 82,0 55,3 49,3 39,1 29,0 31,8
S. crispa, SC-10
Средняя скорость роста, % от контроля 76,4 60,3 47,1 33,3 30,6 27,1 9,4
Активность дегидрогеназ, баллы 4 3 2 1 1 1 1
Концентрация МДА, % от контроля 158,2 121,6 102,1 100,6 79,4 60,4 68,2
Доля непредельных жирных кислот, % от контроля 88,0 75,3 64,7 58,3 41,2 30,3 30,6
G. frondosa, Grf-11
Средняя скорость роста, % от контроля 104,5 98,8 75,7 66,6 68,3 62,1 57,8
Активность дегидрогеназ, баллы 5 4 4 4 4 3 2
Концентрация МДА, % от контроля 149,3 157,2 109,6 88,3 79,9 55,0 53,2
Доля непредельных жирных кислот, % от контроля 102,1 94,7 99,1 57,2 55,3 55,9 54,2
кислот в мицелии. Эта закономерность распространяется на все изученные культуры, однако наиболее контрастные значения получены для штамма Gl+ вида G. lucidum (табл. 3).
После указанного выше периода экспозиции в холодильнике часть культур была перенесена в термостат, где выдерживалась в течение 72 ч при температуре +32°С, при этом возрастание температуры окружающей среды происходило наиболее быстрыми темпами - 5,0°С/ч (первый вариант опыта), вторая часть выдерживалась в ус-
ловиях медленного ступенчатого повышения температуры (0,25°С/ч) до 22°С в холодильнике, а затем таким же образом в термостате - от 22°С до 32°С (второй вариант опыта). Контролем служили культуры, которые развивались при температуре 22°С. По истечении 72 ч такой экспозиции было определено содержание МДА в мицелии культур во всех вариантах опыта. Результаты эксперимента свидетельствуют, что интенсивность окислительного стресса максимальна в первом варианте. Такая закономерность характерна для всех штаммов
Таблица 3
Изменения в жирнокислотном составе мицелия G. lucidum, Gl+ под влиянием пониженных температур (р<0,05, повторность трехкратная)
Жирная кислота, % от сухой массы Условия экспозиции
22°С (контроль) 4°С в течение 12 ч 4°С в течение 24 ч
С 12:0 0,005 Нет* нет
С 14:0 0,012 0,005 0,002
С 15:0 0,014 0,007 нет
С 16:0 0,142 0,100 0,110
С 16:0 (2-ОН) 0,009 нет нет
С 16:1 0,019 0,025 0,039
С 18:0 0,128 0,121 0,086
С 18:1 0,156 0,188 0,169
С 18:2 0,312 0,431 0,439
С 18:3 0,009 0,034 0,051
С 20:1 0,006 0,013 0,015
С 22:0 0,001 нет нет
С 24:0 0,011 0,010 0,005
"Концентрация ниже обнаружения прибором
130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0
U
о
Í
<D &
12 24
36
48 60
72
Время, час.
МД А -1 i-1 МДА-2 С
контроль .......................................2 вариант —
□ МДА-К 1 вариант
Рис. 1. Интенсивность окислительного стресса мицелия G. frondosa, штамм Grf-11 в зависимости от темпов роста температуры окружающей среды (р<0,05, повторность трехкратная), объяснения в тексте
всех изученных видов, однако результаты наиболее контрастны у G. frondosa (рис. 1).
Установленные в лабораторных модельных условиях взаимосвязи между воздействиями стрессовых факторов, и, в частности, темпов изменения температуры окружающей среды с интенсивностью окислительного стресса культур, могут иметь определенное значение и в природных условиях. Таким образом, установлена взаимосвязь между темпами возрастания температуры и интенсивностью окислительного стресса культур.
Обнаруженная ранее стимуляция образования анаморфных структур на мицелии в ответ на стрессовое воздействие приобрела особое значение при изучении плодо-
ношения в чистой культуре. Зафиксирован вторичный рост желтоватого мицелия (поросшего из бластоспор) поверх первичного у штаммов G. lucidum, рост плотного комковатого мицелия (из хламидоспор) поверх паутинистого у штаммов S. crispa, на основе которых формировались зачатки плодовых тел (рис. 2 а, б, в).
Такие структуры на мицелии были получены путем температурного стресса. Стимуляция плодоношения была наиболее отчетливо заметна в условиях резкого повышения температуры окружающей среды. Таким образом, в лабораторных условиях доказана связь между окислительным стрессом мицелия и стимуляцией процессов плодообразования.
а)
б)
в)
Рис. 2. Рост вторичного мицелия и формирование примордиев на стерильной питательной среде после температурного стресса: а) G. lucidum, штамм Gl+, б, в) S. crispa, штамм АИ-10 (на разных этапах развития)
0
Нива Поволжья № 4 (29) 2013 17
Вывод.
Стрессовые констелляции микроклиматических факторов могут играть корригирующую роль, на физиологическом и моле-кулярно-биохимическом уровне изменяя темпы и направленность протекания онтогенетических процессов в мицелии. Воз-
можно также наличие триггерных воздействий стрессовых факторов по отношению к наступлению стадии телеоморфы. Такое предположение подтверждено нами в модельных условиях.
Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 12-04-97078-р_поволжье_а.
Литература
1. Красная книга РСФСР. Растения. - М.: Росагропромиздат, 1988. - 590 с.
2. Красная книга Пензенской области. Т.1. Редкие виды растений и грибов. - Пенза, 2002. -296 с.
3. Красная книга РФ (растения и грибы). - М.: Товарищество научных изданий КМК, 2008. - 612 с.
4. Иванов, А. И. Биота макромицетов лесостепи правобережного Поволжья / А. И. Иванов: Автореф. дис... доктора биол. наук. - М., 1992. - 34 с.
5. Ильина, Г. В. Коллекция культур базидиальных макромицетов (Basidiomycota) Пензенской ГСХА. Каталог видов и штаммов /Г. В. Ильина, Д. Ю. Ильин, А. В. Скобанев. - Пенза, 2009. - 64 с.
6. Гарибова, Л. В. Региональные коллекции мицелиальных культур как возможность сохранения природного разнообразия штаммов базидиомицетов / Л. В. Гарибова, Г. В. Ильина // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2009; - № 1. - С. 38-39.
7. Проблемы сохранения видов ксилотрофных базидиомицетов, занесенных в Красную книгу Пензенской области / Д. Ю. Ильин, А. И. Иванов, М. И. Морозоваи др. // Нива Поволжья. - 2012 г. № 4(25); -С. 20-26.
8. Редкие виды ксилотрофных базидиомицетов Пензенской области и проблема их сохранения / Г. В. Ильина, А. И. Иванов, Д. Ю. Ильин и др.// Современная микология в России: тезисы докладов. - М., 2012. - С. 110.
9. Бондарцев, А. С. Трутовые грибы европейской части СССР и Кавказа / А. С. Бондарцев. -М.: Изд-во АН СССР, 1953. -1106 с.
10. Бондарцева, М. А. Определитель грибов СССР. Порядок афиллофоровые. Вып. 1 (семейства гименохетовые, лахнокладиевые, кониофоровые, щелелистниковые) / М. А. Бондарцева, Э. Х. Пармасто. - Л.: Наука, 1986. -192 с.
11. Бондарцева, М. А. Определитель грибов России. Порядок афиллофоровые / М. А. Бондарцева. - С-Пб.: Наука, 1998. - 391 с.
12. Jülich, W. Die Nichtblatterpilze, Gallerpilze und Bauchpilze. Aphyllophorales, Heterobasidiomy-cetes, Gasteromycetes / W. Jülich. - Jena: Gustav Fischer, 1984. -625 s.
13. http://www. indexfungorum. org/Names/Names. asp
14. Бухало, А. С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре / А. С. Бухало. - Киев: -Наукова думка, 1988. - 144 с.
15. Michara, M. Thiobarbituric and value on frech homohgenate of rat as a perameter of lipidperoxi-dation in aging, CCL4 intoxication and vitamin E deficiency / M. Michara, M. Uchiyama // Biolchem. Med. - 1980. - V. 23(3). - P. 302-311.
16. Пирс, Э. Гистохимия / Э. Пирс. - М.: Издательство иностранной литературы, 1962. - 962 с.
17. Барыкина, Р. П. Основы микротехнических исследований в ботанике: справочное руководство / Р. П. Барыкина, Т. Д. Веселова, Х. Х. Джалилова. - М.: МГУ, 2000. - 127 с.
18. Овчинников, Ю. А. Биоорганическая химия / Ю. А. Овчинников. - М.: Просвещение, 1987. -815 с.
UDK 582.84
THE INFLUENCE OF TEMPERATURE STRESS ON THE DEVELOPMENT OF CULTURES OF XYLOTROPHIC BASIDIOMYCETES RARE SPECIES
D. U. Ilyin, Candidate of Biological Sciences; G. V. Ilyina, Doctor of Biological Sciences, professor;
M. I. Morozova, graduate student; S. A. Sashenkova, Candidate of Biological Sciences,
Associate Professor; L. V. Garibova*, Doctor of Biological Sciences, professor
Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Training «Penza State Agricultural Academy», e-mail: [email protected];
*Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Training «Moscow State University named after M. V. Lomonosov»
The article provides the information obtained during the investigation of the adaptive properties of the rare species of xylotrophic basidiomycetes crops in the laboratory. The authors have simulated the conditions of temperature stress of mycelium.
The studies examined the impact of high temperatures and exposure to temperature gradients on the growing mycelium (cultivation was held at different rates of the temperature increase). When culturing the studied strains species by +32C there was observed the inhibition of dehydrogenase activity of the mycelium, the change of fatty acid composition in the direction of increasing the proportion of saturated fatty acids. The relationship between the rate of temperature increase and the intensity of oxidative stress of cultures was established. The effect of such factors as temperature stress stimulates the formation of dormant vegetative mycelium on structures that germinate give rise to the mycelium, prone to the formation of fruit bodies. In the laboratory, the link between oxidative stress mycelium and fruiting processes of stimulation was proven. This suggests the connection between the action of non-directional factors (drought, pyrogenic factor) and fruiting processes in rare xylotrophic basidiomycetes in nature.
Keywords: xylotrophic basidiomycetes, protection of rare species, oxidative stress, fatty acid.
References:
1. The Red Book of the Russian Federation. Plants. M. Rosagropromizdat, 1988. - 590 p.
2. The Red Book of the Penza region. V.1. Rare species of plants and fungi. Penza, 2002. - 296 p.
3. The Red Book of the Russian Federation (plants and fungi). Moscow: KMK Scientific Press Ltd., 2008. - 612 p.
4. Ivanov, A. I. The Biota of macromycetes of the right bank of the Volga region forest-steppe / A. I. Ivanov- Dissertation of Doctor of biological Sciences. Moscow, 1992. - 34 p.
5. Ilyina, G. V. Collection of Basidial Macromycetes Culture (Basidiomycota) of Penza State Agricultural Academy. Directory of species and strains / G. V Ilyina, D. U. Ilyin, A. V. Skobanev. -Penza, 2009. - 64 p.
6. Garibova, L. V. Regional collections of filamentous cultures as an opportunity to preserve the natural diversity of strains of basidiomycetes / L. V. Garibova, G. V. Ilyina // Immunopathology, allergology, infektolology. - 2009, № 1. - P. 38-39.
7. Ilyin, D. U. Problems of Conservation of xylotrophic basidiomycetes listed in the Red Book of the Penza region (article) / D. U. Ilyin, A. I. Ivanov, MI Morozova, G. V. Ilyina, L. V. Garibova / / «Niva Povolzhya» № 4 (25), 2012. -P. 20-26.
8. Ilyina, G. V. Rare species of xylotrophic basidiomycetes in Penza region and the problem of their conservation / G. V. Ilyina, A. I. Ivanov, D. U. Ilyin, M. I. Morozova, L. V. Garibova / Modern mycology in Russia. Abstracts. - M., 2012. - P. 110.
9. Bondartsev, A. S. Bracket fungi of the European part of the USSR and the Caucasus / A. S. Bondartsev. - Moscow: Publishing House of the USSR Academy of Sciences, 1953. - 1106 p.
10. Bondartseva, M. A. The Qualifier of fungi of the USSR. The Aphyllophoraceous Series. (families gimenohetovye, lahnokladievye, konioforovye, schelelistnikovye) / M. A Bondartseva, E. H. Parmasto. -Leningrad: Nauka, 1986. -192 p.
11. Bondartseva, M. A. The Qualifier of fungi of Russia. The Aphyllophoraceous Series. / M. A. Bondartseva. - Saint-Petersburg. Nauka, 1998. - 391 p.
12. Jülich, W. Die Nichtblatterpilze, Gallerpilze und Bauchpilze. Aphyllophorales, Heterobasidiomy-cetes, Gasteromycetes / W. Jülich. - Jena: Gustav Fischer, 1984. - 625 s.
13. http://www. indexfungorum. org/Names/Names. asp
14. Bukhalo, A. S. Higher edible Basidiomycetes in pure culture / A. S. Buchalo. - Kiev: Naukova Dumka, 1988. - 144 p.
15. Michara, M. Thiobarbituric and value on frech homohgenate of rat as a perameter of lipidperoxidation in aging, CCL4 intoxication and vitamin E deficiency / M. Michara, M. Uchiyama // Biolchem. Med. 1980. V. 23 (3). - P. 302-311.
16. Pearse, E. Histochemistry / E. Pearse. - Moscow: Foreign Literature Publishing House, 1962. -962 p.
17. Barykina, R. P. Basics of Mikrotechnical Research in Botany. Reference / R. P. Barykina, T. D. Veselova, H. H. Dzhalilova. - Moscow: Moscow State University, 2000. - 127.
18. Ovchinnikov, Y. A. Bioorganic chemistry / Y. A. Ovchinnikov. - M.: Prosveschenie, 1987. - 815 p.
Нива Поволжья № 4 (29) 2013 19
