CC BY
57
ВЛИЯ НА ПР1
[ИХ ВЕЩЕСТВ Ю-РАДИКАЛЬНЫХ 1А, структуру печени ю с лимфосаркомой
-006.444
ковцева, к.б.н., ассистент кафедры биологии;
Иванова, к.б.н., доцент кафедры биологии;
Т.Г. Щербатюк, д.б.н., профессор, зав. кафедрой биологии
Нижегородская государственная медицинская академия, Н. Новгород
Цель исследования — изучить действие янтарной кислоты и олигосахарида хитозана сукцинат-аскорбата на активность свободнорадикальных процессов организма, структуру печени и на опухоли крыс с лимфосаркомой Плисса.
Материалы и методы. Исследуемые вещества животные получали с 3-х суток после трансплантации опухоли (100 мг/кг, 7 сут). Свободно-радикальный статус организма оценивали через сутки после окончания манипуляций методом индуцированной хемилюми-несценции. Для изучения структур печени и опухоли использованы методы морфометрического анализа.
Результаты. Установлена эффективность применения в ранние сроки роста опухоли комплекса олигосахарида хитозана сукцинат-аскорбата, который способствует поддержанию свободно-радикального баланса организма в норме и приводит к ослаблению дистрофических и усилению регенерационных процессов в печени экспериментальных животных, а также стимулирует деструкцию ткани лимфосаркомы Плисса.
Ключевые слова: сукцинат, хитозан, свободно-радикальные процессы, опухоль, печень, лимфосаркома.
English
Influence of the succinate-containing substances on activity of the organism free-radical processes, a structure of the liver and on tumor of rats with the Pliss lymphosarcoma
O.M. Moskovtseva, c.b.s., assistant of a biology chair;
N.L. Ivanova, c.b.s., assistant professor of a biology chair;
T.G. Sherbatyuk, B.D., professor, head of a biology chair
Nizhny Novgorod state medical academy, N. Novgorod
Aim of investigation is a study of the amber acid and succinate-ascorbate chitosan oligosaccharide effect on activity of the organism free-radical processes, a structure of the liver and tumor of rats with the Pliss lymphosarcoma.
Materials and methods. The animals have been receiving the investigating substances since the 3d day after the tumor transplantation (100 mg/kg, 7 days). A free-radical status of the organism was assessed in a day after the manipulation termination by the induced chemiluminescence method. The morphometric analysis methods are used for a structure of the liver and tumor study.
Results. An effectiveness of a succinate-ascorbate chitosan oligosaccharide complex use in the early dates of a tumor growth, favoring a support of the organism free-radical balance in norm and leading to weakening of dystrophic and intensification of regeneration processes in the liver of experimental animals, as well as stimulating a destruction of the Pliss lymphosarcoma tissue, is established.
Key words: succinate, chitosan, free-radical processes, tumor, liver, lymphosarcoma.
Для контактов: Московцева Ольга Михайловна, тел. моб. +7 908-156-30-03; e-mail: [email protected].
24 СТМ J 2010 - 3 О.М. Московцева, Н.Л. Иванова, Т.Г. Щербатюк
К настоящему времени доказано, что возникновение и рост злокачественных новообразований сопровождаются активацией свободно-радикальных процессов [1—3]. Печень, являясь органом с высокой энергетической потребностью и интенсивным окислительным метаболизмом, в условиях окислительного стресса подвержена значительным нарушениям [4]. Снижение функциональной активности печени в организме, пораженном злокачественной опухолью, происходит в результате комплекса изменений в метаболизме гепа-тоцитов, связанного с нарушением энергетического обмена (снижение содержания АТФ, повышение — АДФ) [5—6], ослаблением дыхания [5—7], снижением окислительного фосфорилирования, ускорением гликолиза [5, 8] и увеличением содержания продуктов свободно-радикального окисления [5], вызывающих дистрофические и атрофические процессы в гепатоцитах [9]. Таким образом, анализ изменений структуры ткани печени важен для описания степени дистресса в организме.
В связи с тем, что янтарная кислота (ЯК) является энергетическим субстратом, мощность системы энергопродукции которого в сотни раз превосходит все другие системы энергообразования организма, а также обладает детоксицирующим, антигипоксическим и антиокси-дантным свойствами [10], представляет интерес оценка возможностей ее применения для коррекции свободнорадикальных процессов в организме-опухоленосителе.
Цель исследования — изучить действие янтарной кислоты и олигосахарида хитозана сукцинат-аскорбата на активность свободно-радикальных процессов крови, а также на состояние печени и опухоли экспериментальных животных с лимфосаркомой Плисса.
Материалы и методы. Эксперименты проведены на 42 белых нелинейных крысах-самцах массой 270±25 г. Модель неоплазии создавали путем перевивки опухолевого штамма лимфосаркомы (ЛФС) Плисса, приобретенного в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). Штамм пассировался на крысах в возрасте 3 мес. Для инокуляции крысе-реципиенту ЛФС брали на 14-й день роста.
Подопытные животные были распределены на группы: 1-я — интактная (п=12); 2-я — контроль (п=10) — животные с ЛФС (срок роста опухоли — 11 дней), получавшие воду; 3-я — опыт-1 (п=10) — животные с ЛФС Плисса, получавшие ЯК (сукцинат); 4-я — опыт-2 (п=10) — животные с ЛФС Плисса, получавшие олигосахарид хито-зана сукцинат-аскорбат (ОХСА) — водорастворимый продукт, в котором олиго^-глюкозамин (70%), сукцинат (15%) и аскорбиновая кислота (15%) находятся в ионной связи друг с другом. Животные опытных групп получали исследуемые вещества с 3-х суток после трансплантации опухоли. Растворы веществ вводили внутрижелу-дочно с помощью зонда в дозе 100 мг/кг массы тела ежедневно, курсом 7 сут. Животные интак-тной и контрольной групп получали через зонд чистую воду. Результаты воздействий оценива-
ли на следующий день после окончания манипуляций. Работу с экспериментальными животными проводили согласно Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях [11].
Свободно-радикальный статус организма оценивали по максимальной интенсивности хемилюминесцентно-го свечения (Imax) и общей антиоксидантной активности (АОА) плазмы крови методом индуцированной хеми-люминесценции [12] на биохемилюминометре БХЛ-07 (Н. Новгород) [13].
На гистологических срезах, окрашенных гематоксилином и эозином, наряду с визуальным описанием тканей для объективной оценки эффекта вводимых препаратов проводили количественное изучение тканей опухоли и печени методами морфометрического анализа, основанного на принципах стереологии, с использованием окулярной морфометрической сетки С.Б. Стефанова, содержащей 25 узлов, при увеличении микроскопа 10х40х1,5 [14]. На площади препарата, ограниченной сеткой, подсчитывали: в печени — количество двуядерных гепатоцитов, общее число нормальных ядер гепатоцитов и ядрышек в них; в опухоли — число активных и погибающих клеток. Полученные данные были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 7.0 (Windows XP).
Результаты и обсуждение. Анализ результатов исследований свободно-радикальной активности плазмы крови животных с ЛФС Плиса через 11 сут после трансплантации опухоли выявил достоверное повышение значений Imax и снижение — АОА (рис. 1).
Введение исследуемых веществ крысам с 3-х суток после трансплантации ЛФС Плисса в дозе 100 мг/кг массы тела (курс 7 сут) снижало интенсивность свободно-радикальных процессов в плазме крови этих животных по сравнению с показателями у животных
Imax, мВ
АОА, отн. ед.
2,3
2,25
2,2
2,15
2,1
2,05
2
1,95
1,9
1,85
1,8
Интактная Контроль-11
- Imax;
0,05
0,045
0,04
0,035
0,03
0,025
ЯК
-AOA
ОХСА Группы животных
Рис.1. Imax и АОА плазмы крови экспериментальных животных на фоне введения ЯК и ОХСА
контрольной группы. Однако только введение комплекса ОХСА способствовало поддержанию интенсивности хемилюминесцентного свечения и АОА плазмы крови животных с ЛФС на уровне показателей животных ин-тактной группы (см. рис. 1).
Расширение адаптационных возможностей организма на раннем сроке роста опухоли посредством введения сукцинатсодержащих веществ также подтверждено результатами морфометрического анализа тканей печени и опухоли (см. таблицу, рис. 2).
Морфометрические показатели тканей печени и опухоли экспериментальных животных
Группы животных Нормальные ядра гепатоцитов Суммарный объем ядер Двуядерные гепатоциты Активные клетки опухоли Погибающие клетки опухоли
Интактная (n=12) 6,60±0,24 2,00±0,24 0,13±0,01 — —
Контроль-11 (n=10) 3,35±0,10** 1,50±0,21** 0,12±0,01 33,6±2,3 2,9±0,7
ЯК (n=10) 4,13±0,20* 1,54±0,24 0,04±0,01* 35,3±3,6 1,9±0,6
ОХСА (n=10) 5,52±0,28* 2,00±0,13* 0,20±0,02* 17,8±1,5* 13,6±1,3*
* — различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой, р=0,05; ** — по сравнению с группой интактных животных, р=0,05.
рис. 2. Структура печени (а), ув. 600, и опухоли (б), ув. 150, экспериментальных животных на фоне введения сукцинатсодержащих веществ. Окраска гематоксилином и эозином
26 СТМ j 2010 - 3 О.М. Московцева, Н.Л. Иванова, Т.Г. Щербатюк
Проведенные морфологические исследования выявили выраженные патологические изменения в ткани печени крыс с ЛФС Плисса (срок роста опухоли — 11 сут): большинство гепатоцитов характеризовались некротическими изменениями, при этом в ядрах отмечались дистрофия разной формы (кариопикноз, кариолизис) и гидропическая дистрофия цитоплазмы (рис. 2, а).
Морфометрический анализ ткани печени животных контрольной группы показал уменьшение количества нормальных ядер гепатоцитов в 2 раза по сравнению с животными интактной группы, хотя средний объем клеток достоверно не изменился, что может свидетельствовать о дегенеративных изменениях значительной части паренхимы (см. таблицу).
У крыс с ЛФС Плисса, получавших раствор ЯК, выявили статистически значимое увеличение количества нормальных гепатоцитов — в 1,2 раза по сравнению с показателями животных контрольной группы ф^0,05), что, вероятно, было следствием деления двуядерных клеток печени, число которых уменьшилось в 3 раза по сравнению с контролем ф^0,05). У животных, получавших ЯК, наблюдалась слабая дистрофия гепатоцитов с очагами некрозов, инфильтрацией в области сосудов, но по сравнению с показателями животных-опухолено-сителей большинство паренхиматозных клеток печени имели крупные ядра.
Введение животным комплекса ОХСА на фоне белковой дистрофии гепатоцитов и очаговых некрозов паренхимы печени стимулировало выраженные регенерационные процессы в органе, о чем свидетельствовало большое количество двуядерных клеток, гепатоцитов с увеличенными гиперхромными ядрами с плотной базофильной цитоплазмой, крупными ядрышками. Так, на фоне введения комплекса ОХСА было отмечено большее количество, по сравнению с контролем, нормальных (в 1,6 раза) и двуядерных (в 1,7 раза) гепатоцитов (с увеличенными гиперхром-ными ядрами и плотной базофильной цитоплазмой) ^0,05). Полученные данные свидетельствуют об активирующем влиянии ОХСА на регенерационные процессы в печени, что, возможно, объясняется наличием в этом комплексе полисахарида, усиливающего, по данным Д.Н. Маянского и В.И. Щербакова [15], ре-паративные процессы.
Введение ОХСА на раннем сроке роста ЛФС Плисса приводило к деструктивным изменениям ткани опухоли (см. таблицу, рис. 2, б).
Гистологическое исследование ЛФС Плисса в контрольной группе показало: опухоль состоит из тесно прилегающих друг к другу лимфоидных клеток мелкой округлой формы с круглыми ядрами, занимающими почти целиком базофильную цитоплазму. В отдельных участках опухоли встречаются небольшие зоны некроза со слабо выраженной лимфоцитарно-макрофагаль-ной инфильтрацией.
Введение крысам исследуемых веществ с 3-х суток после трансплантации ЛФС Плисса в дозе 100 мг/кг массы тела (курс 7 сут) незначительно ингибировало рост опухоли (на 16% — ЯК и 21% — ОХСА), однако
существенно изменяло структуру опухолевой ткани у крыс, получавших ОХСА. Так, применение комплекса ОХСА вызывало обширные очаги некроза опухоли, с обильной инфильтрацией соединительнотканными элементами, в которых опухолевые клетки характеризовались выраженными дистрофическими изменениями. Следует отметить, что деструкция ткани опухоли на фоне введения ОХСА проявилась в достоверном увеличении числа гибнущих клеток опухоли (в 4,7 раза) на фоне снижения количества активных клеток опухоли (в 1,5 раза).
Введение ЯК животным с ЛФС Плисса привело к замедлению прорастания опухоли в жировую клетчатку. В опухоли животных этой группы количество активных клеток не изменилось, но уменьшилось число гибнущих клеток — в 1,3 раза по сравнению с контрольной группой.
Заключение. Сравнительное изучение биологического действия сукцинатсодержащих веществ на экспериментальной модели злокачественного роста выявило:
1) рост экспериментальной опухоли лимфосарко-мы Плисса приводит к дистрофическим и дегенеративным изменениям в печени крыс на фоне повышения активности свободно-радикальных процессов в организме;
2) на фоне введения животным янтарной кислоты в дозе 100 мг/кг массы тела (курсом 7 сут, с 3-х суток после трансплантации лимфосаркомы Плисса) активность свободно-радикальных процессов плазмы крови изменяется незначительно, число гепатоцитов на тест-площади препарата увеличивается за счет уменьшения числа двуядерных клеток печени, но при этом снижается количество гибнущих клеток опухоли в 1,3 раза;
3) применение комплекса олигосахарида хитозана сукцинат-аскорбата в дозе 100 мг/кг массы тела (курсом 7 сут) на ранних сроках роста лимфосаркомы Плисса способствует поддержанию свободно-радикального баланса организма на уровне показателей интактных животных, что приводит к ослаблению дистрофических и усилению регенерационных процессов (увеличение количества одноядерных и двуядерных гепатоцитов на 65 и 67% соответственно) в печени экспериментальных животных, а также стимулирует деструкцию ткани лимфосаркомы Плисса (увеличение числа гибнущих клеток опухоли в 4,7 раза на фоне снижения количества активных клеток опухоли на 47%).
Литература
1. Барабой В.А. Стресс: природа, биологическая роль, механизмы, исходы. Киев: Фитосоциоцентр; 2006; 424 с.
2. Журавлев А.И. Свободнорадикальная биология: Лекция. М: Моск. вет. акад.; 1993; 70 с.
3. Немцова Е.Р. и др. Состояние окислительно-антиокис-лительной системы организма при злокачественных опухолевых процессах. В кн.: Сб. трудов 4-й национальной научн.-практ. конф. с межд. участием «Актив-
ные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск; 2005; с. 232—235.
4. Рууге Э.К. и др. Митохондриальные болезни: современные концепции. В кн.: Сб. трудов 4-й национальной научн.-практ. конф. с межд. участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск; 2005; с. 150—151.
5. Морозкина Т.С. Энергетический обмен и питание при злокачественных новообразованиях. Под ред. В.С. Ша-пота. Минск: Беларусь; 1989; 191 с.
6. Tsuburaya A,, Blumberg D., Burt M., Brennan M.F. Energy depletion in the liver and in isolated hepatocytes of tumor-bearing animals. J Surg Res 1995; 59(4): 421—427.
7. Гонский Я.Н., Береговская Н.Н, Энергообеспечивающее и свободнорадикальное окисление при опухолевом процессе. В кн.: Нарушение биоэнергетики в патологии и пути ее восстановления. М; 1993; с. 21—26.
8. Liu K.J., Henderson T.O., Kleps R.A., Reyes M.C., Nyhus L.M, Gluconeogenesis in the liver of tumor rats. J Surg Res 1990; 49(2): 179—185.
9. Чурсина М.А., Сысоева Т.В, Изменения печени при новообразованиях различной локализации. Здравоохранение Туркменистана 1971; 1(133): 6—8.
10. Янтарная кислота в медицине, пищевой промышленности, сельском хозяйстве. Сб. статей. Под ред. М.Н. Кондрашовой. Пущино; 1997; 300 с.
11. Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (ETS N 123) (заключена в г. Страсбурге 18.03.1986 г.).
12. Кузьмина Е.И., Нелюбин Е.И., Щенникова М.К. Применение индуцированной хемилюминесценции для оценки свободнорадикальных реакций в биологических субстратах. В кн.: Межвузовский сборник биохимии и биофизики микроорганизмов. Горький; 1983; с. 179—183.
13. Ермолин С.В. и др. Биохемилюминометр БХЛ-07. В кн.: Сб. трудов 4-й национальной научн.-практ. конф. с межд. участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека». Смоленск; 2005; с. 21—23.
14. Солопаева И.М., Стефанов С.Б., Жданова Т.Ф. Количественная морфология биоктатов органов пищеварения. Метод. реком. Горький; 1982; 16 с.
15. Маянский Д.Н. Клетка Купфера и система мононукле-арных фагоцитов. Новосибирск: Наука; 1981; 169 с.
