CC BY
69
УДК 612.822
Павлова М.Б., Вайдо А.И.
ВЛИЯНИЕ СТРЕССА НА МЕТИЛИРОВАНИЕ ДНК В ГИППОКАМПЕ КРЫС, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ВОЗБУДИМОСТИ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ, С УЧЕТОМ ЛАТЕРАЛИЗАЦИИ16
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург, Россия,
marina. absp@mail. ru
В настоящее время одной из наиболее актуальных задач нейрогенетики и нейрофизиологии поведения является изучение роли эпигенетических факторов в формировании долгосрочных механизмов травматической памяти у млекопитающих. Среди таких факторов важная роль отводится, в частности, метилированию ДНК, влияющему на экспрессию генов в нейронах посредством угнетения процесса транскрипции[1]. Одной из основных структур мозга, участвующих в формировании памяти стресса, является гиппокамп. Ранее нами показано, что направленность и динамика постстрессорных эпигенетических изменений в нейронах гиппокампа крыс обусловлены генотип-зависимым уровнем возбудимости нервной системы [2,3]. В настоящее время немногочисленными исследованиями на беспозвоночных [4] и млекопитающих [5] продемонстрирована латерализация (межполушарная асимметрия) активности систем эпигенетической регуляции деятельности ц.н.с.
Целью данного исследования явилось изучение уровня метилирования ДНК в пирамидных нейронах СА1, СА2 и СА4 полей гиппокампа, с учетом латерализации - в правом и левом полушариях отдельно, у крыс линий с высоким (ВП) и низким (НП) порогом возбудимости нервной системы, через 24 часа после действия длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия (ДЭБС).
В качестве объекта исследования использовались самцы крыс линий с контрастным высоким (ВП) и низким (НП) пороговым уровнем возбудимости нервной системы. Длительное эмоционально-болевое стрессирование (ДЭБС)
16 Pavlova M.B., Vaido A.I., The effects of stress on DNA methylation in the hippocampus of rats, distinguished by the level of nervous system excitability, with regard to the lateralization. Institute of Physiology named I.P. Pavlov, Saint Petersburg, Russia, [email protected]
146
проводили ежедневно в течение 15 дней, подвергая подопытных крыс 13-минутному сочетанному действию электрического тока и света с вероятностью подкрепления 0,5 по схеме К. Гехта [2]. Контролем служили интактные животные обеих линий. Спустя 24 часа после окончания ДЭБС животных опытных и контрольных групп (n=5) декапитировали и выделяли головной мозг. Гистологическая обработка: Мозг фиксировали в 4% растворе параформальдегида в 0,1М фосфатном буфере рН=7,4: 2,7 г Na2HPO4, 0,4 г NaH2PO4, 8 г NaCl на 1 л дистиллированной воды, далее проводили стандартную обработку материала. Фронтальные срезы толщиной 7 мкм изготовливали в соответствии с координатами по атласу мозга крысы [6]. Иммуногистохимическое окрашивание: Первичное антитело - против 5-mC (Abcam, 1:200), вторичное антитело -универсальное коньюгированное с биотином антитело - из Quick Kit (Vectastain), визуализация реакции с помощью Peroxidase substrat kit DAB (Vector). Анализировали процент иммуноположительных клеток от общего числа клеток (оборудование: микроскоп Микромед-3 с ŒD-камерой и программным обеспечением ВидеоТест-FISH (Санкт-Петербург) и ImageBase). Для статистической обработки применялся непараметрический критерий Манна-Уитни. Результаты по каждой группе представлены в виде медианы (М)
Результаты
1. Обнаружены межлинейные различия по уровню метилирования ДНК (% иммуноположительных по 5-mC ядер пирамидных нейронов) в поле СА1 правого гиппокампа у интактных животных двух линий: в линии НП (М=0.036) измеряемый показатель достоверно выше (р=0.038), чем в линии ВП (М=0.027).
2. В линии ВП обнаружено стимулирующее влияние ДЭБС на измеряемый показатель в поле СА1 левого гиппокампа (контроль: М=0.036, опыт: М=0.076; р=0.024).
3. В линии НП обнаружено ингибирующее влияние ДЭБС на измеряемый показатель в полях СА1(контроль: М=0.036, опыт: М=0.015; р=0.033) и СА4 (контроль: М=0.158, опыт: М=0,028; р=0.043) правого гиппокампа и в поле СА2 левого гиппокампа (контроль: М=0.087, опыт: М=0.035; р=0.025).
В целом, результаты анализа влияния ДЭБС на уровень метилирования ДНК в гиппокампе опытных животных двух линий по сравнению с контрольными схематически представлены на рисунке 1.
Рисунок 1. Влияние ДЭБС на % иммуноположительных по 5-mC ядер пирамидных нейронов полей СА1, СА2 и СА4 гиппокампа правого и левого полушарий крыс линий с высоким (ВП) и низким (НП) порогами возбудимости.
левое полушарие правое полушарие
линия НП после стресса
|jj]j| уменьшение (р<0.05)
различий с контролем нет (р>0.05)
Таким образом, выявлены межлинейные, обусловленные уровнем возбудимости нервной системы, различия как по базовому уровню метилирования ДНК в некоторых районах гиппокампа (поле СА1 правого гиппокампа), так и по степени, направленности и латерализации морфо-функциональных изменений в гиппокампе, вызванных влиянием ДЭБС.
Обсуждение
На примере изучения различных полей гиппокампа крыс двух линий впервые показано, что реакция на стресс со стороны одного из ключевых эпигенетических факторов регуляции активности генома - метилирования ДНК может либо отсутствовать, либо быть разнонаправленной (повышение или понижение активности) - в зависимости от уровня возбудимости нервной системы. Полученные данные подтверждают результаты исследований, ранее проведенных в нашей лаборатории, свидетельствующих о влиянии уровня возбудимости
нервной системы на степень и направленность эпигенетических изменений в различных структурах мозга крысы при формировании памяти стресса после влияния ДЭБС [2,3].
В работе также впервые продемонстрирована ярко выраженная генотипзависимая межполушарная асимметрия постстрессорных эпигенетических изменений уровня метилирования ДНК в полях гиппокампа крыс исследуемых линий, которая свидетельствует о различном вовлечении правого и левого полушария мозга в формирование памяти стресса, обусловленном уровнем возбудимости нервной системы. Ранее межполушарная асимметрия в работе эпигенетических регуляторов активности ц.н.с. была показана на улитке Helix lucorum: выявлены различия по уровни ацетилирования гистона Н3 в командных нейронах левого и правого париетальных ганглиев в ходе обучения [4]. Недавними исследованиями в нашей лаборатории, уже на млекопитающих, также продемонстрирован латеральный характер распределения уровня метилирования гистона Н3 по лизину 4 в полях гиппокампа крыс линий ВП и НП в норме и при стрессе [5].
Результаты настоящей работы вносят вклад в изучение роли различных полей гиппокампа правого и левого полушария мозга млекопитающих в механизмах эпигенетической регуляции формирования памяти стресса у млекопитающих в зависимости от функционального состояния нервной системы.
Литература:
1 Klose RJ, Bird AP. Genomic DNA methylation: the mark and its mediators//Trends Biochem. Sci. 2006. V.31. №2. Р.89-97.
2 Вайдо А.И., Дюжикова Н.А., Ширяева Н.В., Соколова Н.Е., Вшивцева В.В., Савенко Ю.Н. Системный контроль молекулярно-клеточных и эпигенетических механизмов долгосрочных последствий стресса //Генетика. 2009. Т.45. №3.
3 Павлова М.Б., Савенко Ю.Н., Дюжикова Н.А., Ширяева Н.В.,Вайдо А. И. Влияние длительного эмоционально-болевого стрессорного воздействия на процесс фосфорилирования гистона Н3 в гиппокампе линий крыс, различающихся по возбудимости нервной системы// Бюлл.экспер.биол. и мед. 2012. Т.153. №3. С.336-339.
4 Danilova A.B., Kharchenko O.A., Shevchenko K.G. and Grinkevich L.N. Histone H3 acetylation is asymmetrically induced upon learning in identified neurons of the food
aversion network in the mollusk Helix lucorumll Frontiers in Behavioral Neuroscience, 2010. Vol. 4. Article 180. P.1-7.
5 Левина А.С., Ширяева Н.В., Вайдо А.И., Дюжикова Н.А. Влияние активности NMDA-рецепторов на процесс метилирования гистона Н3 и его асимметирию в пирамидных нейронах гиппокампа крыс с разным порогом возбудимости нервной системы в норме и при стрессе// Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 2013. Т.49. №6. С.449-456.
6 Paxinos G., Watson C. The rat brain in stereotaxic coordinates - 6th edition. ll London, Amsterdam, Burlington. Ac.Press, 2007. Р.451.
Ключевые слова: стресс, гиппокамп, метилирование ДНК, межполушарная асимме трия, возбудимость, крысы.
Keywords: stress, the hippocampus, DNA methylation, lateral asymmetry, excitability, rats.
УДК 576.53; 756.54; 616.83
Тибекина Л.М.
НЕЙРОГЕНЕЗ И КЛЕТОЧНЫЕ ТЕХНОЛОГИИ В ЛЕЧЕНИИ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ПОВРЕЖДЕНИЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ17
СПБГУ, Санкт-Петербург, Россия, [email protected]
Высокая инвалидизация вследствие поражения структур головного и спинного мозга в связи с перенесенными инсультами, тяжелыми черепно-мозговыми и спинальными травмами, а также нейродегенеративными заболеваниями свидетельствует о выраженном труднокурабельном неврологическом дефекте. Это обусловливает поиск новых современных технологий, в том числе генных, клеточных, генно-клеточных. Одним из самых ярких событий последнего времени в нейробиологии можно считать открытие нейральных стволовых клеток, обеспечивающих гомеостатическую, адаптивную и репаративную регенерацию
17
Tibekina L.M., Neurogenesis and cellular technology in the treatment of diseases and injuries of the nervous system. Saint Petersburg State University, Saint Petersburg, Russia, [email protected]
