CC BY
73
Химия растительного сырья. 1998. №4. С. 47-51
УДК 631.878:631.811
ВЛИЯНИЕ СОСТАВА ЭКСТРАКТОВ ТОРФА И БИОГУМУСА НА ИХ ФИЗИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ
© И.Я. Духанина, А.Л. Верещагин, Е.Ю. Егорова, Н.В. Степанова
Бийский технологический институт Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова, Бийск (Россия)
E-mail: [email protected]
Исследовано молекулярно-массовое распределение гуминовых и фульвокислот кислотного и щелочного экстрактов торфа и биогумуса методом эксклюзионной хроматографии. Проведен сравнительный анализ их физиологической активности на примере выращивания картофеля сорта «луговской» в гидропонных условиях.
Введение
Несмотря на многочисленные исследования в области химии гуминовых кислот (ГК), вопросы, связанные с предсказанием их физиологической активности, еще не решены, поскольку неоднократно подчёркивалось [1 - 4] о разной биологической активности гуматов различных месторождений торфа и бурового угля. Поэтому промышленному использованию гуминосодержащего сырья должна предшествовать опытная проверка.
Ранее [5] сообщалось о связи физиологической активности ГК с их молекулярными параметрами. Авторами работы был сделан вывод, что одной из причин физиологической активности ГК является наличие в их молекулах фрагментов, обладающих свойствами стабильных свободных радикалов, а их содержание снижается с увеличением доли высокомолекулярных фракций в составе ГК. Вероятность возникновения биологических эффектов у растений определяется проницаемостью для молекул ГК внешних барьеров клеток корня, она увеличивается с уменьшением молекулярной массы (ММ) ГК.
Целью данной работы явилось изучение молекулярного состава образцов гуминовых и фульвиновых кислот (ФК), полученных путём
экстракции в кислой (рН = 4) и щелочной (рН = 11) средах, и оценка их физиологической активности.
Экспериментальная часть
В качестве исходного сырья использовался фрезерный торф низинного типа древесной группы со степенью разложения 25% месторождения с. Одинцовский Посад (Бийский р-н). В работе использовали ГК и ФК, выделенные из этого торфа, и ГК, выделенные из биогумуса - продукта жизнедеятельности красных калифорнийских червей, культивируемых на этом же торфе АО «Теллура» Бийска [6].
Экстракция гуминовых и фульвокислот проводилась при комнатной температуре в течение 48 ч при периодическом перемешивании в соотношении: 1 л раствора НС1 (pH 4) или №ОН (pH 11) на 100 г торфа.
Для исследуемых образцов были получены спектры поглощения в области 200 - 800 нм, ИК-спектры в диапазоне 400 - 4000 см-1, а также определено количество кислых групп. По изученным параметрам эти соединения можно отнести к классам ГК (образцы 2, 3, рис. 1) и ФК (образец
1, рис. 1).
Учитывая высокомолекулярный характер строения ГК и ФК [7, 8], ], для их анализа была выбрана хроматография [9 - 12]. Методами гель-проникающей хроматографии были определены условия качественного и количественного анализа образцов ГК и ФК.
Исследования проводились на жидкостном хроматографе компании “Би РоШ” серии 8800 (США) с УФ детектором в диапазоне длин волн от 190 нм до 360 нм. Фракционирование смесей осуществлялось на бимодальной колонке 2огЪах Р8М 10008 608, геометрия каждой - 6.2 см х
250 см (сорбент и набивка компании »Би Рои!»). В качестве подвижной фазы был использован диметилформамид, модифицированный для подавления адсорбционной активности хлористым литием (0.2 г на 0.5 л диметилформамида с добавлением капельно 0.15 мл азотной кислоты при перемешивании на магнитной мешалке с подогревом не более 50°С). Фильтрование подвижной фазы, как и раствора анализируемой пробы, проведено на фильтрах «Милипор» (3.0 мк). Скорость подачи подвижной фазы - 0.7 мл/мин, температура анализа комнатная.
Детектирование осуществлялось на длине волны 280 нм, ввод проб осуществлялся с помощью петлевого инжектора с объёмом петли 20 мкл.
Калибровка системы была проведена анализом 0.5%-ных тетра-гидрофурановых растворов стандартных образцов полистирола Р8 (компания «Би Рои!» США) с известными молекулярными массами в диапазоне 2103 -г- 600'103.
Обсуждение результатов
Анализ образцов проведён в виде 0.5%-ного (образец 1, рис. 1) и 0.005%-ных (образцы 2 и 3, рис. 1) растворов в подвижной фазе для устранения мешающего влияния пика растворителя пробы. Полученные хроматограммы, совмещённые от момента ввода пробы, представлены на рисунке 1.
Образец 1 (ФК из торфа) имеет выраженный молекулярно-массовый фронт хроматограммы, но содержит низкомолекулярные примеси (пики 3 - 6). В состав этого образца входит не менее шести компонентов, поглощающих в УФ-области. Образцы 2 и 3 (ГК из торфа и биогумуса) хотя и идентичны между собой по характеру молекулярно-массового распределения, но отличаются по удерживанию и по интенсивности поглощения в УФ-области и между собой, и, особенно, от образца 1 (ФК), то есть имеют более высокомолекулярный состав.
Непосредственный расчёт ММР проведён из данных гель-хроматограмм (рис. 1), каждая из которых была разбита на п 5-миллиметровых сетов с последующим определением в каждом сете времени удерживания туд и высоты сета от базовой линии до фронта ММР
в
t.c
900 600 300
Рис. 1. Гель - хроматограммы образцов фульвиновой (а) и гуминовых (б, в) кислот
Все значения hi приведены к одной чувствительности детектора (А = 0.64) и к одной концентрации растворов (0.5%).
По калибровочной зависимости для каждого удерживаемого объёма сета ni были определены соответствующие молекулярные массы Mi. Следует иметь в виду, что найденные таким образом значения Mi не являются истинными значениями ММ, они могут существенно (в 1.5-З раза) отличаться от истинных значений. Однако этот метод
Таблица 1
Массовые доли отдельных фракций экстрактов торфа и биогумуса
Образец Мп Мтах К
1 360 1300 2800 7.8
2 2300 8000 66700 28.8
3 2300 4000 40000 17.4
даёт возможность проводить корректное сравнение молекулярных характеристик исследуемых образцов, тем более, что высокомолекулярные соединения не характеризуются какими-то определёнными ММ [12].
Для построения дифференциальных кривых ММР (рис. 2) были рассчитаны значения массовых долей отдельных фракций £ % (табл. 1). Очевиден полидисперсный характер образцов с широким диапазоном ММ: от 100 до 50000 дальтон с максимумом распределения 1000 - 2000 дальтон для образца 1, более широкий и высокомолекулярный диапазон от 1000 до 1000000 дальтон с максимумом распределения 4000 дальтон для образца 3 и 8000 дальтон для образца 2. Так как при значениях К > 1.1 система перестаёт быть моно-дисперсной, то в данном случае можно говорить о высокой степени полидисперсности исследуемых образцов. Как уже отмечалось, биологическая активность ГК увеличивается с уменьшением их ММ [5]. Изученные образцы ГК и ФК характеризуются тем, что средняя масса молекул не превышает 10000 дальтон для ГК и 5000 дальтон для ФК. То есть этот показатель (ММР) оказался значительно меньше данных, приводимых ранее в научной литературе. Относительно небольшие размеры молекул ГК и ФК должны способствовать их диффузии во внутренний объём клеточной стенки и далее к плазматической мембране клетки, что делает принципиально возможным последующий перенос макромолекул внутрь клеток корня и, следовательно, воздействие на их метаболизм. Оценка биологической активности исследуемых образцов ГК и ФК проводилась на оздоровленных растениях картофеля сорта «лугов-
ской». Черенки безвирусных растений выдерживали в течение 24 ч в растворах биостимуляторов трёх различных концентраций. В качестве биостимуляторов использовали кислотный экстракт торфа (рН экстрагента = 4, содержание
ФК = 1.0 г/л) и щелочной экстракт торфа (рН экстрагента = 12, содержание ГК = 2.1 г/л). Растворы биостимуляторов были приготовлены на основе стандартного питательного раствора. Затем черенки высадили на гидропонную установку «Мини-вит-2» для укоренения и получения растений картофеля. Через каждые 4 дня определяли длину корней и побегов растений. Через 28 дней выращивания растения извлекли из установки и удалили корневую систему. Корни были высушены на воздухе в течение трёх суток и взвешены.
Рис. 2. Дифференциальные кривые ММР образцов фульвокислот (1) и гуминовых (2, 3) кислот
В качестве контрольного опыта использовали черенки, высаженные на установку «Минивит-2» непосредственно после черенкования.
Рост побегов растений, обработанных растворами биостимуляторов, сравнили с ростом побегов контрольных растений. Относительную скорость роста определяли по отношению к контрольному образцу. Полученные результаты представлены в таблице 2.
Данные, характеризующие зависимость скорости роста корней от концентрации растворов биостимуляторов и продолжительности культивирования, представлены в таблице 3. Данные, характеризующие зависимость массы корней от концентрации биостимуляторов, представлены в таб-
лице 4. Как видно из таблиц 2-4, оба биостимулятора при всех изученных концентрациях стимулируют рост побегов и корней картофеля по сравнению с контрольными растениями, причем кислотный экстракт более эффективен при разбавлении.
Заключение
Проведенные исследования показали преимущество стимулирующего действия фульвокислот кислот по сравнению с гуминовыми на процесс роста и развития растений картофеля сорта «лу-говской». Полученные данные позволяют полагать, что и в случае этого ряда экстрактов стимулирующая активность гумусовых кислот возрастает с уменьшением их молярной массы.
Таблица 2
Зависимость скорости роста побегов от концентрации стимулятора и продолжительности
культивирования
Образец торфа Концентрация, мл/л Относительная скорость роста побегов спустя
4 дня 8 дней 12 дней 16 дней 20 дней 24 дней 28 дней
II £ р 0.05 2.40 3.66 2.42 1.53 1.21 1.11 1.18
II £ р 0.50 2.10 3.24 2.17 1.47 1.18 1.09 1.05
рН = 4 1.00 1.65 2.60 1.90 1.50 1.14 1.08 1.02
рН = 11 0.05 1.11 1.88 1.61 1.60 1.34 1.09 1.16
рН = 11 0.50 2.03 2.80 2.07 1.73 1.35 1.23 1.14
рН = 11 1.00 1.45 1.90 1.68 1.50 1.22 1.17 1.12
Таблица 3
Зависимость относительной скорости роста корней от концентрации биостимулятора и продолжительности культивирования
Экстракт торфа Концентрация мл/л Относительная скорость роста корней спустя
4 дня 8 дней 12 дней 16 дней 20 дней
рН = 4 0.05 4.40 3.67 3.52 3.76 3.98
рН = 4 0.50 3.53 3.26 2.97 3.20 3.48
рН = 4 1.00 3.15 2.81 2.75 2.98 3.12
рН = 11 0.05 2.35 2.11 2.01 2.10 2.14
рН = 11 0.50 3.10 2.64 2.57 2.70 2.87
рН = 11 1.00 3.01 2.56 2, 47 2.76 2.79
Таблица 4
Зависимость массы корней от концентрации и вида биостимулятора и продолжительности
культивирования
Стимулятор Концентрация стимулятора, мл/л
Q.Q5 Q.5Q 1.QQ
Кислотный экстракт торфа, масса сухих корней, г 1Q.62 6.34 4.27
Щелочной экстракт торфа, масса сухих корней, г 4.31 7.75 6.11
Список литературы
1. Levinsky B.V. Humates are the guarantee of fertility and environmental safety of agricultural products, January 1998. / http://www.humic.com/livinsky.htm
2. Properties of humic substances / http://www.humic.com/Polen /rwasy2.htm
3. Flaig W. Chemische Untersuchungen an Huminstof-fen // Zeitschrift fur Chemie. 4. Jahrgang. 1964. Heft 7, S. 253-265.
4. Flaig W. Organische Kolloide des Bodens, Bildung und Eigenschaften // Agnxhemica. 1978. № 22. S. 226-247.
5. Орлов Д.С., Дёмин В.В., Завгородняя Ю.А. Влияние молекулярных параметров гуминовых кислот на их физиологическую активность // Докл. РАН. 1997. Т. 354, № 6. C. 843-845.
6. Верещагин А.Л., Куцый В.А., Антонова О.И. Применение гуминовых кислот и их производных // Сб. тез. докл. 55-й науч.-техн. конф. АлтГТУ. Ч. 1. Барнаул, 1997. С. 126-128.
7. Степаненко Л.С., Ребарчук Н.М., Максимов О.Б. Использование хроматографии на гелях для изучения состава и реакционной способности гуминовых кислот // Новые методы исследования гуминовых кислот. Владивосток, 1972. С. 90-106.
8. Жоробекова Ш.Ж., Макролигандные свойства гуминовых кислот. Фрунзе. 1987. С. 3-24
9. Egbert R. Untersuchung der Polydispersitat von Huminstoffsystemen durch analytische Ultrazentrifugation und Gelchromato-grafie // Landbauforschung Volkenrode. 37. Jahrgang 1987. Heft 4. S. 235-244.
10. Жидкостная колоночная хроматография. / Под ред. З. Дейла, К. Мацека, Я. Янака; Пер. с англ. М., 1978. Т. 1.
11. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Брауде Е.В., Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М., «Химия». 1986.
12. Сакодынский К.И. и др. Аналитическая хроматография. М., 1993.
Поступило в редакцию 03.09.99
