CC BY
43
УДК 597.554.3.574.23+597-11
В. К. Голованов, А. К. Смирнов, И. Л. Голованова
ВЛИЯНИЕ СКОРОСТИ НАГРЕВА ВОДЫ НА ТЕРМОУСТОЙЧИВОСТЬ И ПИЩЕВАРИТЕЛЬНЫЕ КАРБОГИДРАЗЫ КАРПА CYPRINUS CARPIO (L.) В РАЗЛИЧНЫЕ СЕЗОНЫ ГОДА
Введение
Температурные и трофические условия среды в значительной степени определяют интенсивность роста, накопление биомассы и в конечном счете продуктивность популяций рыб, обитающих в пресноводных водоемах. Как правило, в условиях аквакультуры подбирается и поддерживается определенный постоянный или переменный температурный режим. В ряде случаев, особенно в рыбоводных хозяйствах, расположенных в зоне сброса подогретых вод атомных и тепловых электростанций, в результате аварийных ситуаций могут наблюдаться резкие, нехарактерные для сезона, изменения температуры воды, которые могут приводить к массовой гибели рыб. Для характеристики термоустойчивости рыб в зоне верхних границ жизнедеятельности экспериментально определяют уровень верхней летальной температуры. Влияние скорости нагрева на уровень верхней летальной температуры подробно исследовано у ряда видов пресноводных костистых рыб: лещ Abramis brama (L.), плотва Rutilus rutilus (L.), карась серебряный Carassius auratus (L.), окунь Perca fluviatilis (L.), обитающих в Рыбинском водохранилище [1-4]. Для прогнозирования последствий теплового загрязнения водоемов на пищеварительную функцию рыб необходимы экспериментальные исследования по влиянию скорости повышения температуры среды на активность ферментов, расщепляющих основные компоненты корма. Изменение активности карбогидраз кишечника рыб при различных значениях скорости нагрева воды в разные сезоны года продемонстрировано лишь на примере серебряного карася [5]. При этом для карпа Cyprinus carpio (L.), который широко используется в практике аквакультуры и в лабораторных экспериментах, аналогичные исследования проведены лишь в осенне-зимний период [6].
В связи с этим цель работы состояла в изучении влияния скорости нагрева воды на уровень значений верхней летальной температуры карпа и сопутствующие изменения активности пищеварительных ферментов, расщепляющих углеводные компоненты корма, в различные сезоны года.
Материалы и методы исследования
Работа выполнена в 1999-2002 гг. на сеголетках и годовиках карпа (масса 9,8-15,5 г, длина 6,8-8,3 см), выращенных в прудах стационара полевых и экспериментальных работ Института биологии внутренних вод РАН. Всего исследовано 168 особей. Перед экспериментом рыб помещали в лабораторные аквариумы вместимостью 300 л и в течение 10 дней акклимировали к температуре 5 °С зимой, 10-12 °С весной и осенью, 20 °С летом. Затем группы рыб (по 6 экз. в каждой) помещали в экспериментальные аквариумы вместимостью 60 л, оборудованные системами нагрева и аэрации. Температуру воды в опытных аквариумах повышали с различной скоростью (0,04-50 °С/ч) до нарушения локомоторной функции рыб - поворота на бок или спину, при этом в случае прекращения температурного воздействия рыба сохраняла жизнеспособность. Все опыты проводили в условиях естественного фотопериода. Сублетальные значения температуры в конечной точке эксперимента соответствовали критическому термическому максимуму. Продолжительность эксперимента в зависимости от сезона составляла 13-30 сут при медленной (0,04 °С/ч) скорости нагрева воды и 5,0-0,3 ч при скорости нагрева 4, 10, 17, 32 и 50 °С/ч. Контрольная группа рыб (6 экз.) содержалась при температуре воды, равной температуре акклимации. Всех рыб кормили ad libitum 1 раз в сутки рыбным фаршем и сухим комбикормом в объеме 3-4 % общей массы тела.
По окончании опыта у рыб изымали кишечник и готовили суммарные гомогенаты слизистой оболочки от 6 экз. рыб одной экспериментальной группы. Амилолитическую активность, отражающую суммарную активность ферментов, гидролизующих крахмал: a-амилазы КФ 3.2.1.1, глюкоамилазы КФ 3.2.1.3 и мальтазы КФ 3.2.1.20 оценивали модифицированным методом
Нельсона [7] при рН 7.4. Инкубацию проводили как при стандартном значении температуры 20 °С, так и при температуре, равной температуре акклимации. Ферментативную активность определяли в пяти повторностях и выражали в микромолях продуктов реакции, образующихся за 1 минуту инкубации в расчете на 1 г влажной массы ткани (мкмоль/(гмин)).
Результаты обработаны статистически с помощью пакета прикладных программ Statgraphics Plus 5.1 и Excel 2003 и представлены в виде средних и их ошибок. Достоверность различий оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA, LSD-тест) при p = 0,05.
Результаты исследования и их обсуждение
Во все сезоны года максимально высокий уровень значений верхней летальной температуры у молоди карпа - от 38,4 до 41,3 °С отмечен при самой медленной скорости нагрева воды 0,04 °С/ч (табл.). При остальных значениях скорости нагрева значения верхней летальной температуры достоверно ниже во все сезоны (р < 0,05). При этом самый высокий уровень верхней летальной температуры отмечен в летний период, наиболее низкий — в зимний период, а сезонные различия достигают 9-11 °С. Характер зависимости значений летальной температуры от скорости нагрева воды в разные сезоны несколько иной. В диапазоне скорости нагрева воды от 4 до 50 °С/ч разница между максимальными и минимальными значениями в различные сезоны невелика: 2,3 °С осенью, 2,4 °С весной, 2,5 °С зимой и 2,7 °С летом. Однако минимальные значения верхней летальной температуры в различные сезоны отмечены при разных значениях скорости нагрева: 28,5 °С весной при температуре 4 °С/ч, 29,6 °С осенью при 10 °С/ч, 25,5 °С зимой и 34,7 °С летом при скорости нагрева 18 °С/ч.
Верхняя летальная температура молоди карпа в разные сезоны года при различных значениях скорости нагрева
Скорость нагрева воды, °С/ч Сезон
Лето Осень Зима Весна
0,04 40,2 і 0,2 39,6 і 0,1 38,4 і 0,1 41,3 і 0,1
4 37,4 і 0,2 30,8 і 0,5 26,5 і 0,2 28,5 і 0,6
10 35,8 і 0,4 29,6 і 0,5 27,8 і 0,2 29,6 і 0,5
17 34,7 і 0,4 30,7 і 0.3 25,5 і 0,7 30,4 і 0,5
32 35,6 і 0,3 31,9 і 0,5 26,3 і 0,6 30.9 і 0,3
50 36,0 і 0,4 31,2 і 0,3 28,0 і 0,3 30,4 і 0,5
Результаты сравнения значений верхней летальной температуры у молоди карпа и других видов рыб: золотого Carassius carassius (L.) и серебряного карася, леща, плотвы, синца Abramis ballerus (L.) и др. свидетельствуют о том, что это один из самых термоустойчивых видов семейства карповых, обитающих в Европейской части России и Северной Америке. Так, значения, полученные в экспериментах с повышением температуры в 0,04 °С/ч, в летний сезон составляют у карпа 41,3 °С, в то время как у серебряного карася - 40,2 °С, золотого карася - 37—39 °С, синца -35—38 °С, леща - 35—37 °С, плотвы - 34—36 °С [1, 3, 4, 8]. Лишь у молоди отдельных видов карповых: черного толстоголова Pimephales promelas (Rafinesque) и белого амура Ctenopharyngodon idella (Valenciennes) уровень верхней летальной температуры равен или несколько выше такового у молоди карпа [8]. Значения этого показателя у карпа, полученные при скорости нагрева воды 0,04 °С/ч, сохраняют относительное постоянство в течение всего года (сезонная разница составила ~ 3 °С), поскольку при такой скорости нагрева происходит постепенная температурная переакклимация во время эксперимента. В итоге гибель рыб отмечается при максимально высокой верхней летальной температуре.
Изучая действие высокой температуры на рыб, большинство исследователей используют одну или несколько скоростей нагрева. В настоящей работе оценивалась динамика уровня верхней летальной температуры у карпа в широком диапазоне значений скорости нагрева воды в различные сезоны года. Зависимость этого показателя от скорости нагрева воды во все сезоны, исключая весенний, носит сходный характер: минимальная термоустойчивость отмечена при скорости нагрева воды 10-17 °С/ч (весной при скорости 4 °С/ч). Подобная динамика показателя была установлена ранее для плотвы и речного окуня [1, 4]. У молоди карпа с увеличением теп-
ловой нагрузки после достижения минимального значения наблюдается рост значений верхней летальной температуры. По всей вероятности, это вызвано отставанием прогрева внутренних тканей тела рыб от температуры среды [8]. По мере увеличения скорости нагрева воды уменьшается время теплового воздействия, что и вызывает повышение уровня верхней летальной температуры. В то же время нагрев воды со скоростью от 10 до 50 °С/ч, очевидно, уже не позволяет в полной мере включиться адаптационным механизмам и обеспечить приспособление к резко меняющимся условиям среды.
Определение активности карбогидраз при стандартной температуре инкубационной среды 20 °С (рис., а) показало, что повышение температуры воды со скоростью 0,04 °С/ч увеличивает уровень активности у опытных рыб по сравнению с контрольными на 18 % летом и 25 % осенью и зимой (р < 0,05), в то время как весной достоверные изменения отсутствуют. Повышение скорости нагрева в летний период вызывает последовательное увеличение амилолитической активности, которая составила 176 % от контроля при скорости 50 °С/ч. Осенью и зимой повышение температуры воды со скоростью 4-50 °С/ч снижает активность карбогидраз на 26-51 % (р < 0,05). Весной при скорости нагрева 4-17 °С/ч амилолитическая активность у карпа достоверно уменьшается на 25-47 %, при самой высокой скорости нагрева — не отличается от таковой у рыб контрольной группы.
— • - - Зима
мкмоль/(г-мин) „
Весна
мкмоль/(г-мин)
Скорость повышения температуры воды, ° С/ч б
Амилолитическая активность (мкмоль/(г-мин)) в слизистой оболочке кишечника карпа при различной скорости нагрева воды in vivo в различные сезоны года: а - температура инкубации 20 °С; б - температура инкубации, равная температуре акклимации - 0 °С зимой, 10 °С весной и осенью, 20 °С летом (n = 6)
При температуре инкубации, близкой к природной (рис., б), максимальный уровень амило-литической активности 71,3 ± 0,9 в кишечнике карпов контрольной группы отмечен летом, более низкий - 54,6 ± 1,0 и 31,5 ± 1,5 - осенью и весной, минимальный - 4,4 ± 0,1 мкмоль/(г-мин) -зимой. При повышении температуры воды со скоростью 0,04 °С/ч отмечено увеличение ферментативной активности на 14-19 % летом, осенью и зимой у опытных рыб по сравнению с контрольными, в то время как весной достоверные изменения отсутствуют. При более высоких значениях скорости нагрева воды характер изменения ферментативной активности в зависимости
от скорости повышения температуры в различные сезоны совпадает с таковым, выявленным при температуре инкубации 20 °С. Летом отмечено последовательное повышение активности карбогид-раз, осенью и зимой — снижение при всех исследованных значениях скорости нагрева воды, весной достоверное снижение отсутствует лишь при значениях скорости нагрева 50 °С. При этом максимальное торможение ферментативной активности во все сезоны, за исключением летнего, отмечено в диапазоне скорости нагрева от 4 до 17 °С/ч и его величина не превышает 53 % от контроля.
Сравнение результатов настоящего и ранее проведенного [5] исследований позволило выявить как сходство, так и некоторые отличия в изменении уровня амилолитической активности в слизистой оболочке кишечника молоди карпа и карася в зависимости от скорости нагрева воды. Характер изменения ферментативной активности, измеренной при температуре 20 °С, летом у карпа совпадает с таковым у серебряного карася. При этом отмечено последовательное возрастание уровня активности карбогидраз с увеличением скорости нагрева воды. Осенью наибольшая активность ферментов у обоих видов рыб отмечена при медленной скорости нагрева, не превышающей 0,1 °С/ч. Максимальное снижение на 50-60 % от контроля отмечено у карпа и карася при скорости нагрева 17 °С/ч. В весенне-зимний период характер изменения ферментативной активности при увеличении уровня тепловой нагрузки у карпа и карася несколько различается. Если у карася достоверное снижение активности карбогидраз на 30-40 % отмечено лишь при скорости нагрева воды 32-50 °С/ч, то у карпа — на 25-51 % во всем диапазоне значений средних и высоких скоростей нагрева воды, исключая 50 °С/ч.
Известно, что при изменении температуры среды обитания адаптации пищеварительной системы животных реализуются главным образом благодаря перестройкам ферментных систем и липидного матрикса мембран [9]. Регуляция скорости ферментативных процессов осуществляется преимущественно на клеточном и молекулярном уровне посредством изменения концентрации и свойств ферментов. В экспериментах in vivo изменение активности пищеварительных гид-ролаз с ростом температуры окружающей среды может свидетельствовать об изменении как интенсивности синтеза соответствующих ферментов, так и условий их функционирования. Поскольку для синтеза новых пищеварительных ферментов требуется по крайней мере несколько суток, а продолжительность резкого температурного воздействия в наших экспериментах не превышала 5 часов, то снижение активности карбогидраз при скорости нагрева воды от 4 до 50 °С/ч, по всей вероятности, обусловлено изменением свойств ферментов, а не увеличением их количества. Действительно, изучение влияния температуры in vitro на активность карбогидраз у молоди карася при разной скорости повышения температуры воды позволило выявить смещение температурного оптимума от 60 до 30 °С, свидетельствующее об уменьшении термостабильности ферментов при увеличении уровня тепловой нагрузки [10]. При низкой скорости нагрева воды < 0,1 °С/ч (около 1 °С /сут) рыбы в течение 2-4 недель могут акклимироваться к постепенному повышению температуры, и активность карбогидраз, а следовательно, и скорость начальных этапов ассимиляции углеводов увеличиваются во все сезоны года. Особый интерес для экологической физиологии и современной аквакультуры представляют данные опытов по влиянию высокой скорости повышения температуры на переваривание пищи у рыб осенью и ранней зимой, когда повышение температуры среды противоречит сезонному ходу событий. Высокая скорость нагрева воды (от 4 до 32 °С/ч) в этот период не позволяет организму приспособиться к быстро меняющимся условиям среды, в значительной мере снижая скорость гидролиза углеводных компонентов пищи и негативно влияя на эффективность питания рыб.
Заключение
Таким образом, установлена зависимость уровня верхних летальных температур и сопутствующих изменений активности пищеварительных карбогидраз у карпа в различные периоды годового цикла в широком диапазоне скорости нагрева воды. Самые высокие значения верхней летальной температуры и амилолитической активности выявлены при скорости нагрева
0,04 °С/ч, позволяющей рыбам успешно акклимироваться к повышению температуры. Значения изученных показателей в значительной мере зависят от скорости повышения температуры воды: в большинстве случаев самые низкие уровни отмечены в диапазоне скорости нагрева 4-17 °С/ч. Максимальные значения исследованных показателей при всех значениях скорости нагрева воды установлены в летний, минимальные - в зимний период года. Летом отмечен последовательный рост уровня ферментативной активности с повышением температуры среды, в другие сезоны, особенно осенью и зимой, наблюдается резкое снижение активности карбогидраз. Полученные
данные могут использоваться для разработки критериев экологической безопасности в зонах
сбросных вод тепловых и атомных электростанций, а также для прогнозирования возможных
последствий резких изменений температуры воды в условиях аквакультуры.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Голованов В. К., Смирнов А. К. Верхние летальные температуры плотвы Rutilus rutilus (L.), эвритерм-ного вида - индикатора теплового загрязнения водоемов, в различные сезоны года // Рибне господарство (Киев). - 2004. - Вып. 63. - С. 39-42.
2. Термоадаптационные характеристики леща Abramis brama (L.) Рыбинского водохранилища / В. В. Лапкин, В. К. Голованов, А. М. Свирский, В. А. Соколов // Структура локальной популяции у пресноводных рыб. - Рыбинск: ИБВВ АН СССР, 1990. - С. 37-85.
3. Смирнов А. К., Голованов В. К. Влияние различных факторов на термоустойчивость серебряного карася Carassius auratus L. // Биология внутренних вод. - 2004. - № 3. - С. 103-109.
4. Смирнов А. К., Голованов В. К. Термопреферендум и верхние летальные температуры молоди карповых и окуневых видов рыб (на примере серебряного карася и речного окуня) // Актуальные проблемы биологии и экологии: материалы XV Республ. молодеж. науч. конф. - Сыктывкар: Изд-во Коми науч. центра УрО РАН, 2004. - С. 274-275.
5. Голованова И. Л., Кузьмина В. В., Голованов В. К. Воздействие высоких температур на пищеварительные гидролазы серебряного карася Carassius auratus L. // Вопросы ихтиологии. - 2002. - Т. 42, № 1. - С. 121-128.
6. Голованова И. Л., Смирнов А. К., Голованов В. К. Влияние повышения температуры в осенне-зимний период на активность карбогидраз молоди карповых рыб (сем. Cyprinidae) // Биология внутренних вод. - 2005. - № 2. - С. 87-90.
7. Уголев А. М., Иезуитова Н. Н. Определение активности инвертазы и других дисахаридаз // Исследование пищеварительного аппарата у человека. - Л.: Наука, 1969. - С. 192-196.
8. Beitinger T. L., Bennet W. A., McCauley R. W. Temperature tolerances of North American freshwater fishes exposed to dynamic changes in temperature // Environ. Biol. Fish. - 2000. - Vol. 58, N 3. - P. 237-275.
9. Уголев А. М., Кузьмина В. В. Пищеварительные процессы и адаптации у рыб. - СПб.: Гидрометеоиз-дат, 1993. - 238 с.
10. Влияние тяжелых металлов на пищеварительные карбогидразы серебряного карася при различных уровнях тепловой нагрузки / И. Л. Голованова, А. К. Смирнов, В. К. Голованов и др. // Матер. Все-рос. науч.-практ. конф. «Экологические проблемы уникальных природных и антропогенных ландшафтов». - Ярославль, 2004. - С. 201-206.
Статья поступила в редакцию 21.03.2011
INFLUENCE OF THE WATER HEATING RATE UPON THERMAL RESISTANCE AND DIGESTIVE CARBOHYDRASE OF CARP CYPRINUS CARPIO (L.)
DURING DIFFERENT SEASONS
V. R Golovanov, A. R Smirnov, I. L. Golovanova
The values of upper lethal temperature and the activity of digestive carbo-hydrase of carp Cyprinus carpio (L.) in the various periods of an annual cycle considerably depend on the rate of the increase of water temperature. In all seasons the lowest values of the upper lethal temperature and the amylolitic activity are marked in a range of heating rate 4-17 X/h and the highest ones are at the minimal heating rate 0.04 X/h that allows fish successfully acclimate to temperature increase. The maximum values of the investigated parameters at all rates of water heating are established in summer, the minimum ones are in the winter period of a year. The consecutive increase of the amylolityc activity with increase of environment temperature is fixed in summer. In other seasons, especially in autumn and winter, the sharp decrease of the digestive carbohydrase activities is observed.
Key words: fish, carp, upper lethal temperature, digestive enzymes, amylolitic activity, season, heating rate.
