CC BY
67
ВЕСТНИК ПЕРМСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
2004 Биология Вып. 2
УДК 612.017.1
ВЛИЯНИЕ РЕПРОДУКТИВНЫХ ГОРМОНОВ НА ОСНОВНЫЕ ФУНКЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА
С. В. Ширшева Ь, Е. М. Куклинаь, И. В. Бессоноваа
а Пермский государственный университет, 614990, Пермь, ул. Букирева, 15
ь Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, 614081, Пермь, ул. Голева, 13
Изучена способность эстрадиола, прогестерона и хорионического гонадотропина модулировать фагоцитарную и окислительную активность нейтрофилов периферической крови небеременных женщин. Гормоны вносили в пробы по отдельности и в физиологических сочетаниях, характерных для I и III триместров беременности. Установлено увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов в присутствии высокой (100 МЕ/мл) дозы хорионического гонадотропина, а также сочетаний стероидных гормонов, соответствующих их уровням в крови как в I, так и в III триместре беременности. Люминолзависимая хемилюминесценция нейтрофилов также достоверно усиливается комбинацией стероидных гормонов, характерной для III триместра беременности. Таким образом, гормоны репродукции обладают способностью стимулировать нейтрофильный фагоцитоз и повышают окислительный потенциал как ин-тактных, так и активированных нейтрофилов. Учитывая, что данный стимулирующий эффект экстраполируется на III триместр беременности, можно предполагать «заинтересованность» основных гормонов репродукции в подготовке клеток неспецифической резистентности к активации родовой деятельности.
Процесс гестации является феноменом естественной трансплантации полуаллогенного плода, так как генофонд зиготы наполовину заимствован от отца. Однако при нормальном течении беременности отторжения эмбриона не происходит. Нейтро-филы - основные клеточные эффекторы неспециг фической защиты организма, принимающие активное участие не только в элиминации патогенов, но и в трансплантационных реакциях. Обладая высокой реактивностью в ответ на действие хемотаксических и других факторов, эти клетки первыми появляются в очаге поражения и определяют пусковые механизмы развития воспаления и ранних защитных реакций (Потапнев, 1995; Белова, 1997; Наз1е« е1 а1., 1989). Как известно, гормоны репродукции могут эффективно воздействовать на пролиферацию и дифференцировку не только репродуктивных тканей, но и клеток иммунной системы, контролирующих антигенный гомеостаз материнского организма (Ширшев, 2002). Важную роль в регуляции иммунной системы при беременности играют женские половые стероидные гормоны - эстрогены и прогес-тины, а также индуктор их синтеза - хорионический гонадотропин (ХГ) (Ширшев, 1998, 2002). В настоящее время, несмотря на многочисленные исследования, проведенные в области иммунологии репродукции, остается невыясненным вопрос о механизмах, обеспечивающих гормональную регуляцию нейтрофилов в период физиологически развивающейся беременности у человека.
Цель настоящей работы - оценка функциональной активности нейтрофилов человека в присутствии различных комбинаций репродуктивных гормонов, уровень которых соответствует различным триместрам беременности.
Материалы и методы исследования
Исследование проводилось in vitro. Гормоны использовали в концентрациях, соответствующих их уровням в периферической крови в I и III триместрах беременности: ХГ - 100 и 10 МЕ/мл, эстрадиол (Е2) - 1 нг/мл и 10 нг/мл, прогестерон (Рг) - 20 нг/мл и 100 нг/мл соответственно. При этом гормоны вносили в пробы по отдельности и в физиологических сочетаниях, соответствующих разным триместрам беременности (Вихляева, 1998). Нейтрофилы выделяли из периферической крови небеременных женщин репродуктивного возраста центрифугированием при двойном градиенте плотности фиколла-верографина. Плотности верхнего и нижнего градиентов составляли 1,077 и 1,112 г/см3 соответственно. Нейтрофилы собирали с нижней интерфазы (Crouch, Fletcher, 1992). Фагоцитарную активность оценивали по поглощению частиц полистирольного латекса (1,5 мкм). Для этого в клеточную культуру плотностью 4106клеток/мл и объемом 0,1 мл вносили гормоны, в контрольные пробы - среду 199. Пробы инкубировали в течение 1 ч при 37°С, после чего добавляли латексные частицы (4108/мл). По истечении 1,5-часовой инкубации готовили мазки, которые
© С.В. Ширшев, Е.М. Куклина, И.В. Бессонова, 2004
174
Влияние репродуктивных гормонов на основные функции нейтрофилов человека 175
фиксировали метанолом и окрашивали по методу Романовского-Гимза. Подсчет клеток вели под масляной иммерсией с использованием светового микроскопа «Биолам». Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по двум показателям: 1) процент фагоцитоза - число фагоцитирующих нейтрофилов на 100 клеток; 2) фагоцитарный индекс, отражающий уровень индивидуальной поглотительной способности клеток. Окислительную активность оценивали по интенсивности люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ) нейтрофилов, стимулированных латексными частицами. Хемилюминес-центный анализ проводили с помощью биолюмино-метра БЛМ-8703М. Для этого в пластиковую кювету вносили 800 мкл раствора, содержащего 110 мМ ЫаС1, 10 мМ трис-НС1, 2,5 мМ 1^С12, 5 мМ глюкозы и 10~4М люминола (pH 7,4). После инкубации в течение 3-5 мин при 37°С и замера'фонового свечения добавляли 50 мкл клеточной суспензии (4-106/мл), предварительно инкубированной с гормонами в течение 1 ч, измеряли интенсивность спонтанной хемилюминесценции. Затем в кювету вносили 50 мкл латексных частиц в концентрации 4108/мл и фиксировали интенсивность стимулированной хемилюминесценции до того момента, когда, пройдя максимум, показатель снизится на 2/3.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием /-критерия Стьюдента и корреляционного критерия Пирсона.
Результаты и их обсуждение
В ходе исследования выявлено увеличение фагоцитарной активности нейтрофилов в присутствии высокой дозы ХГ (Ю0МЕ/мл), характерной для крови I триместра беременности, а также при сочетаниях стероидных гормонов, соответствующих как I, так и III триместрам беременности. Интересно отметить, что при совместном действии ХГ и стероидов статистически значимых изменений нейтрофильного фагоцитоза не выявляется (табл. 1). Поглотительная активность нейтрофилов (фагоцитарный индекс) также увеличивается в присутствии гонадотропина в высокой концентрации и при комбинации стероидов, характерной для I триместра беременности. Эффекта от совместного действия всех трех гормонов не наблюдается, как и при исследовании процента фагоцитоза.
Таким образом, гонадотропин в концентрации 100 МЕ/мл повышает как процент нейтрофильного фагоцитоза, так и поглотительную активность этих клеток, в то время как Е2 или Рг не дают эффектов. При совместном действии различные комбинации доз половых стероидов, как и ХГ, достоверно стимулируют фагоцитоз нейтрофилов. Однако совместное действие всех трех гормонов не влияет на фагоцитарную активность гранулоцитов. По-видимому, негеномные эффекты половых стероидов, которые реализуются на уровне вторичных
мессенджеров и факторов транскрипции, конкурируют с аналогичными мессенджерами, индуцируемыми ХГ в нейтрофилах. Очевидно, поэтому при беременности не отмечается явных изменений в фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови (Ширшев, 1999).
Таблица 1
Влияние репродуктивных гормонов на фагоцитоз латексных частиц нейтрофилами человека
№ груп- пы Экспериментальное воздействие Показатели фагоцитоза (М± ш)
Процент фагоцитоза Фагоцитарный индекс
1 Контроль 48,09 ± 6,477 3,36 ±0,635
2 ХГ, 100 МЕ/мл 56,18 + 7,846* 3,90 ± 0,727*
3 ХГ, ЮМЕ/мл 48,45 ± 7,826 3,36 ± 0,625
4 Эстрадиол, 1,0 нг/мл 52,45 + 8,112 2,86 + 0,531
5 Эстрадиол ,10 нг/мл 46,73 ± 7,678 3,79 ± 0,852
6 Прогестерон, 20 нгЛчл 51,46 ±7,267 4,15 ±0,976
7 Прогестерон, 100 нг/мл 46,27 ± 8,556 4,08 ±0,931
8 Эстрагшол, 1,0 нг/мл + ХГ, 100 МЕ/мл + прогестерон, 20 нг/мл 52,82 ±8,714 4,46 + 0,852
9 Эстрадиол, 10 нг/мл + ХГ,10 МЕ/мл + прогестерон 100нг/мл 55,55 ± 9,940 4,56 ± 1,104
10 Эстрадиол, 1,0 нг/мл + прогестерон, 20 нг/мл 59,27 + 8,564* 5,17 ± 1,128*
И Эстрадиол, 10 нг/мл + прогестерон, 100 нг/мл 62,09 ±8,464* 4,70 ± 1,122
Примечание: * - Р<0,05 (сопоставление с контролем).
При оценке гормонального контроля кислород-зависимых механизмов микробицидности нейтрофилов установлено, что как ХГ, так и Е2 не оказывает значимых воздействий на различные варианты ЛЗХЛ. Из всех исследуемых гормонов только Рг обладает способностью активировать латекс-стимулированную ЛЗХЛ нейтрофилов (табл. 2). Спонтанная ЛЗХЛ нейтрофилов достоверно усиливается лишь при использовании комбинации доз стероидных гормонов, экстраполированной с уровня их концентраций в крови в III триместре беременности. Не исключено, что в данном случае Е2 выступает коактиватором Рг, поскольку известно его пермессивное действие в отношении про-гестагенов (Йена, Джаффе, 1998). Как видно из табл. 2, при добавление ХГ к комбинации стероидов данный эффект сохраняется. Латексстимули-рованная ЛЗХЛ также возрастает на фоне гормональной комбинации, соответствующей III триместру, что, по-видимому, в значительной степени обеспечивается Рг, обладающим самостоятельным стимулирующим эффектом.
Таким образом, комбинация ХГ и женских половых стероидных гормонов в дозах, экстраполированных с их уровня в III триместре беременности, активирует как спонтанную, так и стимулированную окислительную активность нейтрофилов в крови небеременных женщин. Кроме того, хеми-люминесценция интактных нейтрофилов стимули-
176
С. В. Ширшев, Е. М. Куклина, И В. Бессонова
руется под действием комбинации только Е2 и Рг в концентрации, характерной для III триместра, а люминесценция активированных нейтрофилов - в присутствии одного Рг также в дозе, близкой его концентрации в III триместре. Анализ этих данных позволяет сделать вывод о том, что латекс обладает коактивирующим действием в отношении Рг, как и Е2 - при спонтанной ЛЗХЛ нейтрофилов.
Таблица 2
Влияние репродуктивных гормонов на окисли-
тельную активность нейтрофилов человека
№ груп- пы Экспериментальное воздействие Интенсивность ЛЗХЛ, им п/с (М± т)
Спонтанный вариант 2387,91 1 599,508 Стимулированный вариант 7931,82 ± 1750,529
1 Контроль
2 ХГ, 100 МЕ/мл 2257,00 + 592,349 8014,91 1 1433,554
3 ХГ, 10 МЕ/мл 2337,18 ± 436,472 8811,00 ± 2260,720
4 Эстрадиол, 1,0 нг/мл 2205,091 455,729 8223,27 ± 1584,573
5 Эстрадиол, 10 нг/мл 2256,36 + 539,614 8531,82 + 1922,002
6 Прогестерон, 20 нг/мл 2682,09 + 499,897 8974,55 ± 2159,879
7 Прогестерон, 100 нг/мл 3047,91 ± 856,025 9354,55 ± 2140,888*
8 Эстрадиол, 1,0 нг/мл + ХГ, 100 МЕ/мл + прогестерон, 20 нг/мл 2214,64 + 366,753 8389,361 1722,206
9 Эстрадиол, 10 нг/мл + ХГ, 10 МЕ/мл + прогестерон, 100 нг/мл 3517,73 + 666,358* 9947,551 2187,766*
10 Эстрадиол, 1,0 нг/мл + прогестерон, 20 нг/мл 2191,46 + 408,509 7788,091 1140,298
11 Эстрадиол, 10 нг/мл + прогестерон, 100 нг/мл 3794,55 ± 971,142* 8148,821 1284,764
Примечание: * -Р<0,05 (сопоставление с контролем).
Корреляционный анализ не выявил статистически достоверной связи между показателями фагоцитоза нейтрофилов и люминесценции как в спонтанном, так и в стимулированном варианте. Этот факт, по-видимому, является следствием того, что гормоны, исследуемые в данной работе, по-разному модулируют окислительную и фагоцитар-
ную активность нейтрофилов и, возможно, действуют через различные вторичные мессенджеры.
Исключительно в плане дискуссии можно предположить, что самостоятельные фагоцитозстимули-рующие эффекты высокой дозы ХГ, сопоставимой с его концентрацией в крови женщин в I триместре беременности, нивелируются комбинацией половых стероидных гормонов для того, чтобы плод не сталкивался с активированными нейтрофилами. В этом случае гормоны выступают как фетопротекторы. В дозах, которые сопоставимы с эндогенной концентрацией половых стероидов и ХГ в заключительном, П1 триместре беременности, комбинация гормонов, напротив, создает условия повышенной активации нейтрофильных гранулоцитов, которые выступают физиологическими эффекторами в индукции родовой деятельности (Ширшев, 1999,2002).
Библиографический список
Белова Л. А. Биохимия воспаления и поражения сосудов. Роль нейтрофилов // Биохимия. 1997. Т. 62, № 4. С. 659-668.
Потапнев МЛ. Цитокиновая сеть нейтрофилов при воспалении// Иммунология. 1995. № 4. С. 34-40. Репродуктивная эндокринология. В 2-х т. Т. 1. / Пер. с англ. Под ред. С.С. Йена, Р.Б. Джаффе. М.: Медицина, 1998.
Руководство по эндокринной гинекологии / Под ред. Е.М. Вихляевой. ООО «Медицинское информационное агентство». М., 1998.
Ширшев С.В. Клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия хорионического гонадотропина // Успехи современной биологии. 1998. Т. 118, № 1. С. 69-86. Ширшев С. В. Механизмы иммунного контроля процессов репродукции. Екатеринбург, 1999. Ширшев С.В. Механизмы иммунноэндокринного контроля процессов репродукции. В 2-х т. Т. 2. Екатеринбург, 2002.
Crouch S.P.M., Fletcher J. Effect of ingested pentoxi-fyline on neutrophil superoxid anion production // Infect. Immun. 1992. Vol. 60. P. 4504-4511. Haslett C., Savill J.S., Meagher L.C. The neutrophil // Curr. Opin. Immunol. 1989. Vol. 2. P. 10-21.
The effect of reproductive hormones on basic functions of human neutrophils
S.V. Shirshev, E.M. Kuklina, I.V. Bessonova
The modulating effect of estradiol, progesteron and chorionic gonadotropin (CG) on phagocyte and oxidative activity in peripheral blood neutrophils of nonpregnant women have been studied. The rise of neutrophil phagocyte activity in the presence of high (100 Ul/ml) dose of CG and a combination of steroids irrespective of the dose was found. The luminol-dependent chemiluminescence of the cells is shown to be increased by a combination of steroids in high doses. In general, the reproductive hormones are able to increase neutrophil phagocytosis and raise the oxidative potential of intact and active neutrophils. According to extrapolation of this stimulatory effect on the third trimester of pregnancy we may suppose that basic reproductive hormones prepare nonspecific resistance cells to activation of delivery.
