CC BY
6волжский региональный центр физико-химических исследований».
ЛИТЕРАТУРА
1. Badelin V.G., Tyunina E.Yu., Krasnov A.V., Tyunina Giricheva N.I., Girichev G.V. // К^. I РЬу8. СЬеш. А 2012. V. 86. N 3. Р. 457-462.
2. Tyunina V.V., Krasnov A.V., Tyunina E.Yu., Badelin V.G., Girichev G.V. // J. Chem. Thermodyn. 2014. V. 74. P. 221-226.
3. Atavin E.G., Golubinskii A.V., Vilkov L.V., Kravchenko A.N., Lebedev O.V. // J. Struct. Chem. 2005. V. 46. N 3. P. 417-421.
4. Dunning T.H., Jr. // J. Chem. Phys. 1989. V. 90. N 2. P. 1007 1023.
УДК 547.963.3
C.B. Марутян, A.JI. Навасардян, JI.A. Навасардян
ВЛИЯНИЕ РЕНТГЕНОВСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ НА ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЕ ПАРАМЕТРЫ ДНК ДРОЖЖЕЙ, ОБЛУЧЕННЫХ ПРИ РАЗНЫХ ТЕМПЕРАТУРАХ
(Ереванский государственный университет) e-mail: marsed@ysu am
Осуществлено выделение ДНК из клеток дрожжей C.guilliermondii НП-4 и исследование изменений ее флюоресцентных параметров под воздействием рентгеновского облучения дрожжевых клеток при различных температурах. Показано, что облучение клеток при температуре О °С приводит к большей поврежденности двуцепочечной структуры ДНК, чем облучение при комнатной температуре, а в случаерепарированной ДНК наблюдается дальнейшее увеличение поврежденности облученной ДНК
Ключевые слова: ДНК, рентгеновское облучение, репарация, флюоресценция
Эукариотические клетки реагируют на внешние факторы, в том числе и на облучение, посредством сложного механизма взаимодействующих сигнальных систем. Несмотря на прово-
рименты, направленные на понимание всех сторон биологического действия облучения, пока не удается формировать единую картину повреждения и восстановления структуры ДНК.
-
ление ДНК дрожжей и исследование изменений ее
-
ния и пострадиационной репарации клеток. Облучение клеток проводилось при температуре 0 °С с целью подавления активности ферментов, участвующих в процессе восстановления повреждений ДНК в течение облучения. Было осуществлено также выделение и сравнительное исследование флюоресцентных параметров ДНК из дрожжей, которые подвергались облучению при комнатной температуре, а облученные клетки затем оставлялись при температуре 0 °С на 1ч, когда, согласно литературным данным, значительно уменьшается степень поврежденности ДНК [1].
МЕТОДИКА ЭКСПЕРИМЕНТА
-
вые клетки С^иШегтопёи НП-4, выращенные в жидкой культуральной среде [2].
Облучение проводилось на рентгеновской установке Дрон 3. Напряжение на рентгеновской трубке составляло 27 кВ, анодный ток - 17 мА. Источником облучения послужил анод Си, длина волны облучения составляла 1.54-10"8 см, общая доза облучения - 45кР.
Выделение и очистка ДНК из дрожжевых клеток было осуществлено по модификации [2] метода Мармура [3].
Исследование флюоресцентных параметров ДНК было осуществлено на флюоресцентном спектрофотометре РИюгоМах™ В качестве флюоресцентного зонда нами был использован бромистый этидий. Обработка данных и построение графиков было осуществлено с использованием программы БМЗОООБ.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование флюоресцентных спектров ДНК, полученных до и после рентгеновского об-
лучения дрожжей, показали, что максимум спектра возбуждения для дрожжевой ДНК составляет /..=285 нм, с интенсивностью 1=3.5-107 кв/сек, а максимум спектра флюоресценции - Л,=314 нм, с интенсивностью 1=2.2-104 кв/сек. Таким образом, получается, что интенсивность флюоресценции на 3 порядка ниже интенсивности возбуждения. По этой причине исследование собственной флюоресценции ДНК не дает существенной информации о структурном и функциональном состояний исследуемых систем. С этой точки зрения в процессе исследования флюоресцентных параметров биологически важных макромолекул, в частности нуклеиновых кислот, принято использовать метод флюоресцентного зондирования. Флюоресцентные зонды - красители, которые взаимодействуют
с нуклеиновыми кислотами, связываясь с их
-
почечную спираль путем интеркаляции. Вследствие такого взаимодействия меняются параметры флюоресценции красителя, что дает информацию о структурных особенностях исследуемой системы.
С целью исследования дрожжевой ДНК в
-
пользован бромистый этидий или 2.7-диамино-10-этил-9-дифенилфенантридий бромид, причем максимум спектра возбуждения комплекса ДНК-бромистый этидий составлял /.=51 Онм. а максимум флюоресценции /.=5Х4нм.
--
но исследование флюоресцентных параметров дрожжевой ДНК, подвергнутых рентгеновскому облучению в условиях постепенного нарастания концентрации бромистого этидия в растворе ДНК или, как этот метод принято называть в литературе, титрованием ДНК бромистым этидием. Полученные данные показывают, что для ДНК, выделенной как из необлученных, так и из облученных и подвергнутых пострадиационной репарации дрожжевых клеток, при постепенном повышении концентрации бромистого этидия в растворе ДНК наблюдается повышение интенсивности флюоресценции комплексов бромистый этидий-ДНК (БЭ-ДНК) до определенной концентрации красителя (рис.1), после чего при дальнейшем повышении концентрации бромистого этидия в растворе
-
.
Концентрация бромистого этидия, которая характеризует состояние полунасыщения ДНК красителем, для ДНК выделенной из необлученных клеток составляет СБэ:Сднк=1:18 (табл. 1), когда каждым 18 парам нуклеотидов ДНК соответствует одна молекула бромистого этидия. Для
1,2
О 2 4 6 8 10 12 14 Концентрация бромистого этидия, 10в M
Рис. 1. Флюоресцентные параметры комплексов БЭ-ДНК дрожжей облученных при комнатной температуре: 1 - необ-лученная ДНК. 2 - облученная ДНК 3 - репарированная ДНК
Fig. 1. Fluorescence parameters of complexes EB-DNA of yeasts irradiatedat at room temperature: 1 - non radiated DNA, 2 - X-radiated DNA, 3 - repaired DNA
Таблица 1
Флюоресцентные параметры комплексов бромистый этидий-ДНК дрожжей C.guilliermondii, подвергнутых облучению при комнатной температуре (p<0.005)
Table 1. Fluorescence parameters of complexes EB-DNA of yeasts irradiated at the room temperature (p<0.005) ^
СБЭ, х10"6М Сбэ;Сднк
Необлученная ДНК 4.53±0.2 1:18
Облученная ДНК 2.8±0.1 1:22
Репарированная ДНК 2.7±0.11 1:24
Примечание: СБЭ - концентрация бромистого этидия в растворе, мкМ, СБЭ:СдНК - соотношение концентраций бромистого этидия и ДНК
Note: СБЭ - the concentration of ethidium bromide in a solution, (.imol, СБЭ:СдНК - ratio of concentrations of ethidium bromide and DNA
облученной ДНК это состояние характеризуется значением СБэ:СдНк=1:22, а для репарированной ДНК - СБэ:Сднк=1:24. Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что ДНК, выделенная из облученных клеток, насыщается бромистым этидием быстрее, чем необлученная, а для репарированной ДНК скорость насыщения красителем самая высокая среди исследованных вариантов. Этот факт можно объяснить тем, что облученная ДНК носит структурные повреждения, в частности, однонитевые разрывы, что приводит к осложнению интеркаляции красителя, вследствие чего меньшее число молекул бромистого этидия связываются с ДНК и меняются флюоресцентные параметры комплексов ДНК-бромистый этидий. В случае репарированной ДНК возможно, что после процесса репарации в ДНК остались невосстановленные однонитевые разрывы, повреждения азотистых оснований, в том числе - ТТ-димеры, которые препятствуют внедрению бромистого эти-
дия в молекулу ДНК. Можно предположить также, что вследствие облучения возникают дефекты также и в процессе репарации, в частности, в ДНК-лигазном комплексе. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют, что в процессе репарации, помимо ожиданий, повышается степень поврежденности ДНК, и в репарирован-ной ДНК имеется большее число структурных .
Для ДНК, облученной при низкой температуре (О °С), также наблюдается насыщение ДНК бромистым этидием (рис. 2), а соотношение Сбэ:Сднк при состоянии полунасыщения ДНК красителем составляет 1:29 (табл. 2), что свидетель-
ной ДНК по сравнению с облучением при комнатной температуре. После пострадиационной репарации дрожжей в этом случае соотношение Сбэ:Сднк равняется 1:31, что свидетельствует об увеличении числа повреждений ДНК в процессе репарации, как и при облучении дрожжей при комнатной температуре.
1,2
0 5 10 15
Концентрация бромистого этиди я, 10"6 M |
Рис. 2. Флюоресцентные параметры комплексов БЭ-ДНК дрожжей, облученных при температуре О °С: 1 - необлучен-
ная ДНК, 2 - облученная ДНК, 3 - репарированная ДНК Fig. 2. Fluorescence parameters of complexes EB-DNA of yeasts irradiated at the 0 oC: 1 - non radiated DNA, 2 - X-radiated DNA, 3 - repaired DNA
В следующей серии экспериментов было проведено сравнительное исследование флюоресцентных параметров ДНК дрожжей, облученных при комнатной температуре и выдержанных в течение 1 ч при условиях, стимулирующих процесс репарации (среда с содержанием 100 тМ глюкозы, 30 °С) (рис. 3). Полученные данные свидетельсту-ют (табл. 3), что для облученной ДНК соотношение СБэ:Сднк=1:21. а для репарированной ДНК - 1:39.
Таким образом, облучение при низкой температуре приводит к большей поврежденности двуцепочечной структуры ДНК, чем в случае облучения при комнатной температуре, так как при
Таблица 2
Флюоресцентные параметры комплексов бромистый этидий-ДНК дрожжей C.guillierinoiulii, подвергнутых облучению при температуре 0 °С (р<0.005) Table 2. Fluorescence parameters of complexes EB-DNA of yeasts irradiated at the 0 oC (p<0.005)
сбэ, 10-6М сбэ:сднк
Необлученная ДНК 4.53±0.2 1:18
Облученная ДНК 2.83±0.08 1:29
Репарированная ДНК 2.65±0.06 1:31
Примечание: СБЭ - концентрация бромистого этидия в растворе, мкМ, СБЭ:СдНК - соотношение концентраций бромистого этидия и ДНК
Note: СБЭ -concentration of ethidium bromide in a solution (.imol, СБЭ:СдНК- ratio of concentrations of ethidium bromide and DNA
Рис. 3. Флюоресцентные параметры комплексов БЭ-ДНК дрожжей, облученных при комнатной температуре, выдержанных 1 ч при температуре 0 °С : 1 - необлученная ДНК 2 - облученная ДНК, 3 - репарированная ДНК Fig. 3. Fluorescence parameters of complexes EB-DNA of yeasts irradiated at the 0 oC and left at the room temperature for 1 h: 1 - non radiated DNA, 2 - X-radiated DNA, 3 - repaired DNA
Таблица 3
Флюоресцентные параметры комплексов бромистый этидий-ДНК дрожжей C.guilliermondii, подвергнутых облучению при комнатной температуре и оставленных на 1ч при температуре 0 °С (р<0.005) Table 3. Fluorescence parameters of EB-DNA complexes of yeasts irradiated at the room temperature and left
for 1 h at ^ the 0 oC (p<0.005)
СБЭ, х10-6М сбэ:сднк
Необлученная ДНК 4.53±0.2 1:18
Облученная ДНК 3.9±0.1 1:21
Репарированная ДНК 2.07±0.09 1:39
Примечание: СБЭ - концентрация бромистого этидия в растворе, мкМ, СБЭ:СдНК - соотношение концентраций бромистого этидия и ДНК
Note: СБЭ -concentration of ethidium bromide in a solution (.imol, СБЭ:СдНк-ratio of concentrations of ethidium bromide and DNA
низкой темпеартуре, по всей видимости, подавляется активность ферментов репарации во время облучения. Что касается облучения при комнатной температуре, то возможно, что эти ферменты действуют уже во время облучения и успевают восстановить часть повреждений ДНК. Одновре-
-
дается повышение степени поврежденности репа.
Возможно, что под влиянием облучения определенные изменения происходят в репарационной системе клетки, что приводит к дефектам репарационных ферментов. Вследствие этого может иметь место неправильная репарации повреждений ДНК или ферментативное допоражение ДНК, что, в свою очередь, приводит к двуцепочечным разры-
.
В случае, когда облученные клетки оставлялись при О °С на 1 ч, помимо ожиданиям происходит увеличение поврежденности ДНК, и при
-
Кафедра биохимии
ния ДНК красителем наивысшая именно в этом случае. Этот факт можно объяснить дефектами в репарационной системе, в частности, нарушением ферментов участвующих в репарации повреждений облученной ДНК.
ЛИТЕРАТУРА
1. Drasol V., Hutkova J. // Folia Biol.. 1972. V. 18. N 6. p. 424-433.
2. Навасардян JI.A. Влияние различных стрессовых факторов на белковые фракции и ДНК дрожжей. Дисс. д.биол.н. ЕГУ. Ереван. 2003. 197 е.;
Navasardyan L.A. The influence of various stress factors on protein fractions and yeasts DNA. Doctor dissertation for biolog. science. ESU. Erevan. 2003. 197 p. (in Russian).
3. Marmur J.J. //Mol. Biol. 1961. V. 3. P. 208.
УДК 541.1+536.412+531.756
Г.И. Егоров, Д.М. Макаров, A.M. Колкер
ИЗБЫТОЧНЫЕ ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СМЕСИ ВОДА + ЭТИЛЕНГЛИКОЛЬ ДО 100 МПа
(Институт химии растворов им. Г. А. Крестова РАН) e-mail: [email protected] rn
Рассчитаны изменения избыточных мольных термодинамических характеристик: энергии Гиббса АР^РС^, энтропии АР^Р8^ и энтальпии АР^РН^ смеси во-да(1)+этиленгликоль(2) в интервале температур 278.15-323.15 К и давлений до 100 МПа. Зависимости АР^РС^, Ар^р8^ и АР^РН^ от мольной доли этиленгликоля (х2) при всех значениях давления характеризуются наличием экстремумов. Обнаружена хорошая корреляция фазовой диаграммы и зависимости Ар^р8^ = /(х2).
Ключевые слова: вода, этиленгликоль, смеси неэлектролитов, высокое давление, избыточные термодинамические характеристики, энтальпия смешения
Наличие развитой пространственной сетки водородных связей в воде и этиленгликоле (ЭГ) [1-9] предопределяет свойства их смесей. Специфика сетки Н-связей в любом растворителе зависит от соотношения межмолекулярных и внутримолекулярных водородных связей. Молекула ЭГ может образовывать 27 теоретически возможных конформеров [3,10-11], но в жидком ЭГ устойчивы только две конформации молекул: гош- (свернутая) и транс- (развернутая). При обычных условиях
более 90% молекул ЭГ находятся в виде гош-конфор-мации [4,5,8], за стабилизацию которой ответственны внутримолекулярные водородные связи. В смесях с водой молекулы ЭГ также преимущественно находятся в виде гош-конформа-ции, хотя уменьшение концентрации ЭГ в смеси повышает долю от/ям/с'-конформаций [5,12].
-
си вода-ЭГ вызывают пристальный интерес [2,4,5,12-19], вследствие наличия у нее важных
