CC BY
7Key Words: autohemochemotherapy, antitumor therapy, autoblood, hematological parameters, biochemical parameters, cardiotoxic effect, cardiomyocytes, troponin, blood electrolytes.
Abstract: This article discusses one of the options for reducing the post-therapeutic complications caused by antineoplastic drugs used in the treatment of mammary glands cancer in cats. There are various ways to reduce the toxicity of chemotherapy drugs. It give an example of the use of autologous blood of illness cats, when incubating (mixing) it with doxorubicin, (the drug belongs to the group of cytostatics). This chemotherapy drug is used as monotherapy in the treatment of this disease in these animals.The doxorubicin has a pronounced cardiotoxic side effect, which can cause damage to the cells of the heart muscle (cardiomyocytes), which in turn leads to death due to the development of myocardial infarction. Below is a variant of the study, as well as a description of the results of these studies (the numerical values of the results are shown in the table), which are designed to neutralize this side effect. The described technique has not been previously used in cats. In addition, the above manipulations are quite simple and inexpensive to use. That plays an important role in the choice of methods and ways of treating tumor diseases.
Сведения об авторе:
Сухомлинов Вячеслав Вячеславович, аспирант 1-го курса ФГБОУ ВО «Донской государственный технический университет»; д. 1, пл. Гагарина, г. Ростов-на-Дону, Ростовская область, Российская Федерация, 344000; главный ветеринарный врач ветклиники «Феникс»; д. 2а, ул. Кирова, г. Батайск, 346880; тел. +7 (908) 196 42 97; e-mail: [email protected]
Author affiliation:
Siikhomlinov Vyacheslav Vyacheslavovich, 1st year postgraduate student of the Federal state budgetary educational institution (FSBEI) of higher education (HE) «Don State Technical University»; house 1, Gagarin square, Rostov-on-Don city, Rostov Region, Russian Federation, 344000; chief veterinarian of the Phoenix veterinary clinic; house 2a, Kirov str., Bataysk city, 346880; phone: +7 (908) 196 42 97; e-mail: [email protected]
DOI: 10.256907VETPAT.2020.40.41.003 УДК: 619:57.082.26:576.343:577.11 Плотникова Э. М., Архарова И. А
ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРНЫХ ПЕПТИДОВ-ЦИТОКИНОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ В КУЛЬТУРЕ
Ключевые слова: цитокины, культура клеток, цитотоксичность, метаболизм, МТТ-тест, интер-лейкин, С-С8Б, 1Ь-6.
Резюме: В настоящее время клеточные и тканевые культуры все чаще используют в качестве модельных систем для оценки токсичности и эффективности новых лекарственных средств, а также для производства вакцин и биофармацевтических препаратов. Для получения требуемого количества клеточного материала необходима экспансия клеток. Большую роль в этом играют подбор оптимальной среды культивирования, использование кондиционированной клетками среды и различных факторов, влияющих на деление клеток. Целью данного исследования было изучение влияния цитокинов на функциональную активность клеток животных в культуре. Проведено исследование влияния регуляторных пептидов - цитокинов (С-С8Б, !Ь-6) на метабо-
лизм клеточных линий почек эмбриона крупного рогатого скота (МЭБК) и почек золотистого сирийского хомячка (ВНК-21/13-02) методом МТТ-теста. 1Ь-б в целом оказывает стимулирующее действие на дыхание исследуемых клеток БНК-21/13-02 и МЭБК, причем наибольший уровень стимуляции наблюдался при концентрации б0 пг/мл. В результате проведенных исследований установлено, что препараты цитокинов в концентрациях 30-250 пг/мл не вызывают серьезных изменений морфологии клеток и в указанных дозах оказывают стимулирующее действие на метаболизм клеток путем стимуляции ЫЛОН-зависимых дыхательных ферментов (ок-сиредуктаз).
Введение
В центре внимания научного поиска остается проблема усовершенствования технологии изготовления и применения противовирусных препаратов. В свою очередь, растущие масштабы производства противовирусных вакцин требует совершенствования технологии культивирования клеток животных in vitro [1, 2]. В настоящее время клеточные и тканевые культуры все чаще используют в качестве модельных систем для оценки токсичности и эффективности новых лекарственных средств, а также для производства вакцин и биофармацевтических препаратов [1, 3]. Вакцинопрофилактика до настоящего времени остается основным вете-ринарно-санитарным мероприятием [4, 5]. Традиционная технология изготовления противовирусных вакцин на основе клеточных линий с использованием сывороток крови и растительных гидролизатов в качестве стимуляторов роста клеток in vitro уже не может в полной мере обеспечить растущую потребность практической ветеринарии в эффективных, безопасных и экономичных методах и средствах клеточной биотехнологии [6]. Большую роль в этом играет подбор оптимальной среды культивирования, использование кондиционированной клетками среды и наличие различных факторов, влияющих на деление клеток. Для получения требуемого количества клеточного материала необходима экспансия клеток, т. е. размножение в достаточном количестве [7]. С этой точки зрения весьма перспективным является добавление в среду ростовых факторов - стимуляторов метаболизма клеток.
В настоящее время в медицине и ветеринарии нашли широкое применение им-муномодуляторы нового поколения - ци-токины. Цитокины - универсальные регуляторы жизненного цикла клеток, они контролируют процессы дифференциров-ки, пролиферации, функциональной активации и апоптоза последних [8, 9].
Согласно данным ряда исследователей цитокины представляют собой регу-
ляторные пептиды, которые продуцируются почти всеми эукариотическими клетками [10]. Цитокины оказывают влияние практически на все клетки, воздействуя на большинство процессов, протекающих в организме [11, 12]. ИЛ-6 стимулирует пролиферацию культивируемых нормальных кератиноцитов человека [13, 14]. Вместе с колониестимулирующими факторами ИЛ-6 стимулирует пролиферацию и диф-ференцировку кроветворных стволовых клеток [15].
Использование цитокинов имеет ряд преимуществ перед другими препаратами (вакцины, сыворотки): во-первых, небольшие дозы цитокинов индуцируют интенсивный иммунный ответ и запускают синтез собственных медиаторов; во-вторых, многие цитокины обладают полифункциональностью (например, ИНФ); в-третьих, применение цитокинов сочетается с другими медиаторами, вакцинами, антибиотиками, сыворотками и т. д. [16]. Несмотря на большое количество данных о стимуляции цитокинами культур иммунокомпетент-ных клеток, до сих пор недостаточно изучен вопрос о влиянии цитокинов на культуры клеток животного происхождения.
В связи с вышеизложенным целью работы явилось изучение влияния цитокинов на функциональную активность клеток животных в культуре.
Материалы и методы исследований
В работе использовали перевиваемые клеточные линии MDBK (почки эмбриона крупного рогатого скота), BHK-21/13-02 (почки золотистого сирийского хомячка) из коллекции ФГБНУ «ФЦТРБ-ВНИВИ».
Использовали рекомбинантные препараты цитокинов в различных концентрациях. В качестве потенциальных стимуляторов роста культивируемых клеток in vitro использовали различные концентрации препаратов цитокинов (IL-6 (интер-лейкин-6), G-CSF (гранулоцитарно-макро-фагальный колониестимулирующий фактор).
Для исследования действия IL-6, G-CSF
на жизнеспособность BHK-21/13-02 и MDBK мы выбрали метод Mosmann (1983) с модификациями (MTT), основанный на восстановлении клетками солей тетразо-лия.
Метод позволяет косвенно оценить жизнеспособность исследуемых клеток по изменению оптической плотности суспензии обработанных клеток.
МТТ-тест основан на восстановлении митохондриальными дегидрогена-зами в метаболически активных клетках нового соединения тетразолия (3 -(4,5-диметилтиазол-2-ил) -5 - (3-карбокси-метоксифенил) -2 - (4-сульфофенил)-2Н -тетразолий) водорастворимым формаза-ном, который поглощает при 490 нм. Этот тест позволяет анализировать NAD(P) H-зависимые клеточные оксидоредуктаз-ные ферменты, которые могут косвенно отражать количество жизнеспособных клеток.
Клетки BHK-21/13-02 и MDBK культивировали в средах DMEM («Himedia, minimal essential medium») и Игла МЕМ, с добавлением 200 mM L-глутамина, («Himedia»), 10 % сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Пересев культуры делали по стандартной методике [17, 18]. Для опытов клетки рассевали в 96-лу-ночные панели по 100 тыс. клеток/мл. По периметру разливали DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline). Для оценки ростстимулирующей активности препараты цитокинов вносили в питательные среды в количестве от 30 до 1000 пг/мл. Культуры клеток с препаратами инкубировали
при 37 °С в атмосфере 5 % СО2. в течение 48-ми часов, после чего удаляли по 150 мкл среды, добавляли 20 мкл готового раствора МТТ (исходная концентрация 5 мг/мл в фосфатном буфере). Время инкубации с нитросинем тетразолием (НТ) - 4 часа в термостате при 37 °С.
Оптическую плотность регистрировали при длине волны 490 нм на многофункциональном спектрофотометре Тесап.
Результаты и обсуждение
В наших исследованиях влияние цитокинов определяли на клетках почек эмбриона крупного рогатого скота MDBK и почек золотистого сирийского хомячка ВНК-21/13-02 общепринятым методом МТТ-теста.
Действие цитокинов определяли через 48 часов совместной инкубации.
Результаты проведенной работы по исследованию действия ^-6 и G-CSF на жизнеспособность перевиваемых культур клеток ВНК-21-13/02, MDBK представлены на рисунках 1 и 2.
Как видно из представленных на рисунке 1 данных, ГЬ-6 в целом оказывает стимулирующее действие на дыхание исследуемых клеток ВНК-21/13-02 и MDBK, причем наибольший уровень стимуляции наблюдался при концентрации 60 пг/мл (132 и 148 % от контроля соответственно). В отношении MDBK можно сказать, что концентрации 30-125 пг/мл стимулировали клетки, при концентрации 250 пг/мл уровень приближался к контрольному, а дальнейшее увеличение концентрации (до 500 пг/мл) приводило к значительному пода-
Рис. 1. Влияние 1Ь-б на жизнеспособность клеток ВНК-21-13/02 и МОВК (приведены значения оптической плотности в % от контроля)
140%
Концентрация, % Линия клеток ВНК-21/13-02 Линия клеток 1УЮВК
Рис. 2. Влияние С-С8Р на жизнеспособность клеток ВНК-21-13/02 и МОВК (приведены значения оптической плотности в % от контроля)
влению дыхания активности клеток, которое составляет при концентрации 500 пг/ мл - 43 %, при 1000 пг/мл - 57 %. В отношении культуры клеток ВНК-21/13-02 наблюдалась несколько иная картина. А именно, клетки ВНК-21/13-02 демонстрировали незначительное подавление дыхания на 11 % при концентрации 250 пг/мл, а дальнейшее повышение концентрации цитокина приводит к значительному торможению дыхания, которое составляет при концентрации 500 пг/мл - 54 %, при 1000 пг/мл - 59 %.
В следующей серии опытов оценивали влияние цитокина G-CSF на жизнеспособность клеток ВНК-21/13-02 и MDBK.
Результаты проведенной работы представлены на рисунке 2.
Из данных рис. 2 видно, что внесение G-CSF в культивируемую среду в концентрации 100 пг/мл незначительно (на 4 %) подавляет дыхание митохондрий клеток ВНК-21/13-02, а дальнейшее повышение концентрации цитокина приводит к значительному торможению дыхания, которое составляет при концентрации 250 пг/мл -37 %, при 500 пг/мл - 70 % и при 1000 пг/мл - 80 %. Несколько иная картина наблюда-
лась при влиянии G-CSF на перевиваемую линию клеток MDBK. А именно, клетки MDBK демонстрировали легкое подавление активности, начиная с концентрации 250 пг/мл (27,6 % от контроля). Более выраженное ингибирование активности клеток MDBK мы наблюдали при концентрациях 500-1000 пг/мл (55 и 72 % от контроля соответственно).
По-видимому, наблюдаемая зависимость активности клеток определяется как различием в химическом строении исследуемых веществ, так и особенностями внутриклеточного метаболизма взятых в эксперимент клеточных линий.
Выводы и заключение
Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что препараты цитокинов в концентрациях 30-250 пг/мл не вызывают изменения морфологии клеток и в указанных дозах оказывают стимулирующее действие на метаболизм клеток путем стимуляции NADH-зависимых дыхательных ферментов (окси-редуктаз).
Библиографический список:
1. Самуйленко А. Я. Биотехнология и инновационное развитие производства ветеринарных биопрепаратов / А. Я. Самуйленко, В. И. Еремец, А. А. Раевский, С. А. Гринь, Н. К. Еремец // Международная практическая конференция, посвященная 95-летию Армавирской биофабрики 14-16 сентября: «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов
для АПК». Сборник научных трудов. - 2016. - С. 313-319.
2. Самуйленко А. Я. Оптимизация процесса промышленного культивирования культуры клеток ВНК-21/13-13 для производства вакцин против ящура, болезни Ауески и бешенства / А. Я. Са-муйленко, Н. В. Мельник, С. А. Гринь, Р. Н. Мельник и др. // Ветеринарный врач. - 2018. - № 1. - С.
24-28.
3. Трухан И. С. Питательная среда как ключевой фактор культивирования клеток млекопитающих / И. С. Трухан // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. -2018. - Т. 12. № 1. - С. 165-172.
4. Еремец В. И. Совершенствование и стандартизация технологических процессов, методов контроля и управления качеством противовирусных вакцин / В. И. Еремец, А. Я. Самуйленко, Н. К. Еремец и др. // Ветеринарный врач. - 2011. - № 3. - С. 4-7.
5. Kishimoto T. Interleukin-6: from basic science to medicine-40 years in immunology / T. Kishimoto // Annu. Rev. Immun. - 2005. - № 23. - pp. 1-21.
6. Плотникова Э. М. Влияние апифитоэкстракта на биологические свойства перевиваемых линий клеток MDBK, LEK и VERO / Э. М. Плотникова // Труды федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир. - 2018. - Том XVI. - С. 413-421.
7. Данлыбаева Г А. Влияние антиоксидантов и витаминов на функциональную активность клеток человека в условиях in vitro / Г А. Данлыбаева, Ж. Т. Ахмадеева // Биотехнология. Теория и практика. - 2016. - №1. - С. 4-13.
8. Орадова А. Ш. Лабораторная диагностика цитокинов (обзорная статья) / А. Ш. Орадова, З. К. Канжигалина, Р К. Касенова // Вестник КАЗН-МУ - 2015. - № 1 - С. 357-360.
9. Шахов А. Г Применение цитокинов и их индукторов молодняку сельскохозяйственных животных /А. Г Шахов, Л. Ю. Сашина, Ю. Ю. Владимирова и др. // Ветеринарная патология. - 2019. - № 2 (68). - C. 70-79.
10. De Benedetti IF Role of interleukin-6 in growth failure: an animal model / E De Benedetti, C. Meazza, A. Martini // Horm. Res. - 2002. - Vol. 58. - № 1. - P. 24-27.
11. Авдеева Ж. И. Цитокины и вакцины / Ж. И. Авдеева [и др.] // Тихоокеанский медицинский журнал.
- 2009. - № 3. - С. 22-27.
12. Abbas A. K. Basic immunology. Functions and disorders of the immune system / A. K. Abbas, A. H. Lichtman, S. Pillai // - 5th edition, Elsevier, 2016. -318 p.
13. Gearing A. J. H. Demonstration of cytokines in biological medicines produced in mammalian cell lines / A. J. H. Gearing, J. E. Cartwright, C. R. Bird [et al.] // Lancet. - 1989. - Vol. 28. - pp. 1011-1012.
14. Grossman R. M. Interleukin-6 is expressed in high levels in psoriatic skin and stimulates proliferation of cultured human keratinocytes / R. M. Grossman, I. Krueger, D. Yourish [et a1.] // Proc. Natl. Acad. Sci. -1989. - Vol. 86. - № 16. - pp. 6367-6371.
15. Brandt K. Interleukin-21 inhibits dendritic cell activation and maturation / K. Brandt, S. Bulfone-Paus, D. C. Foster, R. Rukert // Blood. - 2003. - Vol. 102. - № 12. - pp. 4090-4098.
16. Ада Г. Вакцины, вакцинация и иммунный ответ / Г Ада, А. Рамсей: пер. с англ. - М.: Медицина, 2002.
- 344 с.
17. Дьяконов Л. П. Животная клетка в культуре / Л. П. Дьяконов, В. И. Ситьков // - М.: Компания Спутник+, 2009. - 656 с.
18. Фрешни Р Я. Культура животных клеток: практ. руководство / Р. Я. Фрешни; пер. с англ. Ю. Н. Хомяков. - 4-е изд. испр. и доп. - М: Лаборатория знаний, 2018. - 791 с.
1. Samuylenko A. Ya. Biotehnologiya i innovatsionnoe
razvitie proizvodstva veterinarnyih biopreparatov [Biotechnology and innovative development of production of veterinary biologies] / A. Ya. Samuylenko, V I. Eremets, A. A. Raevskiy, S. A. Grin, N. K. Eremets // Mezhdunarodnaya prakticheskaya konferentsiya, posvyaschennaya 95-letiyu Armavirskoy biofabriki 14—16 sentyabrya: «Nauchnyie osnovyi proizvodstva i obespecheniya kachestva biologicheskih preparatov dlya APK». Sbornik nauchnyih trudov. - 2016. - S. 313-319.
2. Samuylenko A. Ya. Optimizatsiya protsessa promyishlennogo kultivirovaniya kulturyi kletok VNK-21/13-13 dlya proizvodstva vaktsin protiv yaschura, bolezni Aueski i beshenstva [Optimization of the process of industrial cultivation of cell culture BHK-21/13-13 for the production of vaccines against foot-and-mouth disease, aueski disease and rabies] / A. Ya. Samuylenko, N. V Melnik, S. A. Grin, R. N. Melnik i dr. // Veterinarnyiy vrach. - 2018. - # 1. - S. 24-28.
3. Truhan I. S. Pitatelnaya sreda kak klyuchevoy faktor
kultivirovaniya kletok mlekopitayuschih [Nutrient medium as a key factor in the cultivation of mammalian cells] / I. S. Truhan // Mezhdunarodnyiy zhurnal prikladnyih i fundamentalnyih issledovaniy. - 2018. - T. 12. # 1. - S. 165-172.
4. Eremets V. I. Sovershenstvovanie i standartizatsiya
tehnologicheskih protsessov, metodov kontrolya i upravleniya kachestvom protivovirusnyih vaktsin [Improvement and standardization of technological processes, methods of control and quality management of antiviral vaccines] / V. I. Eremets, A. Ya. Samuylenko, N. K. Eremets i dr. // Veterinarnyiy vrach. - 2011. - # 3. - S. 4-7.
5. Vide supra.
6. Plotnikova E. M. Vliyanie apifitoekstrakta na biologicheskie svoystva perevivaemyih liniy kletok
MDBK, LEK i VERO [Apifitoextracta Influence on the biological properties of transplanted cell lines MDBK, LEK and VERO] / E. M. Plotnikova // Trudyi federalnogo tsentra ohranyi zdorovya zhivotnyih. -Vladimir. - 2018. - Tom HVI. - S. 413-421.
7. Danlyibaeva G. A. Vliyanie antioksidantov i vitaminov
na funktsionalnuyu aktivnost kletok cheloveka v usloviyah in vitro vitro [Influence of antioxidants and vitamins on function-in in vitro] / G. A. Danlyibaeva, Zh. T. Ahmadeeva // Biotehnologiya. Teoriya i praktika. - 2016. - #1. - S. 4-13.
8. Oradova A. Sh. Laboratornaya diagnostika tsitokinov
(obzornaya statya) [Laboratory diagnostics of cytokines (review article)] / A. Sh. Oradova, Z. K. Kanzhigalina, R. K. Kasenova // Vestnik KAZNMU.
- 2015. - # 1 - S. 357-360.
9. Shahov A. G. Primenenie tsitokinov i ih induktorov
molodnyaku selskohozyaystvennyih zhivotnyih [The use of cytokines and their inductors to young farm animals] /A. G. Shahov, L. Yu. Sashina, Yu. Yu. Vladimirova i dr. // Veterinarnaya patologiya. - 2019.
- # 2 (68). - C. 70-79.
10. Vide supra.
11. Avdeeva Zh. I. Tsitokinyi i vaktsinyi [Cytokines and vaccines] / Zh. I. Avdeeva [i dr.] // Tihookeanskiy meditsinskiy zhurnal. - 2009. - # 3. - S. 22-27.
12-15. Vide supra.
16. Ada G. Vaktsinyi, vaktsinatsiya i immunnyiy otvet [Vaccines, vaccination and the immune response] / G. Ada, A. Ramsey: per. s angl. - M.: Meditsina, 2002.
- 344 s.
17. Dyakonov L. P. Zhivotnaya kletka v culture [Animal cells in culture] / L. P. Dyakonov, V. I. Sitkov // - M.: Kompaniya Sputnik, 2009. - 656 s.
18. Freshni R. Ya. Kultura zhivotnyih kletok: prakt. Rukovodstvo [Culture of animal cells: pract. Manual] / R. Ya. Freshni; per. s angl. Yu. N. Homyakov. - 4-e izd. ispr. i dop. - M: Laboratoriya znaniy, 2018. - 791 s.
DOI: 10.25690/VETPAT.2020.40.41.003 Plotnikova E. M., Arharova I. A.
THE INFLUENCE OF REGULATORY PEPTIDES-CYTOKINES ON THE FUNCTIONAL ACTIVITY OF ANIMAL CELLS IN CULTURE
Key Words: cytokines, cell culture, cytotoxicity, metabolism, MTT-test, interleukin, G-CSF, IL-6.
Abstract: At present, cell cultures are increasingly used as model systems for the production of vaccines and biopharmaceuticals, as well as for assessing the effectiveness and cytotoxicity of new drugs. An important role for maintaining stable growth and reproduction of cell lines of various origins is played by the selection of the optimal cultivation medium and various factors affecting cell division. The aim of this study was to study the effect of cytokines on the functional activity of animal cells in culture. The study of the influence of regulatory peptides - cytokines (G-CSF, IL-6) on the metabolism of cell lines of the kidney of the embryo of cattle (MDBK) and kidney of the Syrian golden hamster (BHK-21 / 1302) by the MTT test was carried out. IL-6 has a stimulating effect on the metabolism of the studied cells MDBK and BHK-21 / 13-02, while the highest level of stimulation was observed at a concentration of 60 pg / ml. As a result of the studies carried out, it was found that cytokine preparations do not cause serious disturbances in cell morphology and at concentrations of 30-250 pg / ml have a stimulating effect on cell metabolism.
Сведения об авторах:
Плотникова Эдие Миначетдиновна, доктор вет. наук, доцент, заведующая лабораторией культур клеток и питательных сред ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; Научный городок-2, г. Казань, Республика Татарстан, Российская Федерация, 420075; тел. +7 (843) 239 53 37; e-mail: adiya2397031@ mail.ru
Архарова Ирина Александровна, младший научный сотрудник лаборатории культур клеток и питательных сред ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; Научный городок-2, г. Казань, Республика Татарстан, Российская Федерация, 420075; тел. +7 (843) 239 53 37; e-mail: [email protected]
Author affiliation:
Plotnikova Edie Minachetdinovna, D. Sc. in Veterinary Medicine, Associate Professor, Head of the Laboratory of Cell Cultures and Nutrient Media of the FSBSI «Federal center for Toxicological, Radiation and Biological safety»; Scientific town-2, Kazan city, Republic of Tatarstan, Russian Federation, 420075; phone: +7 (843) 239 53 37; e-mail: [email protected]
Arkharova Irina Aleksandrovna, junior researcher of the Laboratory of Cell Cultures and Nutrient Media of the FSBSI «Federal center for Toxicological, Radiation and Biological safety»; Scientific town-2, Kazan city, Republic of Tatarstan, Russian Federation, 420075; phone: +7 (843) 239 53 37; e-mail: [email protected]
