CC BY
39
УДК 616.36 - 002.7:578.891:611.36 - 018
ВЛИЯНИЕ РАЗДЕЛЬНОГО И КОМБИНИРОВАННОГО ПРИМЕНЕНИЯ НИКОТИНАМИДА, МЕТИО-НИНА И а-ТОКОФЕРОЛА НА АКТИВНОСТЬ МОНООКСИГЕНАЗНОЙ, ГЛЮКУРО-, ГЛУТА-ТИОНКОНЪЮГИРУЮЩЕЙ СИСТЕМ ПЕЧЕНИ И ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ ПРИ ТЕТРА-ХЛОРМЕТАНОВОМ ГЕПАТОЗОГЕПАТИТЕ У КРЫС
М.И. Бушма (профессор, д.м.н.), Л.Б. Заводник (доц., к.м.н.), Л.Ф.
Легонькова (к.б.н.), И. В. Зверинский (к.б.н.)
Гродненский государственный медицинский университет Институт биохимии НАНБ, г. Гродно
Через 4 дня после однократного внутрижелудочного введения крысам CCL4 (2,5 мл/кг в виде 50% масляного раствора) регистрируется увеличение интенсивности «быстрой вспышки» хемилюминесценции в микросомах печени и сыворотке крови, явления цитолиза гепатоцитов (увеличение активности АлАТ в сыворотке крови), снижение скорости элиминации антипирина из крови. В микросомальной фракции печени при этом снижается содержание цитохромов Р-450 и b, активность NADH-цитохром b-редуктазы и цитозольной глутатионтран-сферазы. Введение крысам метионина (200 мг/кг), его комбинации с никотинамидом (60 мг/кг), без и, особенно, с дополнительным назначением витамина E (150 мг/кг) оказывало выраженное антиоксидантное и ферментнор-мализующее действие.
Ключевые слова: CCl-гепатит, перекисное окисление липидов, микросомы, метионин, витамины Е и РР.
Four days following the single intragastric administration of CCl4 to rats (2,5 ml/kg as а 50% oil solution) increased intensity of the hemiluminescence «fast» in liver microsomes and blood serum as well as hepatocyte cytolysis (elevated AlAT activity) and decrease of rate of antipyrine elimination from blood were recorded. The liver microsomal fraction demonstrated decreased cytochrome Р-450 and b5 concentrations, and NADH-cytochrome b5 Kductase cytosolic glutathione transferase activities. The administration of methionine (200 mg/kg), its combination with nicotinamide (60 mg/kg) and vitamin E (150 mg/kg) exerted marked antioxidant and enzyme-normalising effects.
Key words: tetrachlorometane, lipid peroxide oxidation, microsomes, methionine, nicotinamide, vitamin E.
Введение. Четыреххлористый углерод, как щью лекарственных средств, обладающих липот-
представитель малых молекул, окисляется цитох- ропным (метионин) и антиоксидантным (никотина-
ромом Р-450 IIE1 (преимущественно в печени) с мид, а-токоферол) действием при их раздельном
образованием реакционноспособных соединений, и комбинированном применении.
инициирующих реакции перекисного окисления ли- Методы исследования. В первой серии (30
пидов [11]. Следствием этого является деструк- крыс-самцов массой 150-190 г.) животным вводи-
ция мембранных структур гепатоцитов с наруше- ли CCl4 в желудок, однократно, в дозе 2,5 мл/кг (в
нием функции локализованных в них ферментных виде 50% раствора в вазелиновом масле). Через 6
систем биотрансформации ксенобиотиков [5]. В часов начинали вводить никотинамид (под кожу, 30
последующем в зонах печени с наибольшей кон- мг/кг, 2 раза в день, 4 дня), метионин (внутрь, 100
центрацией радикальных продуктов окисления ге- мг/кг, 2 раза в день, 4 дня) отдельно и в комбина-
патотоксина (центры долек) развиваются участки ции. Контрольным животным вводили равный
ожирения, дистрофии и некроза [12]. объем вазелинового масла (в желудок) и 0,85%
Исходя из вышеуказанного, целью настоящей раствора NaCl (под кожу). Через 12 часов после
работы явилось изучение возможного коррегиру- последнего введения веществ животных наркоти-
ющего действия нарушенных CCl4 активностей зировали диэтиловым эфиром и вводили в вену ан-
ферментных систем биотрансформации ксеноби- типирин (50 мг/кг, однократно) и декапитировали
отиков и перекисного окисления липидов с помо- через 90 минут. В сыворотке крови определяли
■ 1 3 -
концентрацию антипирина [10] и активность ала-нинаминотрансферазы (АлАТ) [6].
Во второй серии (45 крыс-самцов массой 160180 г) животным вводили СС14 в желудок, однократно, в дозе 2,5 мл/кг (в виде 50% раствора в вазелиновом масле). Через 6 часов начинали вводить в течение 4-х дней метионин (в желудок, 100 мг/кг, 2 раза в дань), отдельно и в комбинации с никотинамидом (под кожу, 30 мг/кг, 2 раза в день) и витамином Е (в мышцу, 150 мг/кг, 1 раз в день). Контрольным животным вводили равный объем вазелинового масла (в желудок) и 0.85% раствора №С1 (под кожу). Через 12 часов после последнего введения веществ животных декапитировали и в микросомальной фракции печени определяли содержание цитохромов Р-450 (суммарно) и Ь5, активность NADPH-цитохром Р-450 и NADH-цитох-ром Ь5 редуктаз (акцептор электронов — феррици-анид калия), скорость окисления NADPH и NADH, деметилироование амидопирина, этилморфина и гидроксилирование анилина, активность УДФ-глю-куронил- (субстрат — п-нитрофенол) и глутатион-S-трансфераз [субстраты — 1-хлор-2,4-динитро-бензол (ХДНБ) и бромсульфалеин (СБФ)] и содержание белка по методам, описанным ранее [2]. Регистрировали также уровень гидроперекисей липидов [4] и антиокислительную активность [3].
Результаты и обсуждение. Установлено, что через 4 дня после однократного введения СС14 (в желудок, 2,5 мл/кг, в виде 50% раствора в вазелиновом масле) у крыс регистрируются явления цитолиза гепатоцитов, о чем свидетельствует увеличение активности АлАТ на 60% в сыворотке крови. Элиминация антипирина из крови в этих условиях снижена на 37% (табл. 1.).
Введение животным с СС14-гепатозогепатитом никотинамида (под кожу, 60 мг/кг/день) в течение 4-х дней оказывало нормализующее действие как на повышенную активность АЛТ, так и сниженную элиминацию антипирина у этих животных. Более выраженное ускорение элиминации из крови антипирина наблюдается после введения метионина (в желудок, 200 мг/кг/день, 4 дня) и, особенно, его комбинации с никотинамидом. Содержание анти-
пирина в группе крыс, получавших СС14 и витамин-но-аминокислотный комплекс, не только нормализовалось, но и снизилось (на 45%) ниже значений интактных животных (табл. 1.).
Ингибирующее действие СС14 на элиминацию антипирина подтверждается и при изучении активности ферментных систем эндоплазматической сети гепатоцитов, участвующих в метаболической трансформации антипирина и других ксенобиотиков. Содержание цитохромов Р-450 и Ь5, активность NADH-цитохром Ь5 редуктазы, а также ци-тозольной ХДНБ глутатион^-трансферазы под влиянием СС14 снижаются соответственно на 58, 50, 41 и 36% в сравнении с интактными животными. Скорость окисления NADPH и NADH, активность NADPH-цитохром Р-450 редуктазы, ^де-метилирования этилморфина и амидопирина, р-гид-роксилирования анилина, цитозольной БСЛ-, мик-росомальной ХДНБ-глутатион^-трансфераз, а также УДФ-глюкуронилтрансферазы через 4 дня после однократного введения СС14 существенно не отличались от интактных животных (табл. 2).
Введение опытным животным метионина (в желудок, 200 мг/кг/день, 4 дня) оказывало активизирующее (хотя и в незначительной степени) действие на ингибированные СС14 ферментные системы микросомального окисления и глутатионконъ-югации ксенобиотиков в печени. Так под влиянием аминокислоты нормализовалась активность цитозольной ХДНБ-глутатион^-трансферазы, а содержание цитохрома Ь5 и активность НАДФН-цитохром Р-450 редуктазы превысили соответствующие значения нелеченных, получавших СС14 животных, на 28 и 31% (табл. 2).
Назначение опытным крысам комбинации ме-тионина и никотинамида (под кожу, 60 мг/кг/день, 4 дня) существенно не изменило характер и степень выраженности действия аминокислоты на монооксигеназную и глутатионконъюгирующую ферментные системы пораженной тетрахлормета-ном печени.
При назначении крысам с интоксикацией четы-реххлористым углеродом комбинации никотинами-да с метионином и витамином Е содержание ци-
Таблица 1. Влияние никотинамида (НА; под кожу, 60мг/кг/день х 4) и метионина (М; в желудок, 200 мг/кг/день х 4) (отдельно и в комбинации) на активность аланинаминотрансферазы и содержание антипирина (внутривенно, 50 мг/кг х 1) в сыворотке крови крыс с гепатозо-гепатитом (СС14; в желудок, 2,5 мл/кг в виде 50% масляного раствора х 1).
Показатель Интактные СС14 СС14+НА СС14+М сси+нл+м
Аланинаминотрансфераза, ммоль/ч л 1,52+0,08 2,46+0,15* 2,14+0,11 - -
Антипирин, мг/мл 22,8+1,25 31,4+2,8* 23,8+1,8# 21.1+1.3# 16.8+0.9*#
Примечание. * — р < 0.05 к интактным,
# — р < 0.05 к получавшим ССЦ крысам.
Таблица 2. Влияние метионина (М; в желудок, 200 мг/кг/день х 4), его комбинации с никотинамидом (НА; под кожу, 60 мг/кг/день х 4) и витамином Е (Е; в мышцу, 150 мг/кг/день х 4) на активность монооксигеназной, глюкуро- и глутатионконъюгирующей систем печени крыс с гепатозо-гепатитом (СС14; в желудок, 2,5 мл/кг, в виде 50% масляного раствора, однократно).
Показатель Интактные СС14 СС14+М СС14+М+НА СС14+М+НА+Е
Цитохром Р-450, нмоль/мг 0,45+0,04 0,19+0,02* 0,25+0,05* 0,17+0,05* 0,29+0,04*#
Цитохром Ь5, нмоль/мг 0,36+0,02 0,18+0,01* 0,23+0,02*# 0.21+0.02* 0.22+0.02*
Окисление NADPH, нмоль/мин/мг 1.95+0.23 1.41+0.18 1.65+0.17 2.13+0.40# 1.61+0.27
Окисление NADH, нмоль/мин/мг 2.99+0.37 2.25+0.24 2.66+0.21 2.11+0.21 1.96+0.08
NADPH-цитохром 0.15+0.01 0.13+0.01 0.17+0.01# 0.15+0.02 0.15+0.01
Р-450 редуктаза, мкмоль/мин/мг
NADPH-цитохром в5-редуктаза, мкмоль/мин/мг 8.35+0.51 4.91+0.77* 5.08+0.49* 3.86+0.42* 4.50+0.30*
№деметилирование этилморфина, нмоль/мин/мг 7,11+0,26 5,83+0,44 6,50+0,44 6,19+0,57 5,66+0,63*
№деметилирование амидопирина, нмоль/мин/мг 7,04+0,69 6,75+0,59 8,39+0,79 5,29+1,07 6,47+0,77
Р-гидроксилирование анилина, 0,75+0,06 0,72+0,06 0,67+0,05 0,65+0,05 0,78+0,01
нмоль/мин/мг
Глутатионтрансфераза 1) цитозоль:мкмоль ХДНБ/мин/мг, 1,07+0,09 0,69+0,06* 0,76+0,03 0,91+0,01 1,09+0,11#
мкмоль БСЛ/ мин/мг 12.22+0.92 11.20+0.70 12.80+0.90 11.20+0.15 10.60+0.82
2) микросомы мкмоль ХДНБ/ мин/мг 0.12+0.01 0.14+0.01 0.13+0.01 0.15+0.02 0.16+0.01*
УДФ-глюкуронил-трансфераза, нмоль/мин/мг 6.68+0.78 8.10+0.97 7.38+0.74 10.27+0.80 7.20+0.90
Примечание. * — р < 0.05 к интактным,
# — р < 0.05 к получавшим СС14 крысам.
тохрома Р-450 и активность цитозольной ХДНБ-глутатион^-трансферазы превысили соответствующие значения нелеченных опытных животных на 53 и 58%, а активность микросомальной ХДНБ-глутатион^-трансферазы превысила таковую у интактных крыс на 33% (табл. 2.).
Известно, что в механизме ингибирующего действия СС14 на гидроксилирующую и конъюгирую-щую системы печени, по-видимому, важную роль играет активация процессов перекисного окисления липидов [3]. Защитное действие изучаемых веществ, по-видимому, обусловлено их антиокси-дантными свойствами [1, 8]. Это предположение подтверждается и нашими данными.
Установлено, что через 4 дня после однократного внутрижелудочного введения крысам тетрах-лорметана (2,5 мг/кг) количество перекисных соединений (судя по значениям «быстрой вспышки» хемилюминесценции) в микросомальной фракции печени и сыворотке крови повышено в 2,0 и 1,5 раза. Введение метионина способствовало нормализации этого показателя в микросомальной фракции, сыворотке крови, а также моче животных. Кроме этого, обнаружено снижение скорости окисления липидов (судя по значениям tg а) в микросомах печени и увеличение антиокислительной активности микросом, сыворотки крови и мочи леченных животных (табл. 3.).
— 1
Антиокислительные свойства метионина у крыс с СС14-гепатозогепатитом в значительной степени усиливаются при его совместном применении с никотинамидом. При этом в микросомальной фракции печени регистрируется более выраженное снижение количества перекисей и уменьшается скорость окисления липидов. Величина соотношения антиоксиданты/прооксиданты (судя по значениям Ш) и антиокислительная активность повышаются. В сыворотке крови и моче выявлена аналогичная закономерность: более выраженное снижение количества перекисей липидов и увеличение антиокислительной активности.
Еще более выраженным антиоксидантным действием у крыс с СС14-гепатозогепатитом обладает комбинация метионина с никотинамидом и витамином Е. Под их влиянием в микросомальной фракции печени значительно снижается количество перекисей, способность липидов к переокислению (судя по значениям «медленной вспышки» хеми-люминесценции) и скорость окисления липидов. Коэффициент соотношения антиоксиданты/проок-сиданты и антиокислительная активность при этом повышаются. Антиоксидантное действие тройного витаминно-аминокислотного комплекса установлено также при исследовании сыворотки крови и мочи животных (уменьшение количества перекисей и увеличение антиокислительной активности) (табл. 3).
5 —
Таблица 3. Изменение показателей хемилюминесценции у крыс с гепатозогепатитом (CCl4; внутрь, 2.5 мл/кг, в виде 50% масляного раствора х 1) под влиянием введения метионина (М; 200 мг/кг/день х 4) и его комбинации с никотинамидом (НА; под кожу, 60 мг/кг/день х 4) и витамином Е (Е; под кожу, 150 мг/кг/день х 4).
Показатель Интактные CCl4 CCl4+M CCLt+М+НА CCl4+M+HA+E
Микросомальная фракция печени
"Быстрая вспышка" ХЛ, имп/с 98,2+6,5 194,0+27,2* 108,2+13,8# 75.2+11. 1 *# 86.2+12.1#
"Медленная вспышка", имп/с 228.3+42.3 303.9+31.8 239.9+38.6 192.8+50.9 160.1+25.5*#
tu, с 31.6+2.8 27.2+3.8 38.5+6.3 47.8+8.2# 55.0+5.0*#
tg а 8.97+0.72 12.2+0.68 9.35+1. 1# 7.19+1.07# 4.93+0.81#
Антиокислительная 31.6+0.64 28.2+0.86 33.1+1.4# 34.9+0.91*# 36.2+0.86*#
активность, %
Сыворотка крови
"Быстрая вспышка", имп/с 94.5+14.7 138.9+19.7* 90.3+18.6# 86.2+13.6# 69.2+17.1#
Антиокис-лительная 30.8+2.3 26.0+1.1 31.7+0.73# 33.2+0.83# 34.9+1.1#
активность, %
Моча
"Быстрая вспышка", имп/с 277+40 322+41 186+36# 133+21*# 154+24*#
Антиокислительная 2.42+0.31 1.97+0.40 2.99+0.30# 5.11+0.84*# 5.04+0.37*#
активность, %
Примечание. * — р < 0.05 к интактным,
# — р < 0.05 к получавшим CCl4 крысам.
Таким образом, доказано, что метионин, его комбинация с никотинамидом и, особенно, с дополнительным назначением витамина Е, в значительной степени нормализуют сниженную у крыс с CCl4-гепатозогепатитом функцию монооксигеназной и глутатионконъюгирующей систем печени. При этом ингибируются активированные CCl4 реакции перекисного окисления липидов и уменьшается степень цитолиза гепатоцитов.
В механизме лечебного действия веществ при тетрахлорметановой интоксикации, по-видимому, важную роль играет их антиокислительное, мемб-раностабилизирующее (витамин Е, никотинамид и метионин) и липотропное (метионин) действие; участие в репарации поврежденных мембран (стимуляция метионином биосинтеза белков и фосфо-липидов) и транспорте электронов (никотинамид в форме NADPH и NADH) [7, 9, 13].
Выводы
1. CCl4 (в желудок, 2,5 мл/кг в виде 50% раствора, однократно) через 4 дня вызывает у крыс повышение в сыворотке крови активности АлАТ и уровня перекисных соединений, снижение интенсивности окисления и конъюгации ксенобиотиков с глутатионом.
2. Никотинамид, метионин, их комбинация и, особенно, сочетание с витамином Е в значительной степени предотвращают гепатотоксическое действие CCl4.
Литература
1. Бунятян Н. Д., Герасимова О. А., Сахарова Т. С., Яковлева Л. В.
Природные антиоксиданты как гепатопротекторы. // Экспе-рим. и клин. фармакол. - 1999 - Т. 62, № 2. - С. 64-67.
2. Бушма М.И., Легонькова Л.Ф., Абакумов Г.В., Заводник Л.Б. Влияние длительного введения ундевита и его комбинации с кордиамином на гидроксилирующую, глюкуро-, глутатионконъ-югирующую системы и перекисное окисление липидов печени интактных крыс. // Вопр. питания. - 1994, - N 6. - С. 12-15.
3. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах. // Соросов. образов. журн. - 2000. - Т. 6, № 12. - С. 13-19.
4. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. - М.: Наука. - 1980. -С. 74-92.
5. Губский Ю.И. Коррекция химического поражения печени. -Киев: Здоров"я, 1989. - 167 с.
6. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. - Мн. - 2000. - Т. 1. - С. 109 - 111.
7. Моругова Т. В., Лазарева Д. Н., Влияние лекарственных средств
на свободно-радикальное окисление. // Эксперим. и клин. фар-макол. - 2000. - Т. 63, № 1. - С. 71 — 75.
8. Машковский М.Д. Лекарственные средства. — М.: Медицина. -2000. - Т. 2. - С. 305 - 307.
9. Мецлер Д. Биохимия. (Пер. с англ.) — М.:Мир. - 1980. - Т. 3.
10. Brodie В.В., Axelrod J., Soberman R., Levy B.B. The estimation of antipyrine in biological materials. // J. Biol. Chem. - 1949. -Vol. 179, N 1. - P. 25 - 30.
11. Liber C.S. Cytochrome P-4502E1: Its physiological and pathologocal role. // Physiol. Rev. - 1997. - Vol. 77, No 2. - P. 517 - 544.
12. Resknagel R.O., Glende E.A., James Jr., Dolak J.A. Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity. // Pharmac. Ther. - 1989. - Vol. 43. - P. 139 - 154.
13. Thannickal, VJ., Fanburg, В.К NAD(P)H - oxidation as donors of free radicals. // Am. J Physiol. - 2000. - Vol. 279. - Р. 10051028.
