CC BY
31
УДК 615. 281 [6:539] - 022.532
ВЛИЯНИЕ РАСТВОРОВ ХИТОЗАНА НА КЛИНИЧЕСКИЕ ШТАММЫ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Е.В. ГЛАДКОВА, И.В. БАБУШКИНА, И. А. МАМОНОВА, С.В. БЕЛОВА
ФГБУ «СарНИИТО» Минздравсоцразвития России 410002, ул. Чернышевского, 148, тел. 8(8452) 234668, [email protected]
Аннотация. Целью работы было сравнительное изучение антибактериального действия растворов хитозана различной концентрации в ацетатном буфере на клинических метиллрезистентных штаммах
Staphylococus aureus.
Установлены как антибактериальная активность хитозана, так и его ростостимулирующие свойства в отношении изучаемых штаммов в зависимости от рН среды и конечной концентрации хитозана в субстрате. Перспектива использования хитозана в растворах в качестве антибактериального средства для лечения гнойно-воспалительных осложнений, вызванных золотистым стафилококком, требует детального изучения условий применения.
Ключевые слова: метициллинрезистентность, Staphylococus aureus, антибактериальные свойства, ростстимулирующие свойства.
INFLUENCE OF CHITOSAN SOLUTIONS ON CLINICAL STRAINS STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
Е.У. GLADKOVA, I.V. BABUSHKINA, I.A. MAMONOVA, S.V. BELOVA
Federal Government-Financed Institution "Saratov Research Institute of Traumatology and Orthopaedics " of Ministry of Public Health and Social Development of the Russian Federation 410002, Chernyshevskogo St. 148, Ph. 8 (8452) 234668, [email protected]
Resume. The research objective was a comparative study of antibacterial action of chitosan solutions of various concentration in the acetate buffer on clinical strains Staphylococus aureus. Both chitosan antibacterial activity and its growth stimulating characteristics concerning MRSA depending on рН medium and the finite chitosan concentration in a substratum are determined. The prospect of use of chitosan in solutions as an antibacterial agent for treatment of suppurative inflammatory complications caused by aurococcus, requires a detailed study of application conditions.
Key words: MRSA, Staphylococus aureus, chitosan, antibacterial activity, growth stimulating characteristics.
Одним из актуальных вопросов современной травматологии и ортопедии остается проблема профилактики, возникновения и лечения инфекционных осложнений [3].
При исследовании гнойных очагов пациентов травматолого-ортопедического профиля выявляется разнообразная микрофлора: Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Escherichia spp., Pseudomonas spp., Klebsiella spp., Pseudomonas spp., Enterobacter spp., Serratia spp., Proteus spp. [2]. Наиболее часто высевающийся у пациентов хирургических стационаров возбудитель - Staphylococcus aureus, характеризуется, как правило, полиантибиотикорезистентностью [2, 7].
Несмотря на внедрение современных антибактериальных препаратов, проблема поиска и разработки новых антибактериальных средств, характеризующихся высокой антимикробной активностью, отсутствием иммунодепрессивного действия, минимальной аллергенностью и токсичностью, остается открытой.
Ключевым требованием, предъявляемым к данной категории средств, является биосовместимость и биодеградируемость. В свете данных характеристик пристальное внимание уделяется природному биополимеру полимеру хитозану, обладающему широким спектром биологических свойств [5, 6]. Одним из ведущих свойств хитозана являются его выраженные антибактериальные свойства [4]. Механизм его действия реализуется, в первую очередь, посредством влияния на клеточную мембрану [1].
Целью работы явилось сравнительное изучение антибактериального действия растворов хитозана различной концентрации в ацетатном буфере на клинических штаммах St.aureus.
Исследования проводили на 30 штаммах St.aureus, полученных от 30 больных с развившимися гнойными осложнениями, находящимися на лечении в травматолого-ортопедическом стационаре Сар-НИИТО. Посев на твердую питательную среду Nutrigen Agar (Becton Dickinson, США), выделение St.aureus производили общепринятыми методами. Идентификация штаммов осуществлялась с использованием анализатора микробиологического BBL Auto Reader BD (Becton Dickinson, США). О метицил-линрезистентности судили по результатам скрининговых исследований с использованием MeReSa Agar Base (MRSA Alert Kit) (Becton Dickinson, США), основа агара для идентификации метициллинрезистент-
ных St.aureus (HiMediaLaboratories, Индия). Кроме того, определяли антибиотикочувствительность отобранных штаммов с использованием систем «Сенси-диск» (Becton Dickinson, ОША). В работе использовали хитозан с сорбционной активностью по ионам меди, мг/г, не менее 86,3; содержанием основного вещества не менее 93,4, с рН 1% р-ра не более 5,17 и динамической вязкостью не менее 101,7, произведенным ЗАО «Биопрогресс».
Изучали антибактериальную активность растворов хитозана в ацетатном буфере с различными значениями рН среды: 4,1; 4,96; 6,0. Концентрация хитозана составляла: опытная группа 1 - 0,1; 0,2; 0,5; 1,0; 2,0; 5,0 мг/мл. К исследуемым растворам добавляли по 100 мкл конечной суспензии метициллинрези-стентных St.aureus (MRSA) с содержанием 300000 КОЕ/мл в соответствующих растворителях, встряхивали и оставляли на 60 минут при комнатной температуре. После завершения времени воздействия бактериальную суспензию в количестве 100 мкл высевали на чашки с питательным агаром. После суточной инкубации в термостате при 37°С производили подсчёт колоний. В качестве контроля использовали бактериальную взвесь в соответствующих растворителях.
Вторая серия экспериментов включала нанесение бактериальной суспензии (1000 КОЕ) на поверхность чашек Петри с твердой питательной средой и хитозаном. После суточной инкубации при 37°С производили подсчет колоний.
Статистическая обработка материала включала в себя подсчет средних значений (М), их среднеквадратичных ошибок (m) и уровня достоверности (p).
Результаты подсчёта количества колоний , выросших на твёрдых питательных средах после воздействия растворов хитозана представлены в табл. 1.
Таблица 1
Влияние рН среды и концентрации хитозана на ростовые свойства MRSA
Концентрация хитозана, мг/мл Количество микробных клеток на твердых питательных средах
Растворители
Изотонический р-р NaCl Ацетатный буфер, рН=4.1 Ацетатный буфер, рН=4.96 Ацетатный буфер рН=6,0
0 (контроль) 1058,8±104,8 356,0±7,4 446,87±34,7 560,0±36,0
0,1 374,3±34,8*** 466,7±3,9*** 587,37±52,2** 406,4±21,6***
0,2 281,8±26,6*** 326,7±13,5 564,5±24,8* 476,8±20,5**
0,5 254,5±20,9*** 196,0±15,8*** 659,0±30,2*** 392,8±30,4***
1,0 451,5±63,9*** 228,0±18,7*** 534,0±47,7 579,2±31,7
2,0 288,1±72,0*** 332,0±18,7 417,8±33,0 355,2±31,3***
5,0 244,9±67,7*** 400±16,2** 336,9±47,2 355,2±27,0***
Примечание: р<0,001 по отношению к контрольной группе; р<0,05 по отношению к контрольной группе; р<0,01 по отношению к контрольной группе.
Число микроорганизмов, выросших на твердой питательной среде после 60-минутного воздействия хитозана в физиологическом растворе при всех концентрациях хитозана, было ниже (р<0,001), чем в контроле. Раствор хитозана в ацетатном буфере при рН=4,1 демонстрировал ростстимулирующие свойства в отношении клинических штаммов стафилококка в концентрации 0,1 мг/мл (р<0,001), 5,0 мг/мл (р<0,05). Ингибирующие свойства (р<0,001) раствора хитозана в ацетатном буфере (рН=4,1) подтверждены при концентрации действующего вещества 0,5 мг/мл и 1,0 мг/мл. Растворы хитозана с более низкой концентрацией действующего вещества: 0,1 мг/мл (р<0,05), 0,2 мг/мл (р<0,01) и 0,5 мг/мл (р<0,001) проявляли ростстимулирующий эффект. При повышении рН до 6,0 было отмечено ярко выраженное антибактериальное действие (р<0,001) растворов хитозана с концентрацией 0,1 мг/мл; 0,5мг/мл; 2,0мг/мл; 5,0 мг/мл, а также -0,2 мг/мл (р<0,05).
Внесение хитозана непосредственно в среду АГВ приводило к ингибиции роста микроорганизмов уже при концентрации 1 мг/мл хитозана в субстрате и к полному прекращению роста бактериальных клеток при концентрациях 2 мг/мл и 5 мг/мл. Результаты исследования представлены в табл. 2.
Таблица 2
Влияние хитозана в твердых питательных средах на ростовые свойства клинических
штаммов стафилококка
Исследуемые группы
Контроль, КОЕ 1 мг/мл хитозана в твердой питательной среде, КОЕ/мл 2 мг/мл хитозана в твердой питательной среде, КОЕ/мл 3 мг/мл хитозана в твердой питательной среде, КОЕ/мл
1957,1±34,1 908,3±19,3*** Роста нет Роста нет
Примечание: р<0,001 по отношению к контрольной группе.
Таким образом, установлены как антибактериальная активность хитозана в отношении метициллин-резистентных клинических штаммов стафилококка, так и его ростстимулирующие свойства в отношении данного возбудителя. Выявленные особенности требуют учета условий воздействия, таких как рН среды и конечной концентрации хитозана в субстрате. Перспектива использования природного биополимера хитозана в растворах в качестве антибактериального средства для лечения гнойно-воспалительных осложнений, вызванных золотистым стафилококком, требует детального изучения условий применения.
Литература
1. Куликов, С.Н. Исследование бактерицидных свойств хитозана / С.Н. Куликов // Рыбпром, 2010. -№ 2. - C.36-41.
2. Науменко, З.С. Устойчивость Staphylococcus aureus к антибактериальным препаратам / З.С. Нау-менко, Л.В. Розова // Гений ортопедии, 2007. - № 2. - C.36-38.
3. Пхакадзе, Т.Я. Выбор антибактериальных средств для профилактики и лечения инфекционных осложнений у травматолого-ортопедических больных на основе микробиологического мониторинга / Т.Я. Пхакадзе, Г.Г. Окропиридзе, Э.С. Малышева // Вестник травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова, 2009. - № 4. - С.73-78.
4. Регенерирующая активность и антимикробное действие низкомолекулярного хитозана / Т. А. Байтукалов, О.А. Богословская, И.П. Ольховская [и др.] // Изв. РАН. Сер. Биология. 2005, Т. 32. C. 659663.
5. Хитин и хитозан: Получение, свойства и применение / Под ред. К.Г. Скрябина, Г.А. Вихоревой, В.П. Варламова - М.: Наука, 2002. - 368 с.
6. Шаповалов, С.Г. Современные раневые покрытия в комбустиологии / С.Г. Шаповалов // ФАР-Миндекс-Практик, 2005. - Вып. 8. - С.38-46.
7. Эпидемиология анибиотикорезистентности нозокомиальных штаммов Staphylococcus aureus в России: результаты многоцентрового исследования / А.В. Дехнич, И.А. Эйдельштейн, А. Д. Нарезкина [и др.] // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия, 2002. - Т.4. - № 4. - С.325-336.
