CC BY
73
Общая биология
Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 90-93
УДК 535.21:615.847:577.3
© 2011 г.
ВЛИЯНИЕ РАДИОВОЛН НА ЛИЗОГЕННЫЕ КЛЕТКИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ И БАКТЕРИОФАГ X
С.Л. Малиновская 1, В.А. Монич 1, Е.Д. Пятова 1, С.И. Лютов 1,
В.Ф. Лазукин 1, Д.С. Малиновский 2, Ю.А. Сизов 3
1 Нижегородская государственная медицинская академия
2 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского
3 ООО «Коминтек НН», Н. Новгород
Поступила в редакцию 10.05.2011
Изучено влияние микроволн и тепла на выживаемость лизогенных клеток Escherichia coli и на мутантный бактериофаг. Показано, что микроволны оказывают влияние на выживаемость Escherichia coli и на титр инфекционных единиц. Специфичное воздействие электромагнитного излучения может маскироваться тепловым. Наиболее заметно его проявление при частотной модуляции микроволнового излучения.
Ключевые слова: микроволны, лизогенные клетки, мутантный бактериофаг.
Введение
Проблема поиска специфических эффектов действия радиоволн сверхвысокочастотного диапазона (СВЧ или микроволн) на биологические объекты остается актуальной в течение нескольких последних десятилетий [1-4]. Интерес к ней возрастает в связи с расширением бытового использования радиоволн СВЧ-диапа-зона (мобильных телефонов, Blue tooth-устройств, микроволновых печей). Поиски этих эффектов затрудняются тем, что нагрев, вызванный СВЧ-излучением, может модифицировать или скрыть изучаемые специфичные (нетепловые) влияния радиоволн [5, 6]. В связи с этим удобным объектом исследования являются одноклеточные организмы. В особенности это касается лизогенных клеток, в которых возможна индукция профагов [7, 8].
Материалы и методы
В работе использован штамм лизогенных бактерий Escherichia coli (E. coli) С 600 c1857), содержащих профаг ^с1857 с мутацией в гене c1, приводящей к образованию термолабильного репрессора, и суспензия бактериофага (^c1857). Суспензию клеток получали путем разведения и подращивания 18-часовой культуры при 30°С с аэрацией до плотно^и (1-2)108 кл/мл (экспоненциальная фаза роста). Суспензию бакте -риофага (^c1857) в мясо-пептонном бульоне (МПБ) получали путем термоиндукции
(экспозиция при 43°С в течение 1 часа) лизиса лизогенных клеток E. coli С 600 (^c1857). Облучение суспензии клеток бактерий и фаговых частиц смодулированным, амплитудно-модулированным (AM) и ча-стотно-модулированным (ЧМ) полем проводили в тефлоновых кюветах, помещенных в волноводную ячейку сечением 35x15 мм, при следующих условиях:
- несущая частота - 9.372 ГГц,
- плотность потока мощности (ППМ) от 3.4 до 27.2 мВт/см2,
- режим генерации - непрерывная генерация (НГ), амплитудно-импульсная модуляция (АИМ), ЧМ: АИМ (длительность импульса Тгап = 5 мксек, частота следования импульсов ^оет = 9000 Гц), ЧМ (модуляция времени перестройки модуляции, тперест = 0.08 сек и 1 сек, девиация частоты 9-12 ГГц), экспозиция 60 мин.
Действие тепла на клетки бактерий в диапазоне температур от 33 до 40°С изучали непосредственно в волноводной ячейке при установленных температурах термостата. Дополнительно выставлялись соответствующие «контроль» и «ложное облучение».
Качество жизнеспособных клеток лизогенных бактерий оценивали по их способности формировать колонии на мясо-пептонном агаре (МПА), а титр инфекционных единиц определяли по стандартной методике путем подсчета количества стерильных пятен на газоне чувствительного к фагу штамма E. coli С 600 на плотной питательной среде УЕА (экстракт дрожжевого автолизата 5 г/л, пептон - 15 г/л,
NaCl - 5 г/л, MgSO4 - 4 г/л, агар-агар - 20 г/л) при 30°С.
Для разбавлений использовали физиологический раствор с добавкой MgSO4 - 4 г/л. Критерием действия поля и тепла служило изменение качества жизнеспособных клеток и титра инфекционных единиц в культуре по сравнению с контролем.
Расчет выживаемости системы к действию тепла проводили по формуле
k = (No -Nk)/NkAT , где N0 - количество жизнеспособных клеток или инфекционных единиц в культуре при нагреве на 1°С в течение 60 мин, Nk - исходное количество жизнеспособных клеток или инфекционных единиц в культуре при начальной температуре, АТ - изменение температуры при нагреве суспензии.
Результаты и их обсуждение
Оценка чувствительности системы лизогенных бактерий E. coli С 600 (Ле1857) в экспериментальных кюветах. Для того чтобы более точно провести сравнительную оценку действия СВЧ-излучения и тепла на лизогенные бактерии E. coli С 600 (A,c1857), была изучена динамика лизиса культуры в диапазоне температур от 33 до 40°С в экспериментальных кюветах, расположенных в волноводной ячейке.
Результаты расчетов термочувствительности системы приведены табл. 1.
Таблица 1
Оценка чувствительности культуры лизогенных бактерий E. coli С 600 (Xc1857) к нагреву
Интервал нагрева, °С Выживаемость Изменение титра инфекционных единиц
33-34 -0.20±0.25 1.13±4.70
34-35 0.25±0.43 14.0±24.46
35-36 -0.22±0.22 6.34±1.54
36-37 -0.55±0.09 46.44±15.75
37-38 -0.99±0.01 1.53±0.52
38-39 -0.90±0.24 0.87±0.53
39-40 -0.36±0.83 0.28±0.45
Как видно из таблицы, наибольшее влияние на выживаемость бактерий в обоих случаях оказывал нагрев суспензии от 37 до 38°С, а титр инфекционных единиц в культуре существенно возрастал при изменении температуры от 36 до 37°С. Поэтому дальнейшие исследования влия-
ния электромагнитного поля (ЭМП) на лизогенные клетки кишечной палочки осуществлялись при температуре 36°С, при которой отмечается достаточно высокая чувствительность системы к тепловому воздействию по обоим регистрируемым параметрам.
В серии экспериментов при выбранной температуре 36°С было проведено изучение дозо-вой зависимости гибели клеток и изменения титра инфекционных единиц в культуре в условиях действия немодулированных, АИМ и ЧМ радиоволн. В табл. 2 представлены результаты, показывающие эффективность гибели клеток в зависимость от величины плотности потока мощности СВЧ-излучения. Для сравнения приведены также данные по выживанию клеток при нагреве. Полученные данные позволяют отметить тенденцию к большей эффективности нагрева по сравнению с влиянием СВЧ-излучения.
Как видно из этой таблицы, в пределах точности эксперимента достоверных различий по критерию гибели клеток под действием всех изученных видов СВЧ-облучения обнаружить не удалось. Исключением являются опыты с ППМ, равной 10.2 мВт/см2. Эффективность гибели клеток под действием немодулированных радиоволн была выше, чем при действии модулированных радиоволн, в изученном диапазоне мощностей. Более точные сравнительные оценки ограничиваются погрешностями микробиологических методов.
В табл. 3 представлены результаты изменения титра инфекционных единиц в культуре E. coli С 600 (Xc1857) при облучении лизогенных бактерий радиоволнами, а также при изменении температуры образцов.
Как и при оценке влияния СВЧ-излучения на выживаемость, в данном случае следует отметить более низкую эффективность действия радиоволн по сравнению с теплом. Вместе с тем, степень эффективности действия СВЧ-излучения при одинаковой подводимой энергии убывает в следующей последовательности: НГ ^ АИМ ^ ЧМ (хдерест = 1 сек) ^ ЧМ (т^рест = = 0.08 сек). Однако отмеченная тенденция лежит на границе пределов достоверности (табл. 3). Поэтому для более точной оценки возможного отклика на действие модулированных и немодулированных радиоволн были поставлены дополнительные эксперименты. При этом в один и тот же день проводилось по 2 эксперимента по облучению клеток. В одном случае культура облучалась немодулированными радиоволнами, а в другом - частотно-модулиро-ванными (тпереест = 1 сек) одинаковой средней
Таблица 2
Оценка влияния НГ, АИМ, ЧМ-радиоволн и тепла на выживаемость клеток E. coli С 600 (Xc1857) в МПБ
ППМ, мВт/см2 ДГ, °С Выживаемость, N0/Nk
НГ АИМ ЧМ Тепло
Тпео = 0.08 с Тпер = 1 с
3.4 0.34 0.92±0.08 - 1.01±0.10 0.92±0.06 0.75
6.8 0.68 0.84±0.13 0.98±0.06 0.79±0.07 0.91±0.07 0.51
10.2 1.02 0.68±0.12 0.77±0.19 0.55±0.06 0.76±0.14 0.27
13.6 1.36 0.44±0.07 0.37±0.15 0.76±0.10 0. 62±0. 13 0.18
17.0 1.70 0.19±0.09 - 0.34±0.10 0.37±0.20 0.083
20.4 2.04 0.06±0.03 0.09±0.06 0.17±0.08 0.13±0.11 0.0005
23.8 2.38 0.06±0.04 - - - 0.0004
27.2 2.72 0.041±0.025 - - - 0.00025
Таблица3
Оценка влияния различных факторов на изменение титра инфекционных единиц в культуре E. coli С 600 (А,е1857)
ППМ, мВт/см2 ДГ, °С Изменение титра инфекционных единиц, N0/Nk
НГ АИМ ЧМ Тепло
Тпер 0.08 с тпер 1 с
3.4 0.34 1.59±0.19 - 1.36±0.30 1.31±0.27 16.8
6.8 0.68 8.9±6.8 2.31±0.80 4.47±1.56 1.89±0.70 32.6
10.2 1.02 18.76±9.6 12.0±4.5 12.9±3.9 9.0±9.6 48.1
13.6 1.36 35.9±12.8 34.0±17.3 10.8±3.6 21.3±6.7 57.2
17.0 1.70 66.5±19.4 - 20.9±5.4 40±29 66.3
20.4 2.04 82.1±17.9 60±20 27.5±13.1 65±26 76.9
23.8 2.38 81.6±15.7 - - - 98.8
27.2 2.72 90.1±17.0 - - - 120.8
Таблица 4
Сравнительная оценка действия НГ и ЧМ (тперест = 1 сек) ЭМП на культуру E. coli С 600 (Хе1857) в параллельных экспериментах
ППМ, мВт/см2 Количество живых клеток
ЧМ Контроль НГ Контроль
10.2 1.09±0.28 1.15±0.52 0.6±0.6 1.29±0.24
13.6 2.74±1.24 1.08±0.05 0.39±0.16 0. 94±0. 15
17.0 3.3±2.5 1.05±0.08 0.59±0.40 1.35±0.7
20.5 6.68±3.21 1.01±0.14 0.53±0.29 1.27±0.8
мощности. Результаты, полученные в ходе исследований, представлены в табл. 4.
Как видно из табл. 4, в контрольных кюветах регистрировалось примерно равное количество жизнеспособных клеток и не отмечалось существенных различий в титре инфекционных единиц. В случае облученных культур наблюдалась иная картина. Количество жизнеспособных клеток в суспензиях, облученных ЧМ-радиоволна-ми, было существенно большим, нежели в культурах, облученных немодулированным излучением той же мощности, причем эта разница возрастает с увеличением ППМ.
Выводы
На основании проведенных экспериментов можно сделать заключение о возможном отличии тепловых эффектов от эффектов, обусловленных действующей компонентой СВЧ-излучения, приводящей к компенсации нагрева объекта. Указанная компонента наиболее сильно выражена при наличии частотной модуляции радиоволн. При этом следует учитывать возможность влияния вида амплитудной модуляции на получаемые результаты.
Можно предположить, что отмеченное нами уменьшение выхода инфекционных единиц при действии СВЧ-излучения по сравнению с данными, полученными при тепловом воздействии, может быть сопряжено с инактивацией бактериофага Хс1857. Поэтому в серии экспериментов была также изучена выживаемость фаговых частиц, подвергнутых облучению. Показано, что в пределах погрешности экспериментов выживаемость частиц бактериофага не изменялась вследствие облучения радиоволнами.
В целом можно сформулировать следующие выводы:
- воздействие радиоволн СВЧ-диапазона на лизогенные клетки менее эффективно, чем тепловое, но возможна нетепловая компонента, способная частично компенсировать тепловые эффекты;
- объектом воздействия радиоволн СВЧ-диапазона являются процессы индукции бактериофага X, при этом инактивация фаговых частиц не наблюдается;
- наиболее значимым, с точки зрения отличия от теплового действия, фактором СВЧ-излучения, способным повлиять на модификацию микробных культур, является частотная модуляция.
Список литературы
1. Джеггард Д.Л., Лордс Д.Л. Клеточные эффекты: миллиметровые волны и рамановские спектры. Отчет о дискуссии экспертов // ТИИЭР. 1980. № 1. C. 133-139.
2. Дергачева И.П., Морозов И.И., Петин В.Г. Зависимость нагревания суспензий клеток в СВЧ-поле от их концентрации // Биофизика. 1998. № 43 (3).
С. 516-521.
3. Celandroni F., Longo I., Tosoratti N. et al. Effect of microwave radiation on Bacillus subtilis spores // Appl. Microbiol. 2004. № 97 (6). P. 1220-1227.
4. Тадевозян А., Трчунян А. Влияние когерентного крайне высокочастотного, низкоинтенсивного электромагнитного излучения на активность мембранных систем Escherichia coli // Биофизика. 2009. № 54 (6). С. 1055-1059.
5. Hyland G.J. The physics and biology of mobile telephony // The Lancet. 2000. № 356. P. 1833-1834.
6. Hyland G.J. Physical basis of adverse and therapeutic effects of low intensity microwave radiation // Indian Journal of Experimental Biology. 2008. V. 46. P. 403-419.
7. Webb S.J. Factors affecting the induction of X-prophages by millimeter microwaves // Phys. Letts. 1979. № 73 A. P. 145-146.
8. Lukashevsky K.V., Belyaev I.Y. Switching of prophage X genes in E. coli by millimeter waves // Med. Sci. Res. 1990. № 18. Р. 955-956.
EFFECT OF MICROWAVES ON LYSOGENIC E. COLI CELLS AND BACTERIOPHAGE X
S.L. Malinovskaya, V.A. Monich, E.D. Pyatova, S.I. Lyutov,
V.F. Lazukin, D.S. Malinovsky, Yu.A. Sizov
The effect of microwaves and heat on survival rate of lysogenic bacteria E. coli and the mutant bacteriophage X was investigated. Microwaves affect the survivability of E. coli cell cultures. Specific effects of electromagnetic radiation can be masked by heat action. The cells and the bacteriophages are most vulnerable to the frequency-modulated microwave radiation.
Keywords: microwaves, lysogenic cells, mutant bacteriophage.
