CC BY
56
влияние процесса децеллюляризации растворами
ДЕТЕРГЕНТОВ SDS И TRITON X-100 НА МЕхАНИЧЕСКуЮ ПРОЧНОСТь
артерий малого диаметра
Ш.Д. Ахмедов, В.А. Луговский, СЛ. Андреев, М.С. Ребенкова, Ю.В. Роговская, И.М. Скурихин, Ю.Ю. Вечерский, С.А. Афанасьев Научно-исследовательский институт кардиологии, Томск, Россия
Effect of decellularization with SDS and Triton X-100 detergent solutions on the strength capacities of small caliber arteries
Sh.D. Akhmedov, VA. Lugovsky, S.L. Andreev, M.S. Rebenkova, Y.V. Rogovskaya., I.M. Skurihin, Yu.Yu. Vecherskiy, SA. Afanasyev Research Institute for Cardiology, Tomsk, Russia
Исследование посвящено изучению влияния процесса децеллюляризации маммарной артерии человека 1% раствором додецилсульфата натрия (SDS) и 1% раствором Тритона Х-100 в течение 2 ч . на её морфологическую структуру и механическую прочность . В результате децеллюляризации из сосуда удалось полностью удалить клеточные элементы и сохранить сложную пространственную структуру сосудистой стенки . Процесс децеллюляризации не привел к значимому изменению коллагеновой основы сосудистой стенки После воздействия детергентов в течение 2 ч . во внутренней, средней и наружной оболочках наблюдалось уменьшение содержания коллагена до 80% . Механическая прочность децеллюляризованного сосуда составила не менее 46% от значений интактных сосудов . Полученные результаты являются важными при дальнейшем планировании работы, направленной на создание нового поколения сосудистых имплантатов
Ключевые слова: тканевая инженерия, децеллюляриза-ция, бесклеточный матрикс, сердечно-сосудистая хирургия
The research is dedicated to evaluation of the effect of the human mammary artery decellularization with 1 % solution of sodium dodecyl sulfate (SDS) and 1% solution of Triton X-100 during 2 hours on its morphological structure and its strength capacities . As a result of decellularization all the cellular elements were eliminated from the vessel . Nevertheless, it appeared to be possible to preserve complex spatial structure of the vascular wall The process of decellularization did not change significantly collagen basis of the vascular wall Although, under 2 hour effect of the detergents one could see lowering collagen concentration down to 80% in intima, media and adventitia . However, even in these circumstances the strength of the vessel was not less than 46% versus that of intact vessels The obtained data are important for the further study aimed at the development of a new generation of vascular implants
Keywords: tissue engineering, decellularization, decellularized matrices, cardio-vascular surgery
Введение
Бесклеточные матриксы нативных тканей вызывают все большее внимание при создании объемных носителей клеточного материала для заместительной и реконструктивной имплантации [1—7]. Интерес к использованию таких матриксов определяется тем, что они, обладая гипоиммунногенностью и низкой тромбогенностью, имеют сетчатую структуру, обеспечивая оптимальные условия для адгезии аутогенных клеток [8—11]. Одним из перспективных подходов для получения сосудистых протезов малого диаметра может стать использование децеллю-ляризованных матриксов кровеносных сосудов [12, 13]. Создание аналогичных конструкций на основе использования отдельных компонентов экстрацел-люлярного матрикса и синтетических материалов в настоящее время сопряжено с риском возникновения аневризм в связи с низкой механической прочностью [14, 15]
Однако для получения матриксов биологических тканей необходимо осуществить удаление клеточного компонента с возможно более полным сохранением химической и объемной структуры соединительнотканных волокон . Вполне вероятно, что для разных тканей процедура децеллюляризации имеет свои особенности . Ранее нами была предложена методика химической децеллюляризации тканей растворами детергентов — додецилсульфата натрия (SDS), Тритона Х-100 и растворами ДНКазы и РНКазы . [16]. Данная технология позволяет удалять клеточные составляющие из стенки любого артери-
е-таП: vladimirlugovskij@yandex . ги
ального сосуда с минимальным повреждением его соединительнотканного каркаса и сохранением его сетчатой структуры . При этом, суммарное время обработки сосуда составляет не более 4 ч , а разработанный протокол пригоден для децеллюляризации сосудов как животных, так и человека [17].
Целью настоящей работы является оценка изменения механической прочности артерий человека, подвергшихся децеллюляризации растворами детергентов SDS и Тритона Х-100 .
Материал и методы
Исследование проводилось на дистальных фрагментах внутренних грудных артерий, взятых у пациентов, страдающих ишемической болезнью сердца, во время стандартной операции маммарокоронарно-го шунтирования после подписания ими добровольного информированного согласия (п = 20). Средний возраст пациентов составил 57±3 лет . Фрагменты сосудов помещали в охлажденный физиологический раствор, дальнейшую их подготовку и исследование проводили в лаборатории Временной промежуток между забором сосуда и началом исследования не превышал 2 ч
Подготовку сосуда и удаление окружающих тканей выполняли в чашке Петри с дистиллированной водой при комнатной температуре, после чего сосуд переносили в перфузионную камеру и фиксировали на канюле . Сосуды отмывали от крови, прокачивая через них перистальтическим насосом дистиллированную
воду в течение 10—15 мин . со скоростью 20 мл/мин . Затем в течение 1 ч . сосуд обрабатывали 1% водным раствором SDS (Sigma-Aldrich, США), прокачивая раствор перистальтическим насосом со скоростью 20 мл/мин . Далее сосуд в течение 1 ч перфузиро-вали 1% водным раствором Тритона X-100 (Sigma-Aldrich, США). После этого в течение 10—15 мин сосуд отмывали от детергентов дистиллированной водой, а затем еще 10—15 мин . физиологическим раствором . [18, 19]. Качество проводимой процедуры оценивали с помощью морфологического контроля . Для этой цели каждые полчаса обработки от сосуда отрезали сегмент длиной 3—4 мм, который фиксировали в 10% нейтральном формалине с последующей проводкой через спирты и приготовлением парафиновых блоков . Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по Браше, орсеином, и по Ван Гизону . Количество клеток считали в 10 полях зрения при увеличении х1000 (микроскоп Axio imager M2, Германия) и выражали в процентах, принимая за 100% их содержание в интактном сосуде.
Для выявления коллагенов i и iii типов в стенке исследуемых сосудов проводили иммуногистохи-мическое исследование с антителами к коллагенам i и iii типов (Sigma-Aldrich, США) [18]. Количество коллагеновых волокон подсчитывали в поле зрения (ув . х1000) в интактном сосуде и в децеллюляри-зированном сосуде . Уменьшение количества колла-геновых волокон в децеллюляризированном сосуде выражали в процентах, принимая за 100% их содержание в интактном сосуде .
Оценку механической прочности исследуемых сосудов проводили на базе Томского регионального центра коллективного пользования Томского государственного университета . При выполнении измерений использовали стандартную испытательную машину instron 3343 (США) . Интактные и децеллюляризо-ванные сосуды рассекали на кольца шириной 2 мм, которые распускали на полоски длиной 8 мм, и закрепляли вертикально в зажимы измерительной машины . Фиксировали нагрузку при разрыве и надрыве образца (Н), а также удлинение образца при разрыве и при надрыве (мм), (датчик нагрузки 50 Н, зажимная длина образца составила 4—5 мм, ширина 2 мм, толщина 0,5 мм, скорость передвижения траверсы 5 мм/мин ) Изменение механической прочности де-целлюляризованных сосудов выражали в процентах, принимая за 100% прочность интактных сосудов .
Полученные данные анализировали при помощи программы SPSS Statistics 17 . 0 . Фактические данные представлены в виде Me (Q1—Q3). Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Шапиро — Вилка Сформированные выборки не подчинялись закону нормального распределения, поэтому для проверки статистических гипотез были использованы непараметрические критерии Для проверки однородности парных или зависимых выборок был использован Т-критерий Вилкоксона (Wilcoxon mached pairs test) . Различия считали достоверными при уровне значимости р<0,05 .
Результаты и обсуждение
Типичная морфологическая картина интактного и децеллюляризованного сосудов представлена на рис 1
Рис. 1. Стенка внутренней грудной артерии: А — интактное состояние; Б — после воздействия детергентов SDS и Triton X-100; 1 — коллагеновые волокна; 2 — гладкомышечные клетки; 3 — лакуны; 4 — остатки хроматина; 5 — ядра клеток; 6 — внутренняя эластическая мембрана.
Окр.: гематоксилин, эозин. Ув. х1000
Видно, что в результате децеллюляризации из сосуда удалось полностью удалить клеточные элементы . При этом сохраняется сложная пространственная структура сосудистой стенки (рис . 1 Б) .
Результаты, отражающие изменение структуры сосудов в процессе их децеллюляризации, приведены в таблице Представленные данные показывают, что под воздействием детергентов на каждом этапе отмечается достоверное уменьшение содержания клеток по сравнению с предыдущим этапом, а к моменту окончания децеллюляризации клеточные компоненты стенки полностью исчезают
Таблица. Динамика уменьшения количества клеток в процессе децеллюляризации фрагмента внутренней грудной артерии, Ме №25^75)
Воздействие на сосуд
Показатель Исходное состояние SDS 30 мин. SDS 1ч. SDS 1 ч. + Tритон X-100 30 мин. SDS 1 ч. + Tритон X-100 1ч.
Количество клеточных компонентов стенки сосуда (на 10 полей зрения) 355 (351-360) 289 (240-299)* 125 (121-133)* 54 (50-55)* 0 *
* — статистически значимое различие, по отношению к предыдущему воздействию (р<0,05).
Однако имеются данные, что при контакте с детергентами происходят значимые изменения и в соединительной ткани матрикса [19]. Для проверки этого обстоятельства, применительно к нашим объектам, было проведено иммуногистохимическое исследование сосудов на коллагены i и Ш типов .
При иммуногистохимическом исследовании фрагментов интактных сосудов было установлено, что тонкие коллагеновые волокна ( тип) определяются в медии и интиме, а толстые коллагеновые волокна (Ш тип) только в адвентиции (рис . 2 А) . В ходе обработки сосудов детергентами в течение двух часов наблюдалось уменьшение содержания коллаге-новых волокон i типа (рис . 2 Б) . По сравнению с количеством коллагеновых волокон i типа в интактном сосуде, это уменьшение составляет 20% . По нашим данным, более значимое уменьшение содержания коллагеновых волокон наблюдается в медии, чем в интиме В адвентициальной оболочке, после воздействия детергентов в течение двух часов, наблюдается снижение количества коллагеновых волокон iii типа по сравнению с интактным сосудом на 14% .
Эти результаты свидетельствуют о том, что использованный нами способ децеллюляризации не привел к фатальному изменению коллагеновой
основы сосудистой стенки . Следовательно, децел-люляризованный сосуд в значительной степени сохраняет свою механическую прочность Это нашло подтверждение при исследовании механической прочности децеллюляризованных сосудов
На рис . 3 представлены механограммы, отражающие результаты испытания механической прочности исследуемых сосудистых образцов Во всех случаях разрушение образцов протекало в два этапа — полному разрыву предшествовал надрыв образца . Интактные образцы внутренней грудной артерии начинали разрушаться при усилии 0,304 Н ± 0,1 (удлинение на 1,18 мм), а децеллюляризованные образцы — при усилии 0,140 Н ± 0,1 (удлинение на 2,66 мм). Полный разрыв интактных образцов происходил при усилии 0,500 Н ± 0,2 (удлинение на 1,75 мм), а децеллюляризованных — при усилии 0,295 Н ± 0,1 (удлинение на 3,07 мм). Критерием оценки прочности сосудов являлась величина нагрузки, при которой образцы начинали разрушаться Снижение сопротивляемости нагрузкам, по нашему мнению, может быть обусловлено отсутствием клеточного компонента и изменением пространственной структуры волокон, формирующих экстрацеллюлярный матрикс
Рис. 2 Стенка маммарной артерии:
А — интактное состояние; Б — после воздействия детергентов SDS и Triton X-100; 1 — тонкие коллагеновые волокна в intima и media; 2 — толстые коллагеновые волокна в адвентиции; 3 — внутренняя эластическая мембрана. Иммуногистохимическая реакция с антителами к коллагенам I и III типов. Ув. х1000
Рис. 3. Изменение механической прочности маммарных артерий в интактном состоянии (А) и после воздействия детергентов SDS и Triton X-100 (Б). По оси ординат — нагрузка (Н), по оси абсцисс — удлинение образца (мм); 1 — надрыв образца; 2 — полный разрыв образца. Все образцы выделены разными цветами
Таким образом, изменения в структуре маммар-ной артерии, происходящие в результате децеллю-ляризации, приводят к снижению механической прочности сосуда на 54% по сравнению с интактным сосудом . Полученные сведения могут быть использованы для создания нового поколения сосудистых протезов малого диаметра
Благодарности
Выражаем свою благодарность за помощь в проведении испытаний Томскому региональному центру коллективного пользования ТГУ, Томск, ckp.tsu.ru.
ЛИТЕРАТУРА:
I. Langer R ., Vacanti J . P . Tissue engineering: the design and abrication of living replacement devices for surgical reconstruction and transplantation . Science 1993; 260: 920-6 .
2 . Fuchs J . R . , Nasseri B .A., Vacanti J . P . Tissue engineering: a 21st century solution to surgical reconstruction . Ann . Thorac . Surg . 2001; 72: 577-91.
3 . Mclntire L .V ., Greisler H . P ., Griffith L . et al . WTEC panel report on tissue engineering research . Final report . international Technology Research institute . Baltimore: Academic Press; 2002 .
4 . Atala A. Tissue engineering, stem cells and cloning: current concepts and changing trends . Expert opinion on biological therapy 2005; 5: 879 .
5 . Amulya S . Tissue engineering: present concepts and strategies . J . indian Assoc . Ped . Surg . 2005; 10: 14-9 .
6 . Taylor D .A . From stem cells and cadaveric matrix to engineered organs . Curr . Opin . Biotech . 2009; 20: 598-605 .
7 . Murphy S .V., Atala A. Organ engineering — combining stem cells, biomaterials, and bioreactors to produce bioengineered organs for transplantation . Bioessays 2012; 35: 163-72 .
8 . L'Heureux N ., Paquet S ., Labbe R . et al . A completely biological tissue-engineered human blood vessel . FASEB J . 1998; 12: 47-56 .
9 . Hoerstrup S . P ., Zund G ., Sodian R . et al . Tissue engineering of small caliber vascular grafts . Euro . J . Card . -Thor . Surg . 2001; 20: 164-9 .
10 . Kanda K ., Matsuda T ., Oka T . in vitro reconstruction of hybrid vascular tissue . Hierarchie and oriented cell layers . ASAiO J . 1993; 39(3): M561-5 .
II. Kakisis J . D ., Liapis C . D . , Breuer C . et al . Artificial blood vessel: the Holy Grail of peripheral vascular surgery . J . Vasc . Surg . 2005; 41(2): 349-54 .
12 . Ахмедов Ш .Д . , Афанасьев С .А ., Дьякова М .Л . и др . Использование бесклеточного матрикса для формирования новых кровеносных сосудов и сердца методом тканевой инженерии . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2009; IV(2): 32-9 .
13 . Ахмедов Ш .Д ., Афанасьев С .А ., Егорова М . В . и др . Тканевая инженерия в экспериментальной сердечно-сосудистой хирургии: технология получения бесклеточных коллагеновых матриксов сосудов животных и человека . Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2011; VI(1): 68-72 .
14 . Pektok E ., Nottelet B ., Tille J . et al . Degradation and healing characteristics of small-diameter poly(e-caprolactone) vascular grafts in the rat systemic arterial circulation . Circulation 2008; 118(24): 2563-70 .
15 . Tillman B ., Yazdani S . , Lee S . et al . The in vivo stability of electrospun polycaprolactone-collagen scaffolds in vascular reconstruction . Biomaterials 2009; 30(4): 583-8 .
16 . Афанасьев С . А. , Ахмедов Ш .Ж., Егорова М . В . и др . Способ получения соединительно-тканного каркаса магистрального сосуда млекопитающих животных и человека . Патент РФ 02407459 C1. 25 07 2009
17 . Егорова М . В ., Роговская Ю . В ., Иванов А . В . и соавт. Экономичная технология получения бесклеточной матрицы артериального сосуда животных и человека Клеточные технологии в биологии и медицине 2011; 2: 111-3 .
18 . Петрова С . В ., Райклин Н . Т . Руководство по иммуногистохи-мической диагностике опухолей человека К : Титул; 2004
19 . Сергеевичев Д . С . , Подхватилтна Н . А ., Васильева М . Б . и др Морфо-функциональные особенности аортального графта после децеллюляризации Комплексные проблемы сердечно-сосудистых заболеваний 2012; 2: 3-6 .
Поступила: 17.03.2015
