CC BY
9УДК 617-001.45-085.38:612.015.13
Н. А. Мамедалиев, В. А. Дивоча
ВЛИЯНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДОНОРСКОЙ КРОВИ НА ВЫЖИВАНИЕ ЛЮДЕЙ С ОГНЕСТРЕЛЬНЫМИ РАНЕНИЯМИ
ГП Украинский НИИ медицины транспорта МЗУ, г. Одесса, Украина
Summary. Mamedaliev N. A., Divocha V. A. INFLUENCE OF PROTEOLYTIC ENZYMES OF DONOR BLOOD ON THE SURVIVAL OF PEOPLE WITH GUNSHOT WOUNDS. - SE "Ukrainian Research Institute for Medicine of Transport" Odessa, Ukraine; email:
The objective. To study the presence of trypsin-like proteinases and their inhibitors in human donor blood and their effect on the survival of people with gunshot wounds. Material and methods. The preserved erythrocyte mass of donor blood of 30 individuals, patients of intensive care units; 4 group of blood (I - IV, 2 series) persons blood plasma. In all the samples proteinase and inhibitory activity and total protein were evaluated. Results. The activity of the proteinases constituted from 5.31 to 29.45 mmol of arg/min /mg protein, it was even greater for the activity of the inhibitor from 4.0 to 186.83 cu. The range of oscillations for the proteinases was 5.0 times, and for the inhibitor more than 25.0 times. This variability indicates a rather high proteinase /inhibitor sensitivity, as well as its dependence on many factors. Conclusions. Donor human blood contained trypsin-like (serine) proteinase and its inhibitor. The presence of inhibitor low amount in a donor blood pointed at its unfitness for transfusion to the gunshot wounds patients.
Key words: gun shot wound, donor blood, proteolytic enzyme.
Реферат. Мамедалиев Н. А., Дивоча В. А. ВЛИЯНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ ДОНОРСКОЙ КРОВИ НА ВЫЖИВАНИЕ ЛЮДЕЙ С ОГНЕСТРЕЛЬНЫМИ РАНЕНИЯМИ Цель работы. Изучить наличие в донорской крови человека трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов и их влияние на выживаемость людей с огнестрельными ранениями. Материал и методы. В работе использовали консервированную эритроцитарную массу донорской крови 30 человек - пициентов реанимационного отделения 2-й городской больницы г. Одессы, плазму крови людей с 4 группой крови (I-IV, 2 серии), полученную со станции переливания крови г. Одессы. Во всех образцах проводили определение протеиназной и ингибирующей активности и общего белка. Результаты. Выявлен достаточно большой разброс показателей: для активности протеиназы от 5,31 до 29,45 ммоль арг/мин/мг белка, для активности ингибитора от 4,0 до 186,83 у.е. Диапазон колебаний для протеиназы составил 5,0 раз, а для ингибитора более чем в 25,0 раз. Такая вариабельность указывает на достаточно высокую чувствительность системы протеиназа/ингибитор, а также ее зависимость от многих факторов. Выводы. Донорская кровь человека содержит в своем составе трипсиноподобную (сериновую) протеиназу и ее ингибитор. При наличие в составе донорской крови низких показателей ингибитора она не пригодна для переливания больным с огнестрельными ранениями.
Ключевые слова: огнестрельное ранение, донорская кровь, протеолитический фермент.
Реферат. Мамедалieв Н. А., Дiвоча В. П. ВПЛИВ ПРОТЕОЛ1ТИЧНИХ ФЕРМЕНТ1В ДОНОРСЬКО1 КРОВ1 НА ВИЖИВАННЯ ЛЮДЕЙ З ВОГНЕПАЛЬНИМИ ПОРАНЕННЯМИ. Мета роботи. Вивчити наявность у донорсько! кровi людини трипсиноподiбних проте!наз та !х iнгiбiторiв та !х вплив на виживання людей з вогнепальними поранениями. Матерiал i методи. У робот використовували консервовану еритроцитарно! масу донорсько! кровi 30 оаб, яку отримали з реатмацшного вщдшення 2-о! мюько! лжарш м. Одеси, плазму кровi людей 4-х груп кровi (I-IV, 2 серп), отриману зi
© Мамедалиев Н. А., Дивоча В. А.
станцп переливання кровi м.Одеси. У вах зразках проводили визначення проте!назного i шпбуючо! активностi i загального бшка. Результати. Виявлено досить великий розкид показник1в: для активностi проте!нази вщ 5,31 до 29,45 ммоль арг/хв/мг бiлка, ще бiльший вiн був для активносп iнгiбiтору вiд 4,0 до 186,83 у.е. Ддапазон коливань для проте!нази склав 5,0 разiв, а для iнгiбiтору бiльш шж в 25,0 разiв. Така варiабельнiсть показала досить високу чутливiсть системи протешаза/шпбггор, а також И залежшсть вiд багатьох чинник1в. Висновки. Донорська кров людини мiстила в своему складi трипсиноподобну (серинову) проте!назу i И iнгiбiтор. Наявнiсть в складi донорсько! кровi низьких показник1в шпбггору вказала на не придатнiсть И для переливання хворим з вогнепальними пораненнями.
Ключовi слова: вогнепальне поранення, донорська кров, протеолггичний фермент.
Введение. Ферменты играют значительную роль в функционировании биологических систем, обеспечивая, по сути, их жизнедеятельность. В тканях макроорганизма широко представлены ферменты, обладающие протеолитической активностью. Они выполняют ведущую роль в гомеостазе, гомеокинезе и регулируют активность многих систем организма [1, 2]. Особенную роль протеолиз играет в процессе воспаления, который инициирует универсальный неспецифический каскадный механизм протеолитических ферментов как локально, так и на системном уровне [3]. Основные ингибиторы протеиназ сыворотки крови человека - это гликопротеины: ад - ингибитор протеиназ и а2 -макроглобулин, которые составляют 75-80% а-глобулиновой фракции сыворотки крови. Синтезируются эти ингибиторы преимущественно в гепатоцитах и в меньшем количестве -в моноцитах [2]. Наиболее сильным является а1 - ингибитор протеиназ, который на 90% обеспечивает антипротеиназную активность сыворотки крови. Установленные нами в эксперименте (ЧТО?) и предполагаемая роль в патогенезе гриппа А и В системы протеиназ [4, 5], заставили нас изучить кровь здорового человека на наличие в ней трипсиноподобной протеиназы и ее ингибиторов [6, 7]. По нашим данным, под действием вируса в клетке происходит нарушение динамического равновесия между трипсиноподобными протеиназами и их ингибиторами [8, 9].
При проведении поиска биологического материала для получения противовирусного препарата для лечения гриппа и других ОРВИ, мы изучили донорскую кровь человека для выявления наличия в ней компонентов протеолитической системы.
Цель работы. Определить наличие в донорской крови человека трипсиноподобных протеиназ и их ингибиторов и оценить их влияние на выживаемость людей с огнестрельными ранениями.
Материал и методы. В работе использовали консервированную эритроцитарную массу донорской крови 30 человек, полученную из реанимационного отделения 2-й городской больницы г. Одессы; плазму крови людей четырех групп (I - IV, 2 серии), полученную со станции со станции переливания крови г. Одессы.
Во всех образцах определяли протеиназную активность по методу К. Н. Веремеенко, содержание ингибитора методом А. П. Левицкого и общий белок методом Дж. Лоури.
Результаты. В реанимационное отделение больницы за 6 месяцев поступило 30 пациентов мужского пола, из которых 15 чел. имели I группу крови, 11 чел. - II, 4 чел. - IV, пациентов с III группой не поступило. Всем пациентом было проведено переливание донорской крови. В ходе исследований установлено, что донорская кровь человека содержала трипсиноподобную протеиназу и ее эндогенный ингибитор.
В целом, можно отметить достаточно большой разброс показателей: для активности протеиназы от 5,31 до 29,45 ммоль арг/мин/мг белка, еще больше он был для активности ингибитора от 4,0 до 186,83 у.е. Диапазон колебаний для протеиназы составил 5,0 раз, а для ингибитора более чем в 25,0 раз. Такая вариабельность указывает на достаточно высокую чувствительность системы протеиназа/ингибитор, а также ее зависимость от многих факторов.
В среднем, вне зависимости от групп крови, активность трипсиноподобной протеиназы и содержание ее ингибитора составляли 21,4 ± 1,96 ммоль арг/мин на мг белка и 62,7 ± 7,31 у.е., соответственно. Следует отметить, что наибольшая активность фермента установлена в донорской крови 11-ой группы крови (22,85 ± 2,06 ммоль арг/мин на мг белка). Активность фермента в донорской крови I и IV групп крови была практически
одинаковой и составляла 20,47 ± 1,89 ммоль арг/мин на мг белка и 20,67 ± 1,84 ммоль арг/мин на мг белка, соответственно. Активность ингибитора трипсиноподобной протеиназы была наиболее высокой и практически одинаковой в донорской крови I и IV групп крови и составляла 70,07 ± 6,80 у.е и 70,07 ± 6,80 у.е, соответственно. В донорской крови II группы крови активность ингибитора была наименьшей - 51,59 ± 5,06 у.е., в то время как активность трипсиноподобной протеиназы - наиболее высокой среди исследованных групп крови (рис. 1). Этот дисбаланс можно объяснить дефицитом синтеза эндогенного ингибитора трипсиноподобной протеиназы. Нельзя исключить и наличие наследственно обусловленных причин такого дисбаланса. Кроме того, необходимо подчеркнуть, что регуляторным влияниям и иным воздействиям, видимо, в большей мере подвержено содержание ингибитора, а, следовательно, влияние на эту систему возможно также через изменение его содержания.
CS
и
S
о
а
s
I 2
о
ч о U
-а
Ср о
-а
н
о g
« 'S s о
Н К
« ю
cd о
^ Ч
^ о
<ц а
Ь g к
о
а
s
CS
и я к
S
и
S
и
Е 1(15
100 80 60 40 20 0
Í
0/I
A/II B/III
Группы крови
AB/IV
□ Содержание белка
□ Активность трипсиноподобной протеиназы
□ Активность ингибитора трипсина
1 у.е. соответствует 1 мг инактивированного кристаллического трипсина
Рис. 1. Содержание белка, активность трипсиноподобной протеиназы и содержание ингибитора трипсина в донорской крови
Примечание: O/I группа крови (n = 15); A/II (n = 12);
B/III - отсутствовала; AB/IV (n = 3)
Однако, из полученных результатов не ясно в каком компоненте находится трипсиноподобная протеиназа: клеточном или плазме крови.
Как показали наши дальнейшие исследования, сыворотка донорской крови также обладала достаточно высокой активностью трипсиноподобной протеиназы (рис.2). Наиболее высокой активностью трипсиноподобной протеиназы обладала IV группа крови на фоне высокого содержания белка (рис. 2).
На следующем этапе работы нами была изучена эритроцитарная масса. В эритроцитарной массе донорской крови, в среднем, активность трипсиноподобной протеиназы была в 1,5 раза выше, чем в сыворотке крови (рис. 3).
1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Е 750, Е 508
0/I
□ Экстинкция белка
A/II B/III AB/IV
Группы крови □ Экстинкция трипсиноподобной протеиназы
Рис. 2. Активность трипсиноподобной протеиназы и экстинкция белка в сыворотке крови доноров
Примечание: O/I группа крови (n = 15); A/II (n = 12);
B/III - отсутствовала; AB/IV (n = 3)).
3 Е 750, Е 508
2,5 2 1,5 1
0,5 0
0/I
A/II
B/III
AB/IV
□ Экстинкция белка
Группы крови □ Экстинкция трипсиноподобной протеиназы
Рис. 3. Активность трипсиноподобной протеиназы и экстинкция белка в эритроцитарной массе крови доноров
Примечание: O/I группа крови (n = 15); A/II (n = 12);
B/III - отсутствовала; AB/IV (n = 3).
Активность трипсиноподобной протеиназы в эритроцитарной массе донорской крови IV группы крови была в 2,0 раза выше, чем в сыворотке крови доноров этой же группы крови. Содержание белка в эритроцитарной массе донорской крови всех групп крови был в 2,0 раза выше, чем в сыворотке крови доноров этих же групп крови.
Исходя из того, что трипсиноподобная протеиназа могла быть либо связана с клеточной мембраной, либо находится в цитоплазме, выполнен следующий этап работы. Для увеличения выхода фермента был применен метод гемолиза эритроцитов. Для этого одну часть эритроцитарной массы донорской крови подвергали 2-х кратному замораживанию и оттаиванию, а вторую часть эритроцитарной массы оставляли без изменений.
Как показали результаты исследований, представленные на рис. 4, 2-х кратное замораживание и оттаивание не влияло на выход фермента. Эти данные позволяют предположить, что трипсиноподобная протеиназа скорее всего фиксирована на мембране эритроцитов, а не находится в цитоплазме.
1,6 1,4 1,2 1
0,8 0,6 0,4 0,2 0
Е 750, Е 508
12 Количество замораживания и оттаивания
□ Экстинкция белка □ Экстинкция трипсиноподобной протеиназы
Рис. 4. Влияние замораживания и оттаивания на активность трипсиноподобной протеиназы и содержание белка в донорской крови человека (1 - до замораживания; 2 -после 3-х кратного замораживания).
Нами проанализировано распределение протеиназы в плазме крови. Высокая активность фермента была установлена также в плазме крови, в то время как содержание белка в сыворотке крови и в плазме крови было практически одинаковым (рис. 5).
К наиболее важным характеристикам трипсиноподобной протеиназы следует отнести ее устойчивость при хранении. Так, было установлено, что продолжительность хранения донорской крови не влияет на активность фермента. Высокая активность трипсиноподобной протеиназы сохранялась в течение 32-х суток после забора крови (рис. 6). Следовательно, донорскую кровь, хранящуюся более 21-х суток (крайний срок хранения донорской крови для переливания) и подвергаемую утилизации после этого срока, можно использовать для выделения трипсиноподобной протеиназы.
1,8 и
1,6 -
1,4 -
1,2 -
1 -
0,8 -
0,6 -
0,4 -
0,2 -
0 -
Е 750, Е 508
0/I A/II B/III AB/IV
Группы крови
□ Экстинкция белка □ Экстинкция трипсиноподобной протеиназы
Рис. 5. Активность трипсиноподобной протеиназы и экстинкция белка в плазме крови доноров (Примечание: O/I группа крови (n = 15); A/II (n = 12); B/III - (n = 3); AB/IV (n = 3).
1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0
Е 750, Е 508
-f-
-f-
1
3
2
Сутки
□ Экстинкция белка □ Экстинкция трипсиноподобной протеиназы
Рис.6. Влияние продолжительности хранения на активность трипсиноподобной протеиназы и содержание белка донорской крови
Примечание: 1 - 10 сут.; 2 - 21 сут; 3 - 32 сут.
Исходя из того, что участие трипсиноподобной протеиназы в физиологических и патологических реакциях зависит в значительной мере от соотношения с активностью ее ингибитора, в последующем для характеристики этой системы регуляции нами проведено определение ингибитора.
По результатам наших исследований свежая консервированная донорская кровь содержла большое количество не только трипсиноподобной протеиназы, но и ингибитора трипсиноподобных протеиназ.
В плазме крови доноров активность ингибитора трипсиноподобных протеиназ было
недостоверно выше у доноров со II группой крови (рис. 7). Следовательно, групповые особенности крови характерны и для содержания ингибитора. Последующие исследования были направлены на изучение распределения ингибиторной активности в компонентах крови.
80 -|
70 -60 -50 40 30 20 10
Е 750 у.е.
□ экстинкция белка Е 750
□ активность ингибитора трипсиноподобных протеиназ в у.е.
Рис. 7 Активность ингибитора трипсиноподобных протеиназ (в у.е.) и экстинкция белка в плазме крови доноров
Примечание: 1 - O/I группа крови (n = 15); 2 - A/II группа крови (n = 12);
3 - B/III группа крови (n = 3); 4 - AB/IV группа крови (n = 3); 1 у.е. соответствует 1 мг инактивированного кристаллического трипсина).
Так, в эритроцитарной массе активность ингибитора трипсиноподобных протеиназ было достоверно выше у доноров с IV группой крови и достоверно ниже - у доноров со II группой крови (рис. 8).
120
Е 750 у.е.
100 -80 -60 -40 -20 -0 --
-i-
0/I
A/Ц
B/III руины крови
AB/IV
□ экстинкция белка
□ активность ингибитора трипсиноподобных протеиназ (у.е.)
0
Рис. 8. Активность ингибитора трипсиноподобной протеиназы (у.е.)* и экстинкция белка в эритроцитарной массе крови доноров
Примечание: O/I группа крови (n = 13); A/II (n = 12);
B/III - отсутствовала; AB/IV (n = 5).
При хранении донорской крови в течение года при температуре -180С активность ингибитора трипсиноподобных протеиназ знизилась в 5,0 раз (от 450,0 до 70,0 у.е.)
Таким образом, средние исследуемые показатели в донорской крови I группы составили: активность трипсиноподобной протеиназы - 20,47 ±1,89 ммоль/арг/мин на 1 мг белка; содержание ингибитора - 70,07±6,80 у.е.; содержание белка - 3,90 ± 0,34 мг/мл. Наименьшее количество ингибитора составило 8,74-9,36 у.е., что наблюдали у двух доноров. Средние показатели в донорской крови для раненых со II группой крови составили: активность трипсиноподобной протеиназы - 22,85±2,06 ммоль/арг/мин на 1 мг белка; содержание ингибитора - 51,59 ± 5,06 у.е.; содержание белка - 3,51 ± 0,32 мг/мл. Наименьший показатель содержания ингибитора сосотавлял 10,19 у.е. и был отмечен у одного донора. Для IV группы крови показатели составили: активность трипсиноподобной протеиназы - 20,67 ±1,84 ммоль/арг/мин на 1 мг белка; содержание ингибитора - 70,26 ± 8,11 у.е.; содержание белка - 4,45 ± 0,41 мг/мл. Наименьший показатель ингибитора составил 4,00 у.е. у одного донора (1 у. е. соответствовала 1 мг инактивированного кристаллического трипсина).
Через 1 год из данной группы умерло 4 пациента с огнестрельными раненими. Им была перелита кровь с очень низкими показателями ингибитора трипсиноподобных протеиназ.
Выводы. 1. Донорская кровь человека содержит трипсиноподобную (сериновую) протеиназу и ее ингибитор.
2. Донорская кровь с низким уровнем ингиибитора не пригодна для переливання больным с огнестрельными ранениями.
3. Для подтверждения наших предположений необходимо проведение дальнейших исследований.
Литература:
1. Веремеенко К. Н. Протеолиз в норме и при патологии / К.Н. Веремеенко, О.П. Голобородько, А.И. Кизим. - Киев: Здоровье, 1988. - 200 с.
2. Веремеенко К.Н. Протеолитические ферменты и их ингибиторы, новые области применения в клинике / К.Н. Веремеенко // Врачеб. дело. - 1994. - №1 - С. 8-13.
3. Патент 21599 Украша, МПК (2006), А 61 К 36/00. Споаб видшення шпбггора трипсиноподiбних протеаз iз вiдходiв одержання гаммаглобулшу та альбумшу донорсько! кровi людини / Ддвоча В.П., Михальчук В. М., Гоженко А. I.; заявник та патентодержатель Дiвоча В. П., Михальчук В. М., Гоженко А. I. - № u 2006 11233 ; заявл. 25.10.2006 ; опубл. 15.03.2007, Бюл. № 3.
4. Дивоча В.А. Изменение протеазной активности в лёгких и сыворотке крови белых мышей, заражённых вирусом гриппа А и В / В.А. Дивоча, И. Г. Григорьева // Лабораторные животные для медико-биологических и биотехнологических исследований : науч. конф., Владимир, 20-22 ноября 1990 : тезисы докладов. - Москва, 1990. - С. 47.
5. Дивоча В. А. Изучение характеристики клеточных трипсиноподобных протеаз, участвующих в процессе развития гриппозной инфекции / В. А. Дивоча, С. В. Вовчук, В. Г. Адамовская // Идеи И. И. Мечникова и развитие современного естествознания : междунар. конф., 1995 г. : тезисы докл. - Харьков, 1995. - С.101.
6. Дивоча В.А. Изменение протеазной активности в лёгких мышей, заражённых вирусом гриппа А / В.А. Дивоча, И.Г. Григорьева, А.Г. Букринская // Вопросы вирусологии. - 1990. - № 5.- С. 370-377.
7. Дивоча В.А. Изменение протеазной активности в лёгких и сыворотке крови мышей, заражённых вирусом гриппа В / В.А. Дивоча, И.Г. Григорьева, А.Г. Букринская // Вопросы вирусологии. - 1992. - № 3.- С. 176. - Деп. в ВИНИТИ 28.10.91, № 4106-В.
8. Дiвоча В.О. Клиинш компоненти, асоцшоваш з вiрусом грипу / В.О. Дiвоча // Одеський медичний журнал. - 1998. - № 2 (46). - С. 8-10.
9. Дiвоча В.О. Вiрус грипу i ферменти клиини / В.О. Дiвоча // Експериментальна i клшчна медицина. - 1999. - № 2. - С. 100-105.
References:
1. Veremeenko KN, et al. Proteolysis in norm and pathology. - Mev: Zdorovie, 1988. - 200 p. (Rus.)
2. Veremeenko KN. Proteolytic enzymes and their inhibitors, new areas of use in clicics // Vrachebnoye delo. - 1994. - №1 - P. 8-13 (Rus.).
3. Patent N 21599 (UA), IPC (2006), А 61 К 36/00. Method of extraction of trypsin-like preteasis / Divocha VA, et al.; publ. 15.03.2007, Bul. № 3 (Ukr.).
4. Divocha VA., et al. Changes of protease activity in lungs and blood serum of white mice infected by flu A and B virus // Experimental animals for medical and biological researches : scientific conference., Vladimir, 20-22 November, 1990 . : abstracts. - Моscow, 1990. - P. 47 (Rus.).
5. Divocha VA., et al. Investigation of cellular trypsin-like proteasis participating in the process of grippe infection development // I. I. Mechnikov ideas and development of modern natural sciences : int. conference, 1995 : abstarcts. - Kharkov, 1995. - P. 101 (Rus.).
6. Divocha VA. Chamges of protease activity in the lungs of mice infected by grippe A virus/ VA Divocha, IG Grigoriev, et al.// Problems of Virusology.- 1990.- N5.- P. 370-377 (Rus.)
7. Divocha VA., et al. Changes of protrease activity in the lungs of mice, infected with grippe В // Problems of virusology. - 1992. - № 3.- P. 176 (Rus.).
8. Divocha VO. Cellular mechanisms associated with virus of grippe // Odessa Medical J. -1998. - № 2 (46). - P. 8-10 (Ukr.).
9. Divocha VO. Virus of grippe and enzymes of cells // Experimental and clinical medicine. - 1999. - № 2. - P. 100-105 (Ukr.).
Работа поступила в редакцию 10.05.2017 года.
Рекомендована к печати на заседании редакционной коллегии после рецензирования
