CC BY
59Journal of Siberian Federal University. Chemistry 3 (2012 5) 302-310
УДК 54.05
Влияние природы органического растворителя на экстракционное выделение бетулина из бересты коры березы
В.А. Левданскийаб, И.В. Корольковаа, А.В. Левданскийа, Н.М. Иванченко3, Б.Н. Кузнецов30*
а Институт химии и химической технологии СО РАН, Россия 660036 Красноярск, Академгородок, 50-24 б Сибирский федеральный университет, Россия 660041 Красноярск, Свободный, 79 1
Received 10.09.2012, received in revised form 17.09.2012, accepted 24.09.2012
Изучена экстракция бересты березы в аппарате Сокслета гексаном, петролейным эфиром, бензином БР-1, циклогексаном, ацетонитрилом, диэтиловым эфиром, этилацетатом, ацетоном, изопропанолом, этанолом и 1,4-диоксаном. Проведено сравнительное изучение полученных экстрактов методом ИК-спектроскопии. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определено содержание бетулина и бетулиновой кислоты в экстрактах, выделенных после их концентрирования до 1/4 первоначального объема, и в экстрактах после полного удаления растворителя. Установлено, что использование полярных растворителей позволяет получать экстракты с выходом до 28,8 %, содержащих от 90 до 95 % бетулина.
Ключевые слова: гексан, петролейный эфир, бензин БР-1, циклогексан, ацетонитрил, диэтиловый эфир, этилацетат, ацетон, изопропанол, этанол, 1,4-диоксан, экстракт, бетулин, бетулиновая кислота.
Введение
В известных работах для извлечения бетулина из бересты используют лишь ограниченное число растворителей [1, 2]. В работе [3] изучена скорость экстракции бетулина методом настаивания бересты мелкого помола (размер частиц 0,15-1,5 мм) в следующих растворителях - дих-лорметане, метаноле, изопропаноле, этаноле, 2-бутаноле и углеводородном растворителе LIAV-200 при температуре экстракции 150 °С. Показано, что извлекается от 75 до 95 % бетулина от содержащегося в бересте.
* Corresponding author E-mail address: [email protected]
1 © Siberian Federal University. All rights reserved
Основной недостаток экстракционных методов получения бетулина заключается в том, что из бересты попутно с бетулином и различными тритерпеноидами извлекаются и другие классы соединений. Причем с увеличением температуры кипения и полярности растворителя общий выход экстракта увеличивается, а доля бетулина в нем снижается [3].
Однако, несмотря на указанный недостаток, экстракционные методы выделения бетулина из бересты привлекают исследователей простотой технологического исполнения и возможностью регенерации и многократного использования растворителей. В последнее десятилетие запатентован ряд способов выделения бетулина с использованием как неполярных углеводородов гексана [4], толуола [5], уайт-спирита [6], смеси неполярных растворителей, например смесь толуола с петролейным эфиром [7], так и полярных растворителей - этанола и других спиртов [8].
В данной работе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) проведен анализ экстрактов, выделенных из бересты группой органических растворителей различной природы. Определено содержание бетулина и бетулиновой кислоты в экстрактах, полученных после их концетрирования до 1/4 первоначального объема, и в экстрактах, полученных после полного удаления растворителя. Методом ИК-спектроскопии проведено сравнительное изучение этих экстрактов.
Экспериментальная часть
В качестве исходного сырья использовали внешнюю часть коры березы - бересту Betula pendula Roth., заготовленную в октябре 2010 г. в окрестностях г. Красноярска. Бересту измельчали и отбирали фракцию размером от 1 до 2 мм, высушивали при 105 °C до влажности менее 1 %. Содержание основных компонентов в бересте (в % к а.с. бересте): экстрактивные вещества - 44,2 % (из них 34,0 % бетулин); суберин - 35,3 %; лигнин - 13,2 %; целлюлоза - 5,9 %; зола 1,2 %.
ИК-спектры выделенных из бересты экстрактов, эталонных образцов бетулина и бету-линовой кислоты сняты на Фурье ИК-спектрометре Vector - 22 фирмы Bruker в области длин волн 400-4000 см-1 в таблетках KBr (3 мг образца / 300 мг KBr). Элементный анализ эталонных образцов бетулина и бетулиновой кислоты выполнен на элементном анализаторе Flash EA™ -1112 (Thermo Quest Italia), одновременно определяющем количество (в %) углерода, водорода и серы, а также кислорода.
Экстракты, выделенные из бересты экстракцией каждым из растворителей, исследованы методом ВЭЖХ с использованием жидкостного хроматографа «Милихром A-02» со спектрофотометрическим сканирующим детектором УФ-диапазона на колонке из нержавеющей стали (2,0 х 75 мм), упакованной силикагелем с размером зерна 5,0 мкм, типа Prontosil C 18 AQ. Температура колонки (35,0 ± 0,3) °C. Подвижная фаза ацетонитрил -деионизированная вода в соотношении 86:14, скорость подачи элюента 200 мкл/мин. Концентрация анализируемых образцов бетулина в этиловом спирте составляла 0,8-1,0 мг/ мл. Дозируемый объем раствора исследуемого вещества 4 мкл. Обработка полученных результатов осуществлялась программой «МультиХром-СПЕКТР» для Windows (Ampersand Ltd). Время регистрации хроматограммы 7,5 мин. Хроматографические пики бетулина и бетулиновой кислоты идентифицированы по времени удерживания и спектральным от- 303 -
ношениям относительно канала 210 нм. Время выхода бетулиновой кислоты 2,90 мин, а бетулина - 3,61 мин.
Экстракцию измельченной бересты с влажностью менее 1 % проводили в аппарате Сок-слета объёмом 300 мл (приемная колба 1000 мл). Температура кипения основных растворителей составляла менее 100 °С. Во всех экспериментах объем используемого растворителя был 500 мл, а количество бересты (размер частиц 1-2 мм) равнялось 40,00 г. Продолжительность экстракции составляла 10 ч. После 10-часовой экстракции раствор экстрактивных веществ упаривали до 1/4 первоначального объема (до 120-125 мл), охлаждали до 15 °С и выдерживали при этой температуре в течение 24 ч. Фильтрацией отделяли выпавший осадок от маточного раствора, высушивали, определяли его выход и анализировали методом ВЭЖХ. Маточный раствор, объем которого составляет 115-120 мл, концентрировали под вакуумом до полного удаления растворителя. Определяли выход сухого остатка и содержание в нём бетулина и бе-тулиновой кислоты.
Эталонный образец бетулина был получен по методике, приведенной в работе [9]. Окисление бетулина в бетулоновую кислоту проводили хромовым ангидридом в уксусной кислоте по методике, описанной в работе [10]. Восстанавливали бетулоновую кислоту в бетулиновую боргидридом натрия в тетрагидрофуране [11].
Результаты и обсуждение
Изучено извлечение бетулина из бересты в аппарате Сокслета с использованием органических растворителей различной полярности. В группу полярных растворителей для извлечения экстрактивных веществ и бетулина вошли этанол, изопропанол, ацетон и ди-оксан. Расширена группа неполярных растворителей - использованы бензин, гексан, пе-тролейный эфир и циклогексан, а также проведена экстракция бересты растворителями, обладающими средней полярностью - диэтиловым эфиром, ацетонитрилом и этилацета-том. В табл. 1 приведены данные о выходе экстрактивных веществ, выделенных из бересты после концентрирования экстрактов до 1/4 первоначального объема и полного удаления растворителя.
Как видно из данных табл. 1, при экстракции бересты неполярными растворителями - гек-саном, петролейным эфиром и бензином БР-1 - из нее извлекается от 7 до 13 % экстрактивных веществ, причем помимо бетулина извлекаются хорошо растворимые в этих растворителях жиры, жирные кислоты, воска и стерины. При частичной отгонке растворителя - концентрирования экстрактов до 1/4 первоначального объёма - бетулин как наиболее плохо растворимый компонент экстракта в первую очередь кристаллизуется и выпадает в осадок. При этом хорошо растворимые побочные вещества остаются в растворе. Это позволяет существенно увеличить концентрацию бетулина в выделяемых экстрактах. Наиболее эффективным из неполярных растворителей, используемых для экстракции бересты, является циклогексан. Выход извлекаемых им экстрактивных веществ составляет 28,5 %.
Экстракция бересты растворителями, обладающими средней полярностью - ацетони-трилом, диэтиловым эфиром и этилацетатом, позволяет извлекать соответственно 29,5, 35,8 и 38,0 % экстрактивных веществ. Установлено, что при концентрировании этих экстрактов до 1/4 первоначального объема выделяется 23,8, 26,8 и 23,8 % экстрактивных веществ, причем доля
Таблица 1. Выход экстрактивных веществ при обработке бересты различными растворителями
№ п/п Растворитель Выделено после концентрирования р-ра до 1/4 первоначального объема (фракция 1) Дополнительно выделено после полного удаления растворителя (фракция 2) Общий выход экстрактивных веществ Т ^ кип растворителя
г % г % г % °С
1 Гексан 1,8 4,5 1,0 2,5 2,8 7,0 68,7
2 Петролейный эфир 4,2 10,5 1,0 2,5 5,2 13,0 40-70
3 Бензин БР-1 2,8 7,0 1,3 3,2 4,1 10,2 87-98
4 Циклогексан 10,5 26,2 0,9 2,3 11,4 28,5 81,0
5 Ацетонитрил 9,5 23,8 2,3 5,7 11,8 29,5 81,6
6 Диэтиловый эфир 10,7 26,8 3,6 9,0 14,3 35,8 34,5
7 Этилацетат 9,5 23,8 5,7 14,2 15,2 38,0 77,2
8 Ацетон 9,8 24,5 5,5 13,8 15,3 38,3 56,2
9 Изопропанол 11,2 28,0 4,1 10,2 15,3 38,2 82,2
10 Этанол 11,5 28,8 4,9 12,2 16,4 41,0 78,3
11* Диоксан 9,6 24 9,6 24,0 101,3
* После отгона диоксана полностью при 50 °С под вакуумом маслообразный остаток разбавили холодной водой и отфильтровали.
веществ, остающихся в растворе после концентрирования, увеличивается с 5,7 % для ацетони-трила до 9,0 и 14,2 % соответственно для эфирного и этилацетатного экстрактов.
Экстракция бересты полярными растворителями - ацетоном, изопропанолом и этанолом -позволяет извлекать от 38,3 до 41,0 % экстрактивных веществ. После концентрирования этих экстрактов выделяется из ацетонового 24,5 %, изопропанольного 28,0 % и этанольного 28,8 % экстрактивных веществ. Как видно из данных, приведенных в табл. 1, с увеличением полярности растворителя наряду с увеличением выхода экстрактивных веществ увеличивается и доля веществ, остающихся в растворе после концентрирования полученных экстрактов, с 2,5-3,2 для неполярных растворителей и до 13,0-14,0 - для полярных.
Как показано выше, при одинаковой продолжительности экстракции (10 ч) увеличение общего выхода экстрактивных веществ из бересты происходит при её экстракции полярными растворителями. Так, при переходе от ацетонитрила к этилацетату, ацетону и более полярным растворителям - спиртам - общий выход экстрактивных веществ увеличивается до 41 %. Однако экстракция полярным растворителем приводит к извлечению из бересты большой группы фенольных и полифенольных веществ. В результате при переходе от неполярных к более полярным растворителям внешний вид экстракта из светло-желтого становится коричневым.
Методом ВЭЖХ определено содержание бетулина и бетулиновой кислоты в осадках, выделенных после концентрирования полученных экстрактов до 1/4 первоначального объема, и в осадках, полученных после полного удаления растворителей (табл. 2).
Установлено, что концентрирование изопропанольного и этанольного экстрактов до 1/4 первоначального объема приводит к выделению осадков, содержащих 88,4 и 89,6 % бетулина,
Таблица 2. Результаты анализа методом ВЭЖХ экстрактов выделенных из бересты
№ образца Растворитель Фракция* Выход. %** Содержание бетулина, %*** Содержание бетулиновой кислоты, % Общий выход экстракта, %** Содержание бетулина в объединенном осадке, %***
1 Гексан 1 2 4,5 2,5 73,2 17,0 3,4 7,0 53,2
2 Петролейный эфир 1 2 10,5 2,5 90,4 9,0 4,5 13,0 74,8
3 Бензин БР-1 1 2 7,0 3,2 84,5 16,4 3,3 1,0 10,2 62,0
4 Циколгексан 1 2 26,2 2,3 75,4 8,5 3,3 1,0 28,5 70,2
5 Ацетонитрил 1 2 23,8 5,7 74,4 8,3 29,5 62,5
6 Диэтиловый эфир 1 2 26,8 9,0 84,3 39,1 7,3 6,8 35,8 72,9
7 Этилацетат 1 2 23,8 14,2 95,5 39,0 8,1 3,9 38,0 74,3
8 Ацетон 1 2 24,5 13,8 90,6 36,1 9,0 4,9 38,3 71,0
9 Изопропанол 1 2 28,0 10,2 88,4 16,6 4,9 6,6 38,2 69,2
10 Этанол 1 2 28,8 12,2 89,6 33,4 7,1 4,1 41,0 72,5
11 Диоксан 24,0 64,0 6,7 24,0 64,0
* Фракция 1 выделена после концентрирования раствора до 1/4 первоначального объема; фракция 2 дополнительно выделена после полного удаления растворителя; ** от массы а.с. бересты; *** от массы сухого экстракта.
а ацетонового и этилацетатного экстрактов - 90,6 и 95,5 % бетулина. Методом ВЭЖХ показано, что из бересты наряду с бетулином извлекается и бетулиновая кислота, её выход для неполярных растворителей составляет 3-4 %, а для полярных - 8-9 %. Наличие бетулина и бетулино-вой кислоты в экстрактах подтверждено сравнением их физико-химических характеристик с характеристиками эталонных образцов бетулина и бетулиновой кислоты, полученных известным способом.
Методом ИК-спектроскопии проведено сравнительное изучение веществ, выделенных из экстрактов после их концентрирования до 1/4 первоначального объёма (1-я фракция), с соответствующими осадками, полученными после полного удаления остатка растворителя (2-я фракция) (рис. 1-10).
Как видно из рис. 1-10, ИК-спектры первых фракций, выделенных из бересты неполярными растворителями - гексаном, петролейным эфиром, бензином и циклогексаном (рис. 1-4) и полярными - этилацетатом, ацетоном, этанолом и изопропанолом (рис. 6-10) - очень близки и имеют все характерные для бетулина полосы поглощения, приведенные в работе [4]. ИК-спектры вторых фракций, полученных после полного испарения неполярных растворителей,
иа-
а £ ?
1 С 01- [1_лМи, 8 1 «1_дМи,
0.0- и жАДЬ— г 0.0 дДлЛЛ- 2
4000 2И0 1(100 £5» ЙОМ 1М0 ЬМ
^яуглигтЯк!. сгп 1
-юоо 34« мм змо зооо ™ мо
№*ч«пи|г*и;г. йл'1
Рис. 1. ИК-спектр гексанового экстракта бересты: Рис. 2. ИК-спектр экстракта бересты петролейным
1 - фракция 1, 2 - фракция 2
эфиром
А] 1.
-мча 5М0 за» »00 МоО 1Яю 1000 И0
'■"■'. IV н^ || и | ^ Ь й1 СП1
04'
V. г
*«о 3500 юоо ноо нюо юоо ыи
ИВУВШГПЬе СП)
Рис. 3. ИК-спектр бензинового (БР) экстракта Рис. 4. ИК-шектр циклогексанового экстракта бересты: 1 - фракция 1,2 - фракция 2 бересты
9
3 О»1
о,о-
а]
ЭКЮ »00 5000 ИМ 1000 !00 ЛяуепитЬег. ст
Рис. 5. ИК-сиектр ацетонитрильного экстракта бересты
ясоо 1:00 моо ноо мог- ни 1000 :оо 1НвчепитЬ«(. его'
Рис. 6. ИК-спектр экстракта бересты диэтиловым эфиром7
-I-<-т-г-1™"—Г--1-1 1
зню зим гын гом 1»о 1мо ьоо
¥У«#пит1»г. ап
Рис. 7. ИК-спектр этилацетатного экстракта Рис. 8. ИК-спектр ацетонового экстракта бересты: бересты: 1 - фракция 1, 2 - фракция 2 1 - фракция 1, 2 - фракция2
*М0 1500 М00 250& гОМ 1ЙО 1«0 я» Иа»егш п*»г, «и-1
1. 6-
У2-
0.3
0.1-
дН^
*оо; »00 3400 2И0 гою 15» 1ВД0 600 п шпЬег. ст'1
Рис. 9. ИК-спектр изопропанольного экстрткта Рис. 10. ИК-спектр нтанольногоэкснракта (бересты:
бересты: 1 - фракция 1, 2 - фракция 2
1 - фракция 1, 2 - фракция2
Рис. 11. ИК-спектр диоксанового экстракта бересты: 1 - фракция 1, 2 - фракция 2
существенно отличаются от ИК-спектров вторых фракций, выделенных полярными растворителями - этилацетатом, ацетоном, этанолом и изопропанолом. В ИК-спектрах вторых фракций (рис. 6-10) в области 1720-1730 и 1200-1250 см-1 присутствуют широкие полосы поглощения характерные для фенольных дубильных веществ. Наличие фенольных веществ подтверждено известной реакцией - при нагревании их спиртовых растворов в присутствии соляной кислоты реакционная масса приобретает вишнёвую окраску, что свидетельствует об образовании антоцианидинов [12].
Изучение экстракции бересты растворителями различной полярности показало, что использование полярных растворителей позволяет получать экстракты с выходом 24-29 %, содержащих 90-95 % бетулина.
Установлено, что при экстракции бересты перечисленной выше группой растворителей наряду с бетулином извлекается и бетулиновая кислота, причем максимальное её содержание до 9 % наблюдается в экстрактах, полученных полярными растворителями.
Список литературы
1. Pasich J. Emulgatory z grupy trojterpenoidow. Cz. 1. Ekstrakcja betuliny z kory rozowy Betula alba L. za pomoca trojchloretylenu // Farmac. polska. 1964. Bd. 20, № 23-24. S. 911-914.
2. Jaaskelainen P. Betulinol and its utilization // Paperi ja Puu Pap. och Tra. 1981. № 10. P. 599603.
3. Eckerman Ch., Ekman R. Comparison of solvents for extraction and crystallization of betulinol from birch bark waste // Paperi ja Puu Pap. och Tra. 1985. № 3. P. 100-106.
4. Патент 2206572 РФ. Способ выделения бетулинола / М.С. Борц, Е.Г. Николаева, И.С. Ла-евский // Опубл. 20.06.2003.
5. Патент 2192879 РФ. Способ получения бетулина / Ю.И. Стернин // Опубл. 20.11.2002.
6. Патент 2138508 РФ. Способ выделения бетулинола / А.Н. Кислицын, И.И. Сластников, А.Н. Трофимов // Опубл. 27.09.1999.
7. Патент 2184120 РФ. Способ получения бетулина / В.И. Рощин, Н.Ю. Шабанова, Д.Н. Ведерников // Опубл. 27.06.2002.
8. Патент 2172178 РФ. Способ получения бетулина / Г.В. Сироткин, Ю.И. Стернин // Опубл. 20.08.2001.
9. Абышев А.З., Журкович И.К., Агаев Э.М., Абдулла-заде А.А., Гусейнов А.Б. Методы стандартизации качества субстанций бетулинола и его лекарственных форм // Химико-фармацевтический журнал. 2006. Т. 40, № 1. С. 49-53.
10. Ле Банг Шон, Каплун А.П., Шпилевский А.А., Андия-Правдивый Ю.Э., Алексеева С.Г., Григорьев В.Б., Швец В.И. Синтез бетулиновой кислоты из бетулина и исследование её солюбилизации с помощью липосом // Биоорганическая химия. 1998. Т 24, № 10. С. 787-793.
11. Darrick S.H.L. Kim, Zhidong Chem, Van Tuyen Nguen, John M. Pezzuto, Shengxiang Qiu, Zhi-Zhen Lu. A concise semi-synthetic approach to betulinic acid from betulin // Synthetic communication. 1997. Vol. 27, N 9. P. 1607-1612.
12. Era V., Jaaskelainen P., Ukkonen K. Fatty acid esters from Betulinol // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1981. V. 58. P. 20-23.
13. Левданский В.А., Кузнецов Б.Н. Получение антоцианидиновых красителей из луба коры берёзы Betula Pendula Roth. // Химия растительного сырья. 2004. № 3. С. 25-28.
Influence of the Nature of Organic Solvent on Betulin Isolation from an External Layer of a Birch Bark
Vladimir A. Levdanskyab, Irina V. Korolkovaa, Alexandr V. Levdanskya, Natalia M. Ivanchenkoa and Boris N. Kuznetsova,b*
a Institute of Chemistry and Chemical Technology SB RAS 50-24 Akademgorodok, Krasnoyarsk, 660036 Russia
b Siberian Federal University, 79 Svobodny, Krasnoyarsk, 660041 Russia
Extraction ofbetulin by hexane, petroleum-ether, benzene BR-1, cyclohexane, acetonitrile, diethyl ether, ethyl acetate, acetone, isopropanol, ethanol, and 1,4-dioxane in a Soxhlet's (extraction) apparatus has been studied. Comparative studying of the obtained extracts has been executed with use of a method of IR-spectroscopy. The content of betulin and betulin acid in extracts, which have been isolated after their concentration to 1/4 initial volumes and in extracts which have been isolated after full removal of solvent, has been defined with using a method of a highly effective liquid chromatography (HPLC). It was established, that use of polar solvents allows to receive extracts with an yield to 28,8 % and the content of betulin from 90 to 95 %.
Keywords: hexane, petroleum-ether, benzene BR-1, cyclohexane, acetonitrile, diethyl ether, ethyl acetate, acetone, isopropanol, ethanol, 1,4-dioxane, extract, betulin, betulinic acid.
