CC BY
108
Н.Ю. ЧЕСНОКОВА
Влияние полисахаридов на ферментативную активность растительной фосфолипазы Б
Рассматривается воздействие анионного и трех катионных полисахаридов на гидролитическую активность фосфолипазы В.
Фосфолипаза Б (фосфатидилхолин фосфатидогидролаза ЕС 3.1.4.4) катализирует гидролиз фосфоэфирной связи между остатком фосфатид-ной кислоты и спирта в молекулах фосфолипидов [10]. В наибольшей степени изучена реакция гидролиза фосфатидилхолина (ФХ), продуктами которой являются фосфатидная кислота и холин. Фосфолипаза Б кроме гидролитической обладает также трансфосфатидилирующей активностью [10]. В этом случае остаток холина обменивается на какой-либо иной спирт, что находит применение для ферментативного синтеза биологически активных веществ [5].
Фосфолипаза Б относится к числу межфазных ферментов, функционирующих на поверхности раздела фаз [6, 7]. Это обусловлено тем, что ее субстратом являются вещества, которые в большинстве случаев не растворимы в водном растворе, а организованы в виде бимолекулярного слоя биологических мембран и клеточных органелл. Фосфолипаза Б остается активной в водном растворе после выделения, но активность оказывается сниженной. Ее активация наблюдается после добавления поверхностноактивных веществ (ПАВ) [6, 7]. Их воздействие объясняется взаимодействиями с ферментом, приводящими к изменению его третичной структуры [2]. При некоторых соотношениях концентраций ПАВ и фермента в растворе достигается такая конформация макромолекулы, которая является оптимальной для проявления фосфолипазой Б ферментативной активности.
Полисахариды являются одним из основных компонентов живой клетки, играющим важную роль в ее структурной организации и функционировании. Они обычно находятся в виде ассоциатов, комплексов или коньюгатов с белками. Их агрегация происходит также при смешении в водных растворах, что находит широкое применение в извлечении белков, приготовлении пищи и получении различных материалов [9, 11]. Взаимодействия полисахаридов с глобулярными белками сопровождаются изменением третичной структуры последних, которые аналогичны перестройкам под воздействием ПАВ. Можно предполагать, что они так же, как и ПАВ, могут оказывать заметный эффект на функциональную активность ферментов. Публикации по воздействию полисахаридов на
функционирование фосфолипазы D нам не встретились. Имеются только отдельные работы, в которых отмечен осаждающий эффект анионного полисахарида альгината натрия на фосфолипазу D [8].
Цель настоящей работы - изучение воздействия на активность фосфолипазы D анионного и трех катионных полисахаридов. Последние отличались наличием углеводородных цепей, присоединенных двумя различными способами. Такие гидрофобно модифицированные полимеры иногда называют «полимерными ПАВ», поскольку они обладают поверхностной активностью и способны формировать агрегаты в объеме растворов, сходные с мицеллами ПАВ. Необходимо было рассмотреть, имеется ли сходство в их воздействии на фосфолипазу D с ранее изученными анионными ПАВ (такими как додецилсульфат натрия (ДДС), олеат и холат натрия) и катионным ПАВ (цитилтриметиламмо-ния бромидом (ЦТАБ). Кроме того, повышение активности фермента в присутствии катионных полисахаридов, включая гидрофобно модифицированные, позволяет предложить их в качестве альтернативы ПАВ, поскольку при использовании полимеров упрощается очистка продуктов реакции.
В данной работе использовали соевый ФХ марки Epikuron - 200 («Lucas Mayer», Германия) и бычий сывороточный альбумин (БСА) («Sigma», США). Ацетат натрия и хлористый кальций имели квалификацию х. ч. В качестве анионного полисахарида был взят А,-каррагинан («Hercules», Дания) с молекулярной массой (ММ) 1024 кДа. Производные гидрооксиэтилцеллюлозы (ГОЭЦ), содержащие катионные и гидрофобные заместители, получены от фирмы «Hoechst AG» (Германия). В качестве катионного заместителя производные ГОЭЦ содержали глицидил-триметиламмоний хлорид (-CH2-CHOH-CH2-N(CH3)3Cl). В макромолекуле гидрофобно модифицированного производного гидроксиэтилцеллю-лозы (кат-ГФГОЭЦ) одна из метильных групп при атоме азота была замещена на додецил С12Н25. Гидрофобно модифицированное производное гидроксиэтилцеллюлозы (ГФ-кат-ГОЭЦ) отличалось тем, что углеводородный радикал С12Н25 был присоединен к основной цепи независимо от катионной группы. В макромолекуле кат-ГОЭЦ гидрофобный заместитель отсутствовал. Структурные формулы полисахаридов, используемых в работе, представлены на рис. 1. Их обозначения и степень замещения (а) катионным и гидрофобным заместителями в расчете на мономерное звено целлюлозы приведены в таблице.
Фосфолипаза D выделена из кочерыжки белокачанной капусты по методике, описанной в работе Шумилиной с соавторами [3]. Метод выделения включал гомогенизацию исходного материала, центрифугирование 15 мин при 10000 об/мин, отделение и выдерживание супернатанта при 550С в течении 3 мин, завершающееся осаждением белка этанолом. Содержание белка в препаратах, определенное по методу Бредфорда [1], составляло 0,2-0,3 мг/мл. В качестве стандарта при определении использовали раствор БСА.
Многослойные везикулы готовили в круглодонной колбе диспергированием в ацетатном буферном растворе тонкой пленки ФХ, находя-
щейся на ее стенках, которая предварительно была нанесена высушиванием раствора фосфолипида в хлороформе под вакуумом.
Степень замещения катионными и углеводородными группами в расчете на мономерный остаток в молекуле катионных производных ГОЭЦ
Производные ГОЭЦ Заместители Степень замещения (а)
Катионная группа Углеводородная цепь
Кат-ГОЭЦ R1 ,R2=CH2-CHOH-CH2-
N+(CH3)3Cl- 0,2 0
Кат-ГФГОЭЦ R1 ,R2=CH2-CHOH-CH2-
N+(CH3)2C12H25 Cl- 0,011 0,011
ГФ-кат-ГОЭЦ R1=CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 Cl-
R2=C12H25 0,36 0.014
Гидролитическую активность фосфолипазы D определяли по методике, описанной в работе Шумилиной с соавторами [3]. При подготовке реакционной смеси ПАВ заменяли на полисахарид. Концентрация полисахарида в растворе составляла 0,2; 0,5; 1%. Холин, образовавшийся в ходе ферментативной реакции, экстрагировали, а затем определяли в водно-метанольной фракции рейнекатным методом [4]. Полученные результаты представлены как средние величины из совокупности значений с указанием среднеквадратичного отклонения.
а
б
Рис. 1. Структурные формулы полисахаридов: а - кат-ГОЭЦ; б -Х-каррагинан
Образцы фосфолипазы Б для УФ-спектральных съемок, определения мутности и реологических измерений готовили смешением 1,3 мл (30 мкг/мл) раствора фосфолипазы Б, 0,8 мл 0,1 моль/л ацетатного буфера и раствора полисахарида. Концентрация последнего составляла 0,25%. Съемка дифференциальных УФ-спектров образцов проводилась на спектрофотометре иУ-1201 «SЫmadzu» (Япония) при длине волны 280 нм.
Мутность (рассеяние света) растворов измеряли под углом 900 при длине волны 520 нм на спектрофотометре Specol-11 (Германия), оборудованном нефелометрической приставкой. В качестве стандарта при определении УФ-спектров и мутности растворов использовали раствор фосфолипазы Б (30 мкг/мл) в ацетатном буфере, не содержащий полисахарид.
Реологические измерения проводили в режиме малоамплитудных колебаний с помощью реометра Я01юу18С0 ЯТ-20 фирмы «Нааке» (Германия), обладающего контролируемым напряжением сдвига. В качестве стандарта использовали 0,25% растворы полисахаридов. Полученные результаты представлены как средние величины из совокупности значений. Стандартная ошибка не превышала 1%.
Выход холина при ферментативном гидролизе ФХ в зависимости от концентрации полисахаридов показан на рис. 2. Их добавление в реакционную смесь, как можно видеть, оказывает заметное воздействие на активность фосфолипазы Б, что зависит от типа заряда функциональных групп, наличия и места присоединения углеводородного радикала.
л
и
о
X
ч
о
X
3
т
С, мас. %
Рис. 2. Зависимость выхода холина от концентрации полисахаридов (С): 1 - кат-ГОЭЦ, 2 - кат-ГФГОЭЦ, 3 - ГФ-кат-ГОЭЦ, 4 - Х-каррагинан
Увеличение выхода холина наблюдается при введении катионного полисахарида (кривая 1), в то время как анионный полисахарид (кривая 4) оказывает дезактивирующее действие. В обоих случаях имеется двукратный эффект, но противоположного знака. Полисахариды воздействовали
различным образом также на растворимость фосфолипазы D. Добавление анионного полисахарида À-каррагинана приводило к выпадению осадка в реакционной среде. Это согласуется с результатами работы [8], в которой анионный полисахарид альгинат использован для выделения фермента. Следует отметить, что анионные ПАВ также вызывали уменьшение растворимости и осаждение фосфолипазы D. Однако при этом они ее активировали [2]. По всей видимости, анионные полисахарид и ПАВ приводят к схожей трансформации третичной структуры фермента, выражающейся в изменении его растворимости. Это можно связать с взаимодействиями данных соединений с одними и теми же центрами белковой макромолекулы. То, что в одном случае фермент дезактивируется, а в другом - активируется, возможно, обусловлено экранирующим действием полисахарида, макромолекула которого по размерам в значительной степени превосходит молекулу ПАВ, а следовательно, может закрыть активный центр.
Экранирование, по всей видимости, имеет место и в случае кат-ГОЭЦ. На такую возможность указывает наличие максимума на кривой 1 (рис. 2). Максимальный активирующий эффект наблюдается при концентрации полисахарида 0,15-0,2 мас.%, а с ростом его содержания происходит достаточно резкое понижение выхода холина. Можно предполагать, что связывание катионного полисахарида происходит в первую очередь с участками макромолекулы фосфолипазы D, достаточно удаленными от активного центра, но при высоких концентрациях закрываются и остальные ее части.
Воздействие гидрофобно модифицированных кат-ГОЭЦ на активность фосфолипазы D представлено кривыми 2 и 3 (рис. 2). В области небольших концентраций (до 0,15 мас.%) их добавление в реакционную смесь приводит лишь к незначительному понижению выхода холина. Характер воздействия кат-ГФГОЭЦ (кривая 2) с ростом содержания полисахарида сохраняется, тогда как ГФ-кат-ГОЭЦ (кривая 3) начинает активировать фосфолипазу D. При этом кривая 3 выходит на кривую 1, что говорит о сходстве его воздействия с кат-ГОЭЦ.
Проведенное сопоставление показывает, что эффект гидрофобно модифицированных кат-ГОЭЦ определяется местом присоединения углеводородного радикала. В одном случае он присоединен непосредственно к катионной группе, а в другом - независимо от нее (см. таблицу). Наличие углеводородных радикалов в полисахариде обусловливает изменение характера взаимодействий с ферментом, вызванное проявлением гидрофобного эффекта в водных растворах. Гидрофобно модифицированные кат-ГОЭЦ будут взаимодействовать с гидрофобными центрами или участками в макромолекуле фосфолипазы D. По всей видимости, это и происходит в реакционной системе. Следует отметить отсутствие заметного воздействия на активность фермента при небольших концентрациях полисахаридов, что может объясняться удаленностью гидрофобных центров или участков от активного центра в макромолекуле фосфолипа-зы D. Напротив, увеличение концентрации гидрофобно модифицированных кат-ГОЭЦ, видимо, вызывает конформационные перестройки белковой молекулы, ведущие к развертыванию белковой глобулы, что делает
доступными гидрофобные центры для связывания. Данные конформаци-онные перестройки способствуют подходу субстрата к ферменту, что выражается в увеличении его активности при высоких концентрациях (рис.
2, кривая 3). Возможно, подобное предположение справедливо и в отношении кат-ГФГОЭЦ, который обладает схожим активирующим действием в области более высоких концентраций (>0,3 мас.%).
Изменение третичной структуры фосфолипазы Б при введении гидрофобно модифицированных кат-ГОЭЦ выражается в изменении ее растворимости, представленной на рис. 3. На диаграмме даны разность рассеивания света растворами белка и смеси белок-полисахарид. Видно, что введение полисахаридов приводит к возрастанию мутности растворов фосфолипазы Б. Наибольший эффект наблюдается в смеси с ГФ-кат-ГОЭЦ, а наименьший - в смеси с кат-ГОЭЦ. Мутность этих растворов различается почти в два раза. Промежуточное положение занимает кат-ГФГОЭЦ. По всей видимости, различия в мутности могут свидетельствовать о взаимодействии полисахаридов с различными центрами на поверхности белковой молекулы. Гидрофобно модифицированные полисахариды связываются с белковой макромолекулой в большей степени, что следует из более высоких показаний рассеяния света растворами (рис. 3).
А
520
0,25 мас. %
о
Рис. 3. Мутность растворов фосфолипазы Б и смесей, содержащих белок и катионный полисахарид: 1 - кат-ГОЭЦ, 2 - кат-ГФГОЭЦ, 3 - ГФ-кат-ГОЭЦ
Дополнительная информация о взаимодействии полисахаридов с фосфолипазой Б получена при изучении их растворов с помощью УФ-спектроскопии. Результаты представлены на рис. 4. Диаграмма отражает разность в поглощении растворов белка и смесей белок-полисахарид. Видно, что добавление полисахаридов (0,25 мас.%) приводит к уменьшению поглощения при длине волны 280 нм, что свидетельствует о кон-формационных перестройках белковой молекулы. Наибольший эффект оказывают добавки ГФ-кат-ГОЭЦ, а кат-ГФГОЭЦ и кат-ГОЭЦ воздействуют на ферменты в меньшей степени.
Рис. 4. Уровень поглощения света растворов фосфолипазы Б и смесей, содержащих белок и катионный полисахарид: 1 - кат-ГОЭЦ, 2 - кат-ГФГОЭЦ, 3 -ГФ-кат-ГОЭЦ
На рис. 5 показано изменение вязкости растворов катионных полисахаридов, вызванное добавлением фосфолипазы Б. На диаграмме даны нормализованные значения вязкости растворов полисахаридов без фосфолипазы Б и в смеси с ней. Видно, что добавление белка приводит к различным эффектам, зависящим от полисахарида. В случае кат-ГФГОЭЦ и кат-ГОЭЦ происходит небольшой рост вязкости (приблизительно на 30%). Вязкостные свойства растворов ГФ-кат-ГОЭЦ практически не меняются. Отсюда следует, что на изменение вязкости растворов при смешении полисахарида и белка большое влияние оказывает наличие и место присоединения углеводородного радикала.
2 3
1
0,2 5 мас. %
Рис. 5. Отношение вязкости (п0) растворов ГФ-кат-ГОЭЦ (1), кат-ГФГОЭЦ (2), кат-ГОЭЦ (3) и вязкости (поо) смеси полисахаридов с фосфолипазой Б
Таким образом, анионные полисахариды инактивируют фосфоли-пазу Б, тогда как катионные полисахариды вызывают увеличение гидролитической активности фосфолипазы Б. Действие катионных гидрофобно модифицированных полисахаридов на фермент определяется местом присоединения углеводородного радикала.
Проведенное сопоставление ПАВ и гидрофобно модифицированных производных кат-ГОЭЦ по их воздействию на функциональную активность фосфолипазы Б показало, что между ними имеются как сходст-
П о/П 00
1,4 1,2 1,0 0, 8 0,6 0,4 0, 22 0,0
ва, так и различия в воздействии на фермент. Сходство с катионными ПАВ заключалось в том, что кат-ГФГОЭЦ оказывал сходный ингибирующий эффект на ферментативную активность. В его макромолекуле углеводородные цепи непосредственно присоединены к заряженной группе, как и в молекуле ПАВ. Когда они были присоединены к основной цепи полисахарида, независимо от заряженных групп, как это имеет место в случае ГФ-кат-ГОЭЦ, тогда наблюдалось активирующее воздействие на фосфолипазу D. Этим катионные производные ГОЭЦ отличаются от ПАВ, в случае применения которых выход холина возрастал только при добавлении анионных веществ. На этом основании высказано предположение о том, что ПАВ и полисахариды могут различным образом взаимодействовать с фосфолипазой D.
Литература
1. Дарбе А. Практическая химия белка / А. Дарбе. - М.: Мир, 1989. -623 с.
2. Шумилина Е.В. Влияние соосаждения и взаимодействий с анионными поверхностно-активными веществами на активность растительной фосфолипазы D / Е.В. Шумилина, Н.Ю. Зонова, О.Г. Муха-нева, Ю.А. Щипунов // Биохимия. 1999. Т. 64, вып. 8. С. 1052-1059.
3. Шумилина Е.В. Влияние поверхностно-активных веществ на активность фосфолипазы D / Е.В. Шумилина, Н.Ю. Зонова, Ю.А. Щипунов // Биологические мембраны. Т. 15, № 4. С. 414-420.
4. Beattie F.A. Colorimetric method for the determination of choline and acetylcholine in small amount / F.A. Beattie // Biochem J. 1935. Vol. 209. P. 2065.
5. Dawson R.M. The formation of phosphatidylglycerol and other phospholipids by the transfarase activity of phospholipase D / R.M. Dawson // Biochem. J. 1967. Vol. 102. P. 205-210.
6. Panaiotov I. Interfacial and temporal organization of enzymatic lipolysis / I. Panaiotov, M. Ivanova, R. Verger // Current Opinion Colloid Interface Sci. 1997. Vol. 2. P. 517-525.
7. Rubingh D.N. The influence of surfactants on enzyme activity / D.N. Rubingh // Current Opinion Colloid Interface Sci. 1996. Vol. 1. P. 598603.
8. Sharma S. One step purification of pianut phospholipase D by precipitation with alginate / S. Sharma , A. Sharma , M. Gupta // Bioseparation. 2000. Vol. 9. P. 93-98.
9. Tolstoguzov V.B. Protein-polysacharide interacyions / V.B. Tolstoguzov, S. Domodaran, A. Paraf, M. Dekker eds // Food proteins and there applications. New York, 1997. P. 171-197.
10. Waite M. The phospholipases / M. Waite // Handbook of Lipid Research. Plenum Press. New York, 1987. Vol. 5. 562 p.
11. Xia J. Protein - polyelectrolyte complexes / J. Xia, P. Dubin, J. Bock, R. Davis, D.N. Schalz, S. Thies [eds.] // Macromolecular complexes in chemistry and biology // Springer-Verlag. Berlin. 1994. P. 247-271.
© Чеснокова Н.Ю., 2005 г.
