CC BY
144
Татьяна Федоровна Маливанова1, Валентина Александровна Юрченко2, Елена Викторовна Скоромыслова3, Наталья Николаевна Мазуренко4
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА -308(G/A)TNF НА ОБЩУЮ ВЫЖИВАЕМОСТЬ БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
1 К. м. н., старший научный сотрудник, лаборатория онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
2 К. м. н., старший научный сотрудник, отдел эпидемиологии опухолей НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
3 Лаборант-исследователь, лаборатория онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
4 Д. б. н., профессор, заведующая, лаборатория онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24)
Адрес для переписки: 115478, РФ, г. Москва, Каширское шоссе, д. 24, лаборатория онкогеномики НИИ канцерогенеза ФГБУ «РОНц им. Н. Н. Блохина» РАМН, Маливанова Татьяна Федоровна;
e-mail: [email protected]
Фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor, TNF) — воспалительный цитокин, вовлеченный в развитие и прогрессирование злокачественных новообразований. В промоторной области гена TNF находится сайт -308(G/A)TNF, замена в котором влияет на уровень транскрипции гена. Задачей исследования являлось изучение прогностической значимости полиморфизма -308(G/A)TNF при раке молочной железы. Методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции исследованы 260 первичных больных раком молочной железы без отдаленных метастазов. Аллель -308(A)TNF, связанный с повышенным уровнем транскрипции, обнаружен у 25,8% больных раком молочной железы. Установлено, что в группе больных с III стадией заболевания общая выживаемость для носителей -308(A)TNFзначительно выше, чем у носителей гомозигот по аллелю -308(G)TNF (5-летняя выживаемость 100 и 52,4 ± 6,9% соответственно; p = 0,002, критерий log-rank). Полученные данные позволяют рассматривать полиморфизм -308(G/A)TNF промоторной области гена TNF как возможный дополнительный прогностический признак при раке молочной железы.
Ключевые слова: рак молочной железы, фактор некроза опухоли TNF, геномный полиморфизм, общая выживаемость.
Фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor, TNF, TNFa) — воспалительный цитокин, который принимает участие в широком спектре биологических процессов в организме. Большой объем экспериментальных данных демонстрирует, в том числе на клеточных линиях рака молочной железы (РМЖ) человека, вовлеченность TNF в развитие и прогрессирование злокачественных новообразований [1]. Действие TNF опосредуется его рецепторами, и эффекты активируемых сигнальных каскадов могут быть диаметрально противоположными. TNF способен индуцировать как апоптоз, так и пролиферацию опухолевых клеток; он вызывает как сосудистый коллапс (приводя к некрозу опухоли), так и неоангиогенез; является индуктором эпителиально-мезенхимального перехода, способствуя инвазии и метастазированию. Ген TNF располагается на 6-й хромосоме в области генов HLA
© Маливанова Т. Ф., Юрченко В. А., Скоромыслова Е. В.,
Мазуренко Н. Н., 2012
УДК 618.19-006.6-036.8-002.4:575.224.234
III класса (6p21.3). В промоторной области гена TNFнахо-дится ряд сайтов однонуклеотидных замен, среди которых наиболее изучен 308(G/A)TNF [2]. В экспериментах in vitro показано, что замена гуанина на аденин в положении -308 п.н. приводит к повышению уровня транскрипции гена TNF от 2,5 [3] до 6—9 раз [2]. Полиморфизм этого сайта связывают с рядом инфекционных, аутоиммунных и онкологических заболеваний [4].
Ранее мы изучали распределение аллелей -308(G/A) TNF и микросателлитного маркера TNFa в зависимости от клинико-морфологических особенностей РМЖ. Мы не обнаружили ассоциации -308(G/A)TNF с развитием спорадического РМЖ, однако нам впервые удалось показать ассоциацию полиморфизма области гена TNF c наследственным характером заболевания [5], гистологическим типом [6] и рецепторным статусом опухоли [7]. В последние годы появились работы, в которых методом метаанализа 10 000 случаев выявлена ассоциация с РМЖ низкоэкспрессирующего аллеля -308(G) TNF [8, 9].
Данные литературы о прогностической значимости полиморфизма -308(G/A)TNF для этого онкологического заболевания ограничены, поэтому задачей нашего исследования явилось изучение зависимости общей выживаемости (ОВ) больных РМЖ от полиморфизма -308(G/A) TNF.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследовали коллекцию геномной ДНК, полученной от 260 больных первичным спорадическим РМЖ без отдаленных метастазов (M0), госпитализировавшихся в РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН в 2003—2004 гг. Все больные получали лечение в соответствии со стадией и с клинико-морфологическими характеристиками заболевания. Средний возраст больных составил 54,9 года (от 23 до 78 лет). По рецепторному статусу 60,6% опухолей экспрессировали рецепторы эстрогена (РЭ + ), 48,6% — рецепторы прогестерона (РП + ). По гистологическому типу 69,6% опухолей относились к инфильтративно-протоко-вому, 24,6% — к инфильтративно-дольковому, 5,8% — к смешанному типу РМЖ (при наличии как протокового, так и долькового компонента).
Образцы геномной ДНК были выделены из лейкоцитов венозной крови с использованием протеиназы-К с последующей фенольно-хлороформной экстракцией и осаждением этанолом. Анализ полиморфизма -308(G/A)TNF проводили методом полимеразной цепной реакции с применением аллель-специфических праймеров: 5'-tctcggtttcttctccatcg-3'
(antisense), 5'-ataggttttgaggggcatgg-3' (primer G sense), 5'-aataggttttgaggggcatga-3' (primer A sense) с последующим разделением продуктов реакции в 2% агарозном геле [6]. Распространенность генотипов -308(G/A)TNF сравнивали с помощью точного двустороннего критерия Фишера. Для проверки согласия распределения генотипов с распределением, равновесным по Харди— Вайнбергу, использовали критерий с2. Критерием оценки прогностической значимости изучаемого полиморфизма являлись показатели общей выживаемости (ОВ). Оценку ОВ проводили по методу Каплана—Майера с применением критерия log-rank в программе «GraphPad Prism» (версия 4.00). Различия считали статистически значимыми при p < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В анализируемой выборке минорный аллель -308(A) TNF был обнаружен в качестве гомозиготы у 2 (0,8%) женщин, гетерозиготы — у 65 (25%); 193 (74,2%) больных являлись носителями гомозигот по аллелю -308(G)TNF. Полученное распределение генотипов не отличалось от ожидаемого распределения Харди—Вайнберга (p = 0,2), как и от распределения генотипов, полученного нами ранее для контрольной группы [7] (p = 0,6). Поскольку число гомозигот по аллелю -308(A)TNF было мало, больные были разделены на 2 группы: «aa/ag» — группа женщин, в геноме которых обнаружен хотя бы один аллель -308(A) TNF, «gg» — группа носителей гомозигот по аллелю -308(G)TNF. Таким образом, у 25,8% больных РМЖ имелся генотип aa или ag и у 74,2% — генотип gg.
В обеих группах опухоли РЭ+ встречались примерно с одинаковой частотой (59% — для генотипа aa/ag,
61,2% — для генотипа gg; p = 0,8), как и опухоли РП + (47,4% — для генотипа aa/ag, 49,1% — для генотипа gg; p = 0,9). Опухоли с инфильтративно-протоковым гистологическим типом несколько чаще встречались у больных с генотипом gg (72,5%), чем у женщин с генотипом aa/ag (61,2%; p = 0,09).
Распределение больных РМЖ в соответствии со стадиями заболевания и с классификацией TNM представлено на рис. 1. Частота выявления генотипа aa/ag в выделенных группах статистически значимо не различалась и варьировала от 17,6 до 30,2% (см. рис. 1).
При анализе кривых ОВ для всей выборки статистически значимых различий между группами больных с генотипами aa/ag и gg не обнаружено (p = 0,2, критерий log-rank) (рис. 2, А). В группе носителей генотипа aa/ag 5-летняя ОВ была несколько выше (89,3 ± 3,9%), чем у носителей генотипа gg (82,7 ± 2,8%), но различия не были статистически значимыми. При разделении выборки в соответствии с рецепторным статусом и гистологическим типом опухоли статистически значимых различий по ОВ между носителями генотипов aa/ag и gg также не выявлено (данные не представлены).
Для больных с I и со II стадиями заболевания (независимо от генотипа -308(G/A)TNF), как и для носителей генотипа aa/ag с III стадией заболевания, кривые ОВ не опускались ниже уровня 83% (рис. 2, Б). При III стадии РМЖ кривые ОВ для носителей генотипа aa/ag располагались статистически значимо выше, чем для носителей генотипа gg (5-летняя ОВ 100% и 52,4 ± 6,9%, соответственно; p = 0,002, критерий log-rank) (см. рис. 2, Б). Аналогично выглядели кривые ОВ при разделении выборки по размеру опухоли (T) и вовлеченности лимфатических узлов (N): для носителей генотипов aa/ag и gg с опухолями T3—4 5-летняя ОВ составляет 93,8 ± 6,1 и 48,6 ± 8,5% соответственно (p = 0,004, критерий log-rank; рис. 2, В), при опухоли N2—3 — 100% для носителей генотипа aa/ag и 38,1 ± 9,6% для носителей генотипа gg (p = 0,02, генотипа; рис. 2, Г).
ТЫМ абс. %
Т1 86 33,1
Т2 121 46,5
ТЗ-4 53 20,4
N0 109 41,9
N1 117 45,0
N2—3 34 13,1
МО 260 100,0
Стадии
I 61 23,5
II 128 49,2
III 71 27,3
О 25 50 75 100
Частота, %
Рисунок 1. Распределение больных РМЖ в зависимости от стадии заболевания и распространенности генотипов aa/ ag и gg -308(в/А)ТЫР.
аа/ад
дд
Время, мес
Время, мес
Время, мес
Время, мес
B
Г
Рисунок 2. Зависимость ОВ больных РМЖ от полиморфизма -308(G/A)TNF.
А. Для всей выборки (p = 0,02). 1. — aa/ag; 2 — gg. Б. В зависимости от стадий заболевания (p < 0,0001). 1. — aa/ag, III—IV стадии;
2 — gg, I стадия; 3 — aa/ag, I стадия; 4 — gg, II стадия; 5 — aa/ag, II стадия; 6 — gg, III—IV стадии. В. В зависимости от размера опухоли (p < 0,0001). 1 — gg, T1; 2 — aa/ag, T1; 3 — aa/ag, T3—4; 4 — gg, T2; 5 — aa/ag, T2; 6 — gg, T3—4. Г. В зависимости от состояния лимфатических узлов (p < 0,0001). 1. — aa/ag, N2—3; 2 — gg, N0; 3 — aa/ag, N1; 4 — gg, N1; 5 — aa/ag, N0; 6 — gg, N3—3.
Таким образом, наличие аллеля -308(A)TNF может являться фактором, повышающим выживаемость при РМЖ.
ОБСУЖДЕНИЕ
Попытки определить диагностическую и/или прогностическую значимость TNF для РМЖ позволили выявить повышенный уровень этого цитокина как в сыворотке крови больных [10, 11], так и в опухолевой ткани [12, 13]. Повышенный уровень TNF был ассоциирован с поздними стадиями заболевания [11], отрицательным рецепторным статусом [12] и инфильтративно-дольковым
типом опухоли [13]. Ранее мы обнаружили статистически значимое увеличение частоты высокоэкспрессиру-ющего генотипа аа/ад в группе больных с инфильтра-тивно-дольковым по сравнению с таковой у пациентов с инфильтративно-протоковым гистологическим типом РМЖ (р = 0,04) в выборке из 167 больных РМЖ [6]. При расширении этой выборки до 260 больных в представленной работе полученное различие в 11% случаев теряет статистическую значимость (р > 0,05). Однако следует рассматривать подобную тенденцию как важную биологическую характеристику, так как состав экспрессируемых генов в значительной мере отличается от такового
A
Б
для инфильтративно-долькового и инфильтративно-про-токового типов опухоли [14].
Приведенные выше данные литературы демонстрируют ассоциацию TNF с развитием РМЖ. В то же время повышение уровня экспрессии воспалительного цитоки-на может отражать интенсивность реакции организма на наличие опухолевого процесса, т. е. проявление противоопухолевого действия TNF. Известен ряд механизмов противоопухолевого эффекта TNF: прямое цитотокси-ческое действие на опухолевые клетки, индукция геморрагического некроза опухоли, стимуляция противоопухолевого иммунитета, а также синергичность действия с противоопухолевыми препаратами [15]. Поскольку в эксперименте эти процессы зависят от дозы индуктора, можно предполагать, что на них способен влиять полиморфизм промоторной области гена, регулирующий уровень экспрессии эндогенного TNF.
Известно, что геномный полиморфизм имеет этноге-ографические особенности. Ch. Shen и соавт. [8] сделали вывод, что аллель -308(A)TNF может быть важным защитным фактором для европейцев, однако для африканских арабов (Северная Африка, Тунис) генотип, содержащий гомозиготу этого аллеля, является фактором риска развития РМЖ. В то же время исследование тунисской популяции показало статистически значимое снижение общей и безрецидивной выживаемости для носителей гомозиготы -308(A)TNF [16]. Однако наши результаты свидетельствуют о том, что наличие аллеля -308(A)TNF существенно повышает ОВ больных РМЖ III стадии. Необходимо отметить, что обе женщины, гомозиготные по аллелю -308(A)TNF, были живы по истечении периода наблюдения (61 и 67 мес). Таким образом, наблюдается разнонаправленное влияние полиморфизма -308(G/A) TNF на возникновение и прогноз РМЖ в разных национальных группах.
При изучении американской популяции (без указания этнической принадлежности) А. DeMichel и соавт. [17] не обнаружили различий по 4-летней ОВ больных РМЖ между носителями аллеля -308(A)TNF и в отсутствие этого аллеля. Авторы не разделяли выборку по стадиям заболевания, но у всех больных имелись метастазы в 4 регионарных лимфатических узлах и более (т. е. статус N2—3). В противоположность этому для российских больных мы находим статистически значимое повышение ОВ для носителей генотипа aa/ag в группе со статусом N2—3, как и в группе больных РМЖ III стадии, что также может объясняться различием в национальном составе исследуемых популяций.
Мы впервые показали зависимость ОВ от полиморфизма -308(G/A)TNF для российской популяции, причем такая зависимость оказалась критичной только для поздних стадий заболевания. Возможно, это связано с тем, что относительно невысокая распространенность генотипа aa/ag (около 1/4 больных) в сочетании с высокой ОВ для I и II стадий РМЖ (5-летняя ОВ 98,4 ± 1,6 и 89,4 ± 2,8% соответственно) не позволяет выявить ассоциацию полиморфизма на ранних стадиях заболевания. В то же время мы наблюдаем значительные различия почти 50% по 5-летней ОВ между группами носителей генотипов aa/ag и gg для больных РМЖ II стадии. Создается впечатление, что в отношении ОВ генотип aa/ag «снижает» степень
агрессивности заболевания и у больных РМЖ III стадии с таким генотипом ОВ повышается до уровня ОВ у больных с I—II стадиями заболевания. Можно предположить, что низкоэкспрессирующий генотип gg не обеспечивает необходимого уровня эндогенного TNF, в то время как высокоэкспрессирующий генотип aa/ag, по-видимому, способен реализовать противоопухолевый эффект TNF на поздних стадиях заболевания.
Мы не обнаружили для носителей генотипов aa/ag и gg статистически значимых различий по клинико-морфологическим характеристикам (экспрессия РЭ, РП и гистологический тип опухоли), способным повлиять на выбор проводившегося лечения. Поскольку распространенность этих генотипов примерно одинаковая для всех стадий (см. рис. 1), то повышение ОВ у носителей генотипа aa/ag с III стадией РМЖ может быть обусловлено большей чувствительностью к терапии, предусмотренной для поздних стадий этого онкологического заболевания.
Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что полиморфизм -308(G/A)TNF может быть использован как дополнительный прогностический фактор при III стадии РМЖ. Наши дальнейшие исследования будут направлены на выяснение зависимости чувствительности к проводимой терапии от функционально значимых полиморфизмов промоторной области гена TNF.
ЛИТЕРАТУРА
1. Balkwill L. TNF-a in promotion and progression of cancer // Cancer Metastasis Rev. — 2006. — Vol 25. — P. 409—416.
2. Hajeer A. H., Hutchinson I. V. Influence of TNFa gene polymorphisms on TNFa production and disease // Human Immunol. — 2001. — Vol. 62. — P. 1191—1199.
3. A critical assessment of the factors affecting reporter gene assays for promoter SNP function: a reassessment of -308 TNF polymorphism function using a novel integrated reporter system / Karimi M., Goldie L. C., Cruickshank M. N., Moses E. K., Abraham L. J. // Eur. J. Human Genet. — 2009. — Vol. 17. — P. 1454—1462.
4. Tumor necrosis factor alpha -308 gene locus promoter polymorphism: An analysis of association with health and disease / Elahi M. M., Asotra K., Matata B. M., Mastana S. S. // Biochimica et Biophysica Acta. — 2009. — Vol. 1792. — P. 163—172.
5. Полиморфизм в локусе гена фактора некроза опухолей при спорадическом и наследственном раке молочных желез / Маливанова Т. Ф., Осташкин А. С., Юрченко В. А., Мазуренко Н. Н. // Вопр. онкол. — 2007. — Т. 53, № 6. — С. 664—667.
6. Полиморфизм в локусе гена фактора некроза опухолей у больных раком молочной железы / Осташкин А. С., Маливанова Т. Ф., Юрченко В. А., Мазуренко Н. Н. // Генетика. — 2008. — Т. 44, № 9. — С. 1275—1280.
7. Генетические маркеры локуса гена фактора некроза опухолей (TNF): ассоциация с рецепторным статусом рака молочной железы / Маливанова Т. Ф., Осташкин А. С., Юрченко В. А., Герштейн Е. С., Чуев Ю. В., Мазуренко Н. Н. // Молекул. мед. — 2009. — № 3. — С. 18—23.
8. Polymorphisms of tumor necrosis factor-alpha and breast cancer risk: a meta-analysis / Shen Ch., Sun H., Sun D., Xu L., Zhang X., Liu A., Jia X., Bai J., Chen F., Yu Y., Jin Y., Yu J., Fu S. // Breast Cancer Res. Treat. — 2011. — Vol. 126, N 3. — P. 763—770.
9. TNFa -308 G/A polymorphism is associated with breast cancer risk: a meta-analysis involving 10,184 cases and 12,911 controls / Fang F., Yao L., Yu X. J., Yu L., Wu Q., Yu L. // Breast Cancer Res. Treat. — 2010. — Vol. 122, N 1. — P. 267—271.
10. Polymorphisms in cytokine genes and serum cytokine levels among New Mexican women with and without breast cancer / Erdei E., Kang A., Meisner A., White K., Pickett G., Baca C., Royce M., Berwick M. // Cytokine. — 2010. — Vol. 51. — P. 18—24.
11. Significance of serum tumor necrosis factor-alpha and its combination with HER-2 codon 655 polymorphism in the diagnosis and prognosis of breast cancer / Papadopoulou E., Tripsianis G., Anagnostopoulos K., Tentes I., Kakolyris S., Galazios G., Sivridis E., Simopoulos K., Kortsa-ris A. // Int. J. Biol. Markers. — 2010. — Vol. 25, N 3. — P. 126—135.
12. Oestrogen receptor negative breast cancer exhibit high cytokine content [Электронный ресурс] / Chavey C., Bibeau F., Gourgou-Bour-gade S., Burlinchon S., Boissiere F., Laune D., Roques S., Lazennec G. // Breast Cancer Res. — 2007. — Vol. 9, N 1. — R 15. — URL: http://breast-cancer-research.com/content/9/1/R15 (дата обращения: 10.01.2012).
13. Role of tumor necrosis factor-a and its receptors in human benign breast lesions and tumors (in situ and infiltrative) / Garcia-Tunon I., Ricote M., Ruiz A., Fraile B., Paniagua R., Royuela M. // Cancer Sci. — 2006. — Vol. 97, N 10. — P. 1044—1049.
14. Lobular and ductal carcinomas of the breast have distinct genomic and expression profiles / Bertucci F., Orsetti B., Negre V., Finetti P., Rouge C., Ahomadegbe J.-Ch., Bibeau F., Mathieu M.-Ch., Treilleux I., Jacquemier J., Ursule L., Martinec A., Wang Q., Benard J., Puisieux A.,
Birnbaum D., Theillet Ch. // Oncogene. — 2008. — Vol. 27, N 40. —
P. 5359—5372.
15. Bertazza L., Mocellin S. The Dual Role of Tumor Necrosis Factor (TNF) in Cancer Biology // Current Med. Chem. — 2010. — Vol. 17. — P. 3337—3352.
16. Genetic variation in the tumor necrosis factor alpha promoter region and in the stress protein hsp70-2: susceptibility and prognostic implications in breast carcinoma / Mestiri S., Bouaouina N., Ahmed S. B., Khedhaier A., Jrad B. B., Remadi S., Chouchane L. // Cancer. — 2001. — Vol. 91. — P. 672—678.
17. Interleukin-6 -174G®C Polymorphism Is Associated with Improved Outcome in High-Risk Breast Cancer / DeMichele A., Martin A.-M., Mick R., Gor P., Wray L., Klein-Cabral M., Athanasiadis G., Colligan T., Stadtmauer E., Weber B. // Cancer Res. — 2003. — Vol. 63. — P. 8051—8056.
Поступила 18.01.2012
Tatyana Feodorovna Malivanova1, Valentina Alexandrovna Yurchenko2, Elena Victorovna Skoromyslova3, Natalia Nikolayevna Mazurenko4
-308(G/A)TNF POLYMORPHISM INFLUENCES OVERALL SURVIVAL OF BREAST CANCER PATIENTS
' MD, PhD, Senior Researcher, Oncogenomics Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
2 MD, PhD, Senior Researcher, Tumor Epidemiology Department, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
3 Laboratory Assistant, Oncogenomics Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
4 MSc, PhD, DSc, Professor, Head, Oncogenomics Laboratory, Carcinogenesis Research Institute,
N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS (24, Kashirskoye sh., Moscow, RF, 115478)
Address for correspondence: Malivanova Tatyana Feodorovna, Oncogenomics Laboratory,
Carcinogenesis Research Institute, N. N. Blokhin Russian Cancer Research Center, RAMS, 24, Kashirskoye sh.,
Moscow, 115478, RF; e-mail: [email protected]
TNF is an inflammatory cytokine involved in development and progression of malignancies. Promoter single nucleotide polymorphism influences the level of TNF transcription. Low expression of allele -308(G) TNF is associated with breast cancer. The purpose of this study was to analyze prognostic significance of -308(G/A)TNF polymorphism in breast carcinoma. Retrospective analysis was carried out in 260 breast cancer patients free from distant metastasis. -308(G/A)TNF polymorphism was detected by allele specific polymerase chain reaction. We found that overall survival of stage III patients was significantly higher in the presence of -308(A)TNF allele than in homozygous -308(G)TNF genotype (5-year overall survival 100% and 52.4 ± 6.9%, respectively; logrank test p = 0.002). This study suggests that -308(G/A)TNF polymorphism may be an additional prognostic factor in breast carcinoma.
Key words: breast cancer, tumor necrosis factor TNF, polymorphism, overall survival.
