CC BY
49
УДК 577.3:615.28:547.495.9
ВПЛИВ ПОЛІГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНІДИНУ ГІДРОХЛОРИДУ НА ПЛАЗМАТИЧНУ МЕМБРАНУ ФІБРОБЛАСТІВ КУРЯЧИХ ЕМБРІОНІВ ТА НА ШТУЧНУ БІШАРОВУ ЛІПІДНУ МЕМБРАНУ
А. В. Лисиця1 1Інститут епізоотології УААН, Рівне
П. Ю. Кривошия1
О. Я. Шатурський2 2Інститут біохімії ім. О. В. Паладіна НАН України, Київ
Е-mail: о[email protected], [email protected]
Розглянуто вплив різних концентрацій полігексаметиленгуанідину гідрохлориду на іонну провідність бішарової фосфоліпідної мембрани, що слугує за модель нативної мембрани мікроорганізмів. Визначено його мінімальну концентрацію, за якої провідність мембрани зазнає змін, — 0,2 мг/л. Також встановлено концентрацію, що не пошкоджує моношарову субкультуру фібробластів курячого ембріона та захищає її від ураження вірусом ринопневмонії коней. Отримані результати свідчать про незворотний характер взаємодії молекул полігексаметиленгуанідину гідрохлориду зі штучними ліпідними мембранами та плазматичними мембранами фібробластів.
Ключові слова: полігексаметиленгуанідину гідрохлорид, фосфоліпідні мембрани, фібробласти, герпесвірус.
Серед порівняно нових препаратів, які найбільш повно відповідають зростаючим вимогам щодо дезінфектантів, значну роль починають відігравати полімерні сполуки гуанідину або поліалкіленгуанідини (ПАГи). Ця група дезінфектантів за низкою параметрів істотно відрізняється від традицій -них препаратів, які виготовляють на основі четвертинних амонієвих сполук (ЧАС), альдегідів, поверхнево-активних речовин (ПАР), похідних фенолу, хлорактивних сполук та ін. Завдяки полімерній природі біоцидна активність ПАГів вища, ніж у хлоргексидину біглюконату та низькомолекулярних катіонних ПАР, до того ж вони менш токсичні.
Одним з основних представників групи полімерних похідних гуанідину є полігекса-метиленгуанідину гідрохлорид (ПГМГ), що належить до катіонних поліелектролітів. Його біоцидні властивості зумовлені наявністю гуанідинових груп [1].
За хімічною будовою ПГМГ — лінійний або розгалужений полімер, добре розчинний у воді; молекулярна маса, зазвичай, у межах 10 кДа. За зовнішнім виглядом це — прозора склоподібна маса. ПГМГ є основним компонентом нового дезінфектанту Епідез, розробленого в Інституті епізоотології УААН [2].
Схематично механізм біоцидної дії препарату може виглядати так. На першому етапі взаємодії з негативно зарядженою бактеріальною клітиною молекули полікатіона ПГМГ сорбуються на її поверхні та частково блокують дихання, живлення і транспортування метаболітів. Тейхоєві кислоти клітинної стінки (наприклад, у B. subtШs вони становлять до 60% маси клітини) виступають як поліаніон. Найімовірніше, клітинна стінка бактерій не є суттєвою перепоною для молекул ПГМГ, які, подолавши її, можуть електростатично зв’язуватися з плазматичною мембраною. При цьому ПГМГ взаємодіє із залишками сіалової кислоти, карбоксильними групами амінокислот, протеїнами, кислими фосфоліпідами та полісахаридами цитоплазматичної мембрани. Гідрофобні взаємодії також беруть участь у цьому про-
цесі, оскільки молекула ПГМГ містить неполярні гексаметиленові ділянки, здатні до взаємодії з алкільними ланцюгами жирних кислот фосфоліпідів мембран. Первинна електростатична взаємодія негативно заряджених груп на клітинній мембрані з молекулою полімеру призводить до переорієнтації молекули і взаємодії її заряджених гуаніди-нових груп з полярними голівками зовнішнього ліпідного шару мембрани. Макромолекула полімеру кооперативно зв’язується з великою кількістю молекул мембранних фосфоліпідів і спричиняє нейтралізацію їхнього негативного заряду. Комплекс, що утворився, зумовлює зміни електростатичних та гідрофобних взаємодій алкільних ланцюгів жирних кислот фосфоліпідів, які стабілізували мембрану. Наслідком сорбції є порушення бар’єрних і транспортувальних функцій мембрани, а подальше можливе проникнення до її неполярної частини гідрофобних гексаметиленових фрагментів молекули ПГМГ впливає на ван-дер-вааль-сові взаємодії між молекулами ліпідів. Таким чином, сорбція й інкорпорація молекул ПГМГ спричинюють спочатку зміну проникності, а потім і цілісності мембрани, яка деструктурується та фрагментується. Окрім того, ПГМГ може неспецифічно впливати на роботу окремих ензиматичних систем і, можливо, інгібувати деякі ензими, що розташовані у цитоплазматичній мембрані [3]. Адже, як відомо, цитоплазматична мембрана прокаріотів є біохімічно активною оболонкою бактерій, з нею пов’язана майже вся цитохромна активність клітини, до 90% активності дегідрогеназ, фосфатази, рибонуклеази, б'-нуклеотидази, ензимів фосфо-рилювання. Комплекс зазначених вище факторів і призводить до порушення цілісності мембрани, її ензиматичних, бар’єрних і транспортувальних функцій та, як наслідок, — до розладу метаболізму та загибелі клітини [1,
2, 4].
В експериментах російських дослідників з вивчення впливу ПГМГ на водорості Chlorella pyrenoidosa було встановлено, що додавання препарату в середовище інкубації спричинювало зміни проникності плазматичних мембран за концентрації 50 мг/л (або б • 10-3 %) і часткове руйнування клітин при 100 мг/л (або 1 • 10-2 %) [б]. А визначення впливу ПГМГ на фотосинтетичну активність Chlorella показало, що навіть короткочасна інкубація водорості в середовищі з ПГМГ призводить до інгібування фотосинтетичної активності й може зменшувати продуктивність клітин [б]. Так, під час корот-
котривалої дії низьких концентрацій ПГМГ гідрохлориду (0,001-0,1 мг/л або 10-7-10-5 %) у клітинах водорості Chlorella pirenoidosa змінювалася швидкість транспортування електронів на акцепторній ділянці фотосис-теми ІІ (ФС ІІ) і підсилювалась енергізація тилакоїдних мембран. За концентрацій ПГМГ, більших ніж 0,1 мг/л (>10-5 %) відбувалось різке інгібування фотосинтезу, а добова інкубація Chlorella в розчинах з такою концентрацією зумовлювала незворотну деструкцію ФС ІІ і, ймовірно, всього фотосинтетичного апарату [5].
Вивчення впливу полімерних похідних гуанідину на фракційний і жирнокислотний склад мембранних і нейтральних ліпідів пліснявого гриба Aspergillus niger [6] показало, що за певних низьких концентрацій (близько 1 • 10-5 %) ПГМГ може діяти на грибок навіть стимулююче. При цьому в клітинах Aspergillus зростає рівень загальних ліпідів, зокрема мембранних (полярних). Подальше збільшення концентрації ПГМГ призводить до сповільнення росту, збільшується частка фракції нейтральних (резервних або запасних) ліпідів. Підвищення концентрації ПГМГ (до 10-3-10-1 %) діє згубно на мікроорганізм, перед загибеллю грибка змінюється жирнокислотний склад його ліпідів, у міцелії утворюються ліпіди з більшою кількістю насичених жирних кислот і з меншим значенням йодного числа.
Дослідження гриба Cunninghamella japo-nica також виявили, що у відповідь на стрес, викликаний дією дезінфектанту, починають функціонувати такі механізми біохімічної адаптації, як зміна ненасиченості жирних кислот мембранних ліпідів, довжини їхніх алкільних ланцюгів, модифікації фракційного складу клітинних ліпідів [6].
Отже, полігуанідинові дезінфектанти є мембраноактивними сполуками, у випадку з пліснявими грибками вони істотно впливають на фракційний і жирнокислот-ний склад як загальних, так і, передусім, мембранних ліпідів. Проте тонкі механізми дії ПАГів на мембрани й досі залишаються нез’ясованими.
Метою роботи було визначити, в яких концентраціях полігексаметиленгуанідину гідрохлорид здатен взаємодіяти з ліпідним бішаром штучної мембрани і призводити до формування в ньому іонпровідних отворів, а також з’ясувати, чи має взаємодія полімеру з ліпідним бішаром зворотний характер. Окрім того, необхідно було встановити характер взаємодії ПГМГ з нативною мембраною фібробластів курячого ембріона та
можливість використання ПГМГ для оброблення евкаріотичних клітин з метою захисту їх від ураження вірусом ринопневмонії коней, що належить до групи герпесвірусів.
Матеріали і методи
Об’єкти досліджень. Штучна пласка бі-шарова ліпідна мембрана (БЛМ) [7]. Субкультура фібробластів курячого ембріона, не перещеплювана, не трансформована.
Культуру фібробластів курячого ембріона та культуру вірусу ринопневмонії коней отримували за загальновизнаною методикою [8].
БЛМ слугувала аналогом плазматичних мембран мікроорганізмів. Вивчали, зокрема, вплив на іонну провідність БЛМ різних концентрацій ПГМГ.
Мембрану формували за спеціальною методикою [7] з розчину фосфатидилхоліну (ФХ) (Харківський завод біопрепаратів «Біолек») та холестеролу (Calbiochem, Німеччина) в н-гептані на отворі діаметром 0,6 мм в тефлоновому стаканчику, розміщеному в скляній комірці.
Співвідношення ФХ:холестерол у розчині становило 2:1 при загальній концентрації ліпідів 20 мг/мл. Формування ліпідного бішару спостерігали візуально у відбитому світлі за допомогою бінокулярного мікроскопа. Розчин, який оточує мембрану, містив 10 мМ трис-HCl (Sigma, США) та задану кількість хлоридів металів кваліфікації «х.ч.».
Для вимірів провідності мембрани використовували хлор-срібні електроди, занурені в розчин 2 М хлористого калію з агаровими містками, розміщеними з різних боків мембрани. Електричний потенціал зовні тефлонового стаканчика (цис-сторона) задавали відносно потенціалу внутрішнього об’єму (транс-сторона), який приймали рівним 0 мВ. Вихідний мембранний потенціал в експерименті становив 50 мВ. Водно-сольовий розчин, який оточує мембрану, перемішували за допомогою магнітної мішалки. Усі експерименти проводили при температурі 22-24 °С.
До цис-сторони (зовні) додавали розчини ПГМГ («Терміт», Україна) у буфері в певних концентраціях. Спостерігали за зміною в часі інтенсивності трансмембранного іонного струму, що спричинював зміну електричного потенціалу мембрани. За відсутності каналформувальних елементів (наприклад, антибіотиків) провідність БЛМ залишається незмінною, додавання досліджуваних речовин у певних концентраціях може зумовлювати зростання трансмемб-
ранного струму і зміну потенціалу. Таким чином, можна визначити здатність досліджуваних препаратів формувати іонпровід-ні отвори в пласкій БЛМ, тобто змінювати її електропровідність.
ПГМГ розчиняли в 0,9%-му NaCl (фіз-розчин), одержуючи вихідну концентрацію діючої речовини. Вона становила від 10-6% до 10 3 %, або від 10 мкг/л до 10 мг/л. Виходячи з того, що середня молекулярна маса полімеру, який брали для випробувань, становить близько 10 кДа, молярна концентрація препарату, відповідно, була в межах 10-11-10-8. У дослідах з фібробластами концентрацію препарату від 10-7 % до 10-4 % отримували, змішуючи вихідні розчини ПГМГ із сольовим збалансованим середовищем Хенк-са (рН 7,4) у співвідношенні 1:9. При цьому властивості середовища істотно не змінювались, у контролі брали суміш фізрозчину й розчину Хенкса у тих самих пропорціях. Кислотність контролювали з використанням іономіру типу И-130, рН встановлювали в межах 7,35-7,45.
Для визначення можливості зв’язування молекул ПГМГ з плазматичною мембраною фібробластів до сформованого моношару клітин додавали 1-2 мл робочих розчинів ПГМГ різної концентрації в сольовому розчині Хенкса. Через 10 хв препарат зливали, промивали моношар фізрозчином і заливали вірусний матеріал у розчині Хенкса.
У дослідах використовували середню ци-топатичну концентрацію вірусу ринопнев-монії коней (Equine herpesvirus type 1), титр ЦПД (цитопатична дія) 10-2 /0,5 мл.
Проби термостатували при 37 °С, спостереження проводили протягом 3-6 діб. Стан моношару клітин і бляшкоутворення оцінювали візуально, застосовуючи лабораторний бінокулярний мікроскоп (збільшення х70), клітини, в разі необхідності, забарвлювали гематоксилін-еозином за загальновизнаною методикою [8].
Результати та обговорення
Вивчення впливу різних концентрацій біологічно активного полімеру ПГМГ на іонну провідність БЛМ показало, що в концентраціях починаючи з 2 • 10-5 % і вище він здатен взаємодіяти з ліпідним бішаром штучної мембрани (табл. 1). При цьому в БЛМ виникають іонпровідні отвори унаслідок зростання трансмембранного струму 100 мМ NaCl, і досить швидко відбувається розрив мембрани.
Видалення ПГМГ з водно-сольового розчину, що оточує мембрану (перфузія, відмивання), не призводило до зменшення її
провідності, це може свідчити про порівняно швидкий і незворотний характер взаємодії препарату з ліпідним бішаром.
Основним чинником фізичної природи, що зумовлює міцне зв’язування адсорбованої на БЛМ молекули ПГМГ, може бути електростатична взаємодія полікатіона дезінфектанту з негативно зарядженими фосфатними групами ліпідів. Комплекс, що утворився, стабілізується гідрофобними взаємодіями між алкільними ланцюгами жирних кислот фосфоліпідів і гексаметиленовими ділянками молекули ПГМГ.
Таблиця 1. Вплив різних концентрацій ПГМГ на стан БЛМ
Концентрація ПГМГ в цис-комірці БЛМ, % Ефект
2 1 О Зростання трансмембранного струму через 1,2 хв, розрив БЛМ
2 ■ 102 Зростання трансмембранного струму через 1,2 хв, розрив БЛМ
2 ■ 103 Зростання трансмембранного струму через 1,6 хв, розрив БЛМ
2 О Зростання трансмембранного струму через 6,6 хв, розрив БЛМ
2 ■ 105 Зростання трансмембранного струму через 7-10 хв, розрив БЛМ
2 ■ 106 Незмінність провідності БЛМ протягом 30 хв і довше, цілісність БЛМ, що не виключає можливості зв’язування ПГМГ з поверхнею ліпідного бішару
Таким чином, одним з головних механізмів біоцидної дії ПГМГ може бути пошкодження ліпідного бішару нативних мембран прокаріотів, виникнення в плазматичній мембрані іонпровідних отворів.
Досліди з обробленням сформованого моношару клітин первинної субкультури фібробластів курячого ембріона розчинами ПГМГ показали, що в певних концентраціях цей біоцид може навіть захистити клітини від ураження вірусом ринопневмонії коней (Equine herpesvirus type 1). Узагальнені результати експериментів наведено в табл. 2.
У контролі № 1 замість ПГМГ брали суміш фізрозчину і сольового розчину Хенк-са у тих самих пропорціях; після промивання чистим фізрозчином додавали вірусний матеріал (перевірений на ЦПД) у розчині Хенкса. У контролі № 2 після оброблення клітин робочими розчинами ПГМГ (концент-
Таблиця 2. Вірусопротекторний ефект ПГМГ
Концент- рація ПГМГ у зразку, % Стан моношару фібробластів
10-4 Протягом двох діб спостережень моношар без змін, вірус не пошкоджує клітини
10-5 Протягом двох діб спостережень моношар без змін, вірус не пошкоджує клітини
10-6 Моношар почав пошкоджуватися упродовж перших 24 год, спостерігаються ділянки зі зруйнованих клітин; протягом наступної доби — повна деструкція моношару, вірус не інак-тивовано повністю
10-7 Моношар почав пошкоджуватися вже протягом перших 5-7 годин, спостерігаються ділянки зруйнованих клітин; упродовж наступної доби — повна деструкція, вірус не інак-тивовано
Контроль № 1 Бляшкоутворення, моношар клітин уражений вірусом, зруйнований протягом двох діб інкубування
Контроль № 2 (усереднений за 4 зразками з різною концентрацією ПГМГ) Моношар у нормі, протягом 6 діб без змін
рація препарату становила від 10-7 % до 10-4%) та промивання фізрозчином замість вірусного матеріалу до моношару додавали чистий розчин Хенкса. Таким чином, короткочасна 10-хвилинна обробка моношару фібробластів препаратом з концентрацією ПГМГ 10-5-10-4 % надійно захистила клітини від ураження вірусом ринопневмонії коней. Оскільки препарат діяв і після промивання моношару фізрозчином, можна припустити, що молекули ПГМГ міцно зв’язалися з плазматичними мембранами клітин і забезпечили вірусопротекторний ефект. При цьому сам вірус залишався неушкодженим і не сорбувався на поверхню клітин. Після перенесення цього вірусвмісного розчину Хенкса на необроблений препаратом моношар клітин останній швидко вражався вірусом і гинув протягом першої доби інкубування (як і в контролі). Можливо, в даному разі
відбувається блокування молекулами ПГМГ специфічних рецепторів на поверхні клітини, вірус їх не розпізнає і не може адсорбуватися. Ще однією з причин може бути загальне зменшення або перерозподіл електричного потенціалу на поверхні клітини, спричинені як зміною іонної провідності мембрани, так і позитивним зарядом самої молекули ПГМГ. Вище вже зазначалося, що навіть короткотривала дія низьких концентрацій ПГМГ гідрохлориду (0,001-0,1 мг/л або 10-7-10-5%) на Chlorella pirenoidosa змінювала швидкість транспортування електронів на акцепторній ділянці ФС ІІ і впливала на електричний потенціал мембран тилакоїдів [5].
Концентрація ПГМГ 10-4 %, яка за попередніми нашими дослідженнями є цитоцид-ною для фібробластів, а також достатня для формування іонпровідних отворів у штучних БЛМ, за такий короткий час дії не призвела до скільки-небудь помітних змін стану клітин моношару. Концентрації ПГМГ 10-7-10-5 % можна вважати практично не-токсичними для сформованого моношару фібробластів, принаймні вони не впливають суттєво на тривалість життя клітин моношару.
Варто зазначити, що в інших наших експериментах концентрація ПГМГ 10-6 % дещо послаблювала, але не інактивувала повністю вірус у культурі. Оброблений таким препаратом вірус при перенесенні на моношар
вражав клітини та спричинював їх загибель, проте бляшкоутворення і деструкція моношару відбувалися повільніше. Mінімальна концентрація ПГMГ, за якої повністю інак-тивується вірус ринопневмонії коней (для титру ЦПД 10-2 / 0,5 мл та інкубації при 37 °С протягом 1 год) була визначена нами на рівні 10-5 %.
Таким чином, у штучних бішарових ліпідних мембранах DTM^ що є основним компонентом нового дезінфектанту Епідез, формує іонпровідні отвори, починаючи з концентрацій 0,2 мг/л (або 210-5 %) і вище, при цьому ПГMГ незворотно зв’язується з фосфоліпідами мембрани. Аналогічно, зв’язуючись із плазматичною мембраною мікроорганізму, ПГMГ призводить до порушення провідних та інших функцій мембрани, спричинює її деструкцію і згодом загибель клітини.
ПГMГ здатен також взаємодіяти з плазматичними мембранами евкаріотів, для яких є характерною наявність значної кількості холестеролу. Досліди з фібробластами курячого ембріона показали, що препарат, який за тривалої дії є токсичним для клітин починаючи з концентрацій 2 ■ 10-4 % і вище, в концентраціях 1 ■ 10-б-1 ■ 10-4 % за короткий час адсорбується на поверхні клітин і захищає їх від ураження герпесвірусом ринопневмонії коней.
ЛІТЕРАТУРА
1. Гембицкий П. А. Полимерный биоцидный препарат полигексаметиленгуанидин. — Запорожье: Полиграф, 1998. — 44 с.
2. Мандигра М. С., Степаняк І. В., Лисиця А. В. та ін. Використання полігексаметиленгу-анідину для дезінфекції // Агр. вісн. Причорномор’я: Зб. наук. праць. Вип. 42. — Одеса: CMИЛ, 2008. — Ч. 2. — С. б9-73.
3. Мандигра М. С., Лисиця А. В., Андрущук І. Л. та ін. Біохімічні аспекти біоцидної дії полімерних похідних гуанідину // Вісн. Білоцерківського держ. агр. ун-ту: Зб. наук. праць. — Біла Церква, 2009. — Вип. б0. — Ч. 1. — С. 81-85.
4. www.iet.biocide.ru 28.01.2009.
5. Константиновская С. В. Исследование действия биоцидов (на примере ПГМГ) на эколого-функциональное состояние водоросли Chlorella pyrenoidosa: автореф. дис. канд. биол. наук: спец. 03.00.16. «Экология» / С. В. Константиновская. — М., 2006. — 20 с.
6. Кузнецова Л. С. О механизме действия поли-гуанидиновых дезинфектантов // Мясн. инд. — 2001. — № 4. — С. 16-19.
7. Shamoo A. E, Goldstein D. A Isolation of iono-phores from ion transport system and their role in energy transduction // Biochem. Bio-phys. Acta. — 1977. — V. 472. — P. 13-53.
8. Гирін В. М., Порохницький В. Г., Вороненко С. Г. та ін. Посібник з медичної вірусології / За ред. В. М. Гиріна. — К.: Здоров’я, 1995. — С. 48-51.
б0
ВЛИЯНИЕ ПОЛИГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНИДИНА ГИДРОХЛОРИДА НА ПЛАЗМАТИЧЕСКУЮ МЕМБРАНУ ФИБРОБЛАСТОВ КУРИНЫХ ЭМБРИОНОВ И НА ИСКУССТВЕННУЮ ДВУХСЛОЙНУЮ ЛИПИДНУЮ МЕМБРАНУ
А. В. Лисица1 П. Ю. Кривошея1 О. Я. Шатурский2
1Институт эпизоотологии УААН, Ровно
Е-mail: [email protected]
2Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев
Е-mail: о[email protected]
В работе представлены результаты изучения влияния разных концентраций полигек-саметиленгуанидина гидрохлорида на ионную проводимость бислойной фосфолипидной мембраны, служащей моделью нативной мембраны микроорганизмов. Определена его минимальная концентрация, которая способна изменять проводимость мембраны, — 0,2 мг/л. Также определена концентрация полигекса-метиленгуанидина гидрохлорида, не повреждающая монослойную культуру фибробластов куриного эмбриона и защищающая клетки от проникновения герпесвируса ринопневмонии лошадей. Полученные результаты свидетельствуют о необратимом характере взаимодействия молекул препарата с липидным бислоем и плазматическими мембранами фибробластов.
Ключевые слова: полигексаметилегуанидина гидрохлорид, фосфолипидные мембраны, фиброблас-ты, герпесвирус.
INFLUENCE OF POLYHEXAMETHYLENEGUANIDINE HYDROCHLORIDE ON THE CHICKEN EMBRYOS FIBROBLASTS PLASMATIC MEMBRANE AND ARTIFICIAL BYLAYER LIPID MEMBRANE
A. V. Lysytsya1 P. Y. Kryvoshya1 O. Ya. Shatursky2
1Epizootology Institute of Ukrainian Academy of the Agrarian Sciences, Rivne
Е-mail: [email protected]
2Palladin Institute of Biochemistry, Ukrainian National Academy of Sciences, Kyiv
Е-mail: о[email protected]
Results influence of different polyhexame-thyleneguanidine hydrochloride concentrations influence on ion conductivity through a double layer phospholipid membrane used as a model of microorganism native membrane are given. The polyhexamethyleneguanidine hydrochloride effect on a bilayer membrane was specific with a threshold esteblished to be 0.2 mg/l. The nondamaging polyhexamethyleneguanidine hydrochloride concentration that protects from contracting horse retinopneumoniae herpesvirus has also been found for monolayer fibroblast culture of chicken embryo. The results obtained prove irreversible character of polyhexamethyleneguani-dine hydrochloride binding to a lipid bilayer and fibroblast cells plasma membranes.
Key words: polyhexamethyleneguanidine hydrochloride, phospholipid membrane, fibroblasts, herpesvirus.
