CC BY
54
ОНКОЛОГИЯ
УДК 616-006;444
А. Г. Васильев, Н. В. Хайцев, А. П. Трашков, М. А. Реутин
влияние пола животного и количества трансплантируемых опухолевых клеток на развитие лимфосаркомы плисса
Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия
Всеобщая распространенность онкологических заболеваний, их медицинская, социальная и экономическая значимость делают проблемы изучения механизмов онкогенеза и терапии злокачественных опухолей одними из ключевых в современном здравоохранении. Так, в Российской Федерации, по данным ГУН НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова (г. Санкт-Петербург), ежегодно впервые диагностируются злокачественные опухоли приблизительно у 470 тыс. человек, при этом отмечается неуклонный рост данного показателя во всех возрастных группах у мужчин и у женщин [1]. Значительную долю составляют лимфопролиферативные болезни, в том числе лимфомы различных типов, степени злокачественности и устойчивости к противоопухолевой терапии [2-4].
При этом по некоторым неопластическим заболеваниям наблюдаются выраженные половые различия [5]. Так, показатели онкозаболеваемости по органам системы пищеварения у женского населения значительно ниже по сравнению с мужским (27,7 и 34,0 % соответственно). Аналогичная картина имеет место при исследовании дыхательной системы, где заболеваемость мужчин приблизительно в 6 раз превышает заболеваемость женщин [1, 6]. Почечно-клеточный рак, онкопатология верхних мочевыводящих путей и мочевого пузыря в 2-3 раза чаще встречается у мужчин [7-10]. В то же время по целому ряду нозологических единиц (рак желудка, прямой кишки, миеломная болезнь и др.) половых различий практически не отмечается [1, 6, 11]. Таким образом, изучение влияния пола на развитие опухолей весьма своевременно.
Невозможность проведения экспериментов на человеке делает актуальными вопросы моделирования злокачественных опухолей на лабораторных животных. Широкий спектр применяемых моделей онкогенеза позволяет изучить данные заболевания с различных сторон, выявить общие закономерности для человека и животных и создать теоретическое обоснование для разработки методов терапии опухолей [12-15]. Из них одной из наиболее часто используемых моделей являются перевиваемые опухоли, в том числе и опухоли лимфом [16-18].
Непосредственным объектом наших исследований является лимфосаркома Плисса (ЛФС), искусственно индуцированная в 1958 г. при содержании подопытной крысы-самки
© А. Г. Васильев, Н. В. Хайцев, А. П. Трашков, М. А. Реутин, 2009
на диете с 3,3-дихлорбензидином, в рамках проекта изучения канцерогенной активности данного вещества, проводимого в НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова [19]. Настоящая лимфосаркома явилась первым созданным клоном перевиваемых крысиных лимфом в нашей стране, изучение которого продолжается более полувека и не закончено по сегодняшний день [16, 20-22]. Гомогенат опухоли для поддержания клона трансплантируется в подкожную клетчатку крысам-самцам в дозе 0,5 см3 взвеси опухолевых клеток. При трансплантации опухолевого материала в указанной дозе доля заболевших животных («прививаемость») равна 75-100 %. Лимфосаркома характеризуется прогрессивным ростом с тенденцией к инвазии в окружающие ткани, прорастанием забрюшин-ной клетчатки, гематогенным метастазированием и некротизацией [19]. В ходе наших исследований были выявлены метастазы также в подмышечные и паховые лимфатические узлы животного [20].
Гистологическое изучение ЛФС определило наличие скоплений опухолевых клеток в печени и селезенке. Установлено, что трансплантация гомогената печени животного — опухоленосителя также способна вызвать рост лимфосаркомы. Показано, что опухоль состоит из лимфоидных клеток различной величины, округлой или неправильной формы; выявлено большое количество митозов. При анализе гемограмм у животных с ЛФС установлен незначительный сдвиг лейкоцитарной формулы влево и увеличение количества эритробластов. Первоначально в 1960-х гг. были созданы асцитная и тканевая формы лимфосаркомы [19]. Г. Б. Плисс отметил, что в ряду перевивок опухоли ее асцитная форма была постепенно утрачена по необъяснимым причинам.
В литературе содержатся противоречивые данные о необходимом количестве клеток, вызывающих рост ЛФС. Обычно используются высокие дозы, заведомо вызывающие рост опухоли у 100 % животных, вместе с тем 100 %-ная прививаемость опухоли не позволяет точно оценить степень влияния на нее тех или иных факторов. Кроме того, не изучено воздействие пола животного на развитие ЛФС и возможность ее прививаемости. Эти проблемы определили главную цель нашей работы: исследовать влияние количества перевиваемого материала и пола на развитие ЛФС.
Материалы и методы исследования. В настоящее исследование включено 511 белых нелинейных крыс, из них 271 самец и 240 самок, разведения ГП «Рапполово», средня масса тела 165-185 г. Для поддержания клона опухоли и предварительного определения необходимых доз трансплантируемого материала ЛФС использовались еще 234 животных разного возраста и пола.
Полученный в НИИ онкологии им. проф. Н. Н. Петрова (г. Санкт-Петербург) клон ЛФС успешно поддерживается на экспериментальной базе кафедры патологической физиологии СПбГПМА с осени 2006 г. путем еженедельной трансплантации животным опухолевого материала подкожно на боковой поверхности туловища в дозе 0,2 мл гомо-гената ткани опухоли в 0,2 мл физиологического раствора, полученного от живых доноров. Питание и содержание крыс осуществляется в соответствии с нормами «Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию экспериментальнобиологических клиник», утвержденных приказом МЗ СССР № 1179 от 10 октября 1983 г. Экспериментальная работа проводилась в соответствии с морально-этическими требованиями [23, 24].
Материал отбирался после декапитации крысы под эфирным наркозом на 14—21-е сутки от момента перевивки. При указанном объеме перевиваемого материала опухоль возникает в 100 % случаев вне зависимости от возраста, пола и массы тела животного.
Средняя продолжительность жизни крысы после трансплантации ЛФС в указанной дозе составляет 17,3 ± 3,97 дня (n = 181).
В основной серии опытов для создания воспроизводимой модели развития ЛФС, выявления дозозависимости опухоли и влияния на нее половых факторов проведены следующие исследования. ткань опухоли смешивали с физиологическим раствором, осторожно гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе и производили подсчет опухолевых клеток в единице объема в камере Горяева. Полученная взвесь, содержащая 2200, 1100, 550, 225, 150 клеток в 0,1 мл, вводили крысам-самкам, разделенным на пять групп по 41-53 экземпляра в каждой, в подкожную клетчатку правого бока в объеме 0,1 мл. Пяти группам крыс-самцов по 51-58 животных в каждой трансплантация производилась аналогичным образом в дозах 1100, 550, 225, 150, 75 клеток. При введении опухолевых клеток в дозе, превышающей 2200 у самок и 1100 у самцов, регистрируемые показатели статистически не отличаются от данных при трансплантации более высоких доз, используемых для поддержания штамма ЛФС.
Наблюдение за развитием лимфосаркомы ведется по следующим критериям:
1) количество в группе животных, у которых сформировался опухолевый узел (срок наблюдения — 45 дней после перевивки);
2) время появления пальпируемого опухолевого узла;
3) динамика роста узла;
4) сроки гибели подопытных животных.
Статистическая обработка полученных результатов проводится с помощью пакета программ статистической обработки данных SPSS for Windows 13,0. Данные представлены в виде М ± SD (среднее арифметическое ± среднее квадратическое отклонение). Статистически значимым уровнем считалир < 0,05.
результаты исследования. При трансплантации различных доз опухолевого материала отмечаются следующие показатели прививаемости ЛФС: у самцов в группе, получившей 1100 клеток, — 95 %, 550 клеток — 84 %, 225 клеток — 27 %, 150 клеток — 10 %; у самок—2200 клеток—94 %, 1100 клеток—88 %, 550 клеток—68 %, 225 клеток—25 % (табл. 1). Результат трансплантации у самцов и самок коррелировал с количеством введенных опухолевых клеток (rA = 0,21 ; р < 0,05 и rA = 0,20;р < 0,05, соответственно).
Таблица 1
доля животных, у которых сформировался первичный узел ЛфС*
№ Доза, клетки Доля случаев успешной трансплантации — M ± SD (n)
Самцы Самки
1 2
1 2200 - 0,94 ± 0,037 (50)
2 1100 0,95 ± 0,033 (55) 0,88 ± 0,075 (47)
3 550 0,84 ± 0,049 (51) 0,68 ± 0,057 (53)
4 225 0,27 ± 0,100 (58) 0,25 ± 0,110 (49)
5 150 0,10 ± 0,069 (52) ^ 0,00 (41)
б 75 ^ 0,00 (55) -
*Здесь и далее результаты различаются между собой на уровне значимости р < 0,05, в иных случаях указывается дополнительно. 1,4-2,4 — р > 0,05.
Обнаружены статистически значимые различия случаев возникновения ЛФС при снижении дозы вводимой опухолевой суспензии у самцов и самок как внутри групп, выделенных по половому признаку, так и между собой.
Определена оптимальная доза, необходимая для проведения работ по исследованию роли тех или иных факторов, воздействующих на опухолевый рост, находящаяся в интервале 550-225 клеток ЛФС в 0,1 мл суспензии для самцов и самок. Установлено, что трансплантация крысам ЛФС в объеме 75 кл/0,1 мл (самцы) и 150 кл/0,1 мл (самки) не вызывает роста опухоли (п равно 55 и 41 соответственно).
В группах самцов и самок по мере снижения дозы трансплантируемого опухолевого материала закономерно увеличивалось время, предшествующее появлению первичного опухолевого узла от момента перевивки. Так, у самцов в группе, получившей 1100 клеток, оно составило 16,9 ± 1,90 сут, 550 клеток — 19,2 ± 0,57 сут; у самок, получивших 2200 клеток, — 14,2 ± 0,96 сут, 1100 клеток — 16,7 ± 0,82 сут, 550 клеток — 18,9 ± 1,06 сут (табл. 2).
Таблица 2
Время появления первичного пальпируемого опухолевого узла после перевивки ЛфС, сут
№ Доза, клетки Время — М ± SD (п)
Самцы Самки
1 2
1 2200 - 14,2 ± 0,96 (49)
2 1100 16,9 ± 1,90 (54) 16,7 ± 0,82 (43)
3 550 19,2 ± 0,57 (44) 18,9 ± 1,06 (37)
4 225 22,4 ± 2,62 (15) 22,5 ± 3,42 (11)
Примечание. 1,3-1,4 — р > 0,05; 2,3-2,4 — р > 0,05; 1,2-2,2; 1,3-2,3; 1,4-2,4 — р > 0,05.
Наибольшее значение интервала времени выявления узла ЛФС было установлено в группах, получивших наименьшие вызывающие рост опухоли дозы. Для самцов интервал составил 27 сут (доза 150 кл/0,1 мл), для самок — 33 сут (доза 225 кл/0,1 мл).
При снижении количества вводимых опухолевых клеток имели место тенденции к увеличению продолжительности жизни животных после трансплантации (табл. 3).
Таблица 3
длительность жизни животного после трансплантации клеток ЛфС в зависимости от дозы, сут
№ Доза, клетки Длительность — М ± SD (п)
Самцы Самки
1 2
1 2200 - 27,8 ± 5,72 (49)
2 1100 28,3 ± 4,54 (54) 30,1 ± 5,00 (43)
3 550 31,4 ± 4,59 (44) 31,1 ± 5,67 (37)
4 225 33,6 ± 4,33 (15) 34,9 ± 5,93 (11)
Примечание. 1,2-1,3; 1,3-1,4 — р > 0,05; 2,1-2,2; 2,2-2,3; 2,3-2,4 — р > 0,05; 1,2-2,2; 1,3-2,3; 1,4-2,4 — р > 0,05.
ЛФС обладает прогрессивным ростом (табл. 4), при этом объем опухоли в большинстве групп самцов и самок по мере развития ЛФС статистически не различается. Отличия отмечены между самцами (1100 и 550 кл/0,1 мл соответственно) на поздних сроках роста опухоли (после 13-го дня).
Таблица 4
Динамика роста ЛФС (М ± SD)
№ Сроки роста, сут Объем ЛФС — самцы, см3 Объем ЛФС — самки, см3
1100 550 225 2200 1100 550 225
1 2 3 1 2 3 4
1 1 0,5 ± 0,46 0,5 ± 0,30 0,8 ± 0,41 0,5 ± 0,34 0,5 ± 0,27 0,8 ± 0,61 1,0 ± 0,68
2 5 21,0 ± 6,78 33,5 ± 7,14 31,0±12,08 24,7 ±6,14 31,5±10,46 44,2±5,11 38,2±18,66
3 9 52,9±10,13 71,2 ± 9,56 73,1±12,55 43,4±11,26 60,4 ± 9,62 65,2 ± 6,76 70,0 ± 9,28
4 13 85,4 ± 9,36 123,5 ± 8,73 - 63,7 ± 9,09 66,3 ± 8,21 - -
5 15 90,9 ± 9,20 135,6 ± 8,53 - 72,4 ± 9,00 - - -
Примечание. Самцы: 1,4-1,5 — р > 0,05; 2,4-2,5 — р > 0,05; самки: 1,4-1,5 —р > 0,05; 2,3-2,4 — р > 0,05. При сравнении групп между собой нулевая гипотеза не может быть отвергнута на уровне значимости р > 0,05 за исключением: самцы 1,4-2,4; 1,5-2,5 — р < 0,05.
Вместе с тем, статистически значимых половых различий по показателям «время появления пальпируемого опухолевого узла», «сроки гибели подопытных животных» и «динамика роста узла» при введении одинаковых доз ЛФС установить не удалось.
Обсуждение. При трансплантации различных количеств опухолевых клеток выявлены тенденции изменения характеристик прививаемости и параметров роста ЛФС как в зависимости от дозы перевиваемого материала, так и по половому признаку.
При введении крайне низких (в десятки раз ниже обычных), ранее не использовавшихся (по данным литературы) доз материала ЛФС получен рост почти в 100 % случаев. Дальнейшее разведение суспензии клеток для введения в дозе 550 (225) кл/животное вызывает развитие лимфосаркомы в 84 ± 4,9 % (27 ± 10,0 %) у самцов и 68 ± 5,7 % (25 ± 11,0 %) у самок, что позволяет создать удобную модель для получения статистически значимых результатов при изучении эффектов различных факторов на ЛФС, что крайне затруднено при 100 % развитии опухоли.
При трансплантации клеток ЛФС в дозе 550/животное наблюдаются впервые выявленные половые различия в прививаемости опухолевого материала. У самцов на 15 % чаще трансплантация оказывается успешной по сравнению с самками (р < 0,05). Данный факт, на наш взгляд, можно объяснить участием женских половых гормонов. Эстрогены обладают свойством стимулировать иммунную систему и за счет этого повышать противоопухолевый иммунитет, в противоположность андрогенам — гормонам скорее иммуносупрессивного действия.
Введение минимальных доз, все еще вызывающих прививаемость опухоли, обусловливает отсроченный на 4-5 недель рост ЛФС. Это характеризует высокую злокачественность опухолевого клона, клетки которого даже в минимальном количестве способны преодолевать противоопухолевую защиту организма животного. Показано, что значение
этой дозы у самцов ниже, чем у самок, в два раза (75 кл/0,1 мл и 150 кл/0,1 мл соответственно), что также указывает на большую резистентность женских особей.
Уменьшение количества вводимых клеток ЛФС вызывает увеличение длительности временного интервала, предшествующего регистрации опухолевого узла и в группах самцов, и в группах самок. Это представляется закономерным ввиду необходимости преодоления противоопухолевых барьеров меньшему числу клеток лимфосаркомы. При этом различий между самцами и самками не отмечено.
При анализе данных по длительности жизни крыс после трансплантации ЛФС и динамике роста опухоли установлено, что эти показатели в большинстве случаев статистически не различаются ни в зависимости от дозы прививаемого материала, ни по половому признаку.
Таким образом, нам представляется вероятным, что ЛФС, преодолев противоопухолевую защиту организма, развивается только согласно характеристикам клона опухоли с незначительными изменениями, вызванными индивидуальными особенностями животных. При этом половых различий не отмечено.
Однако и по длительности жизни крыс после трансплантации, и по динамике роста ЛФС выявлена тенденция к более интенсивному развитию опухоли при снижении дозы вводимого материала и в группах самцов (рис. 1), и в группах самок (рис. 2). Это позволило установить статистически значимую разницу в развитии лимфосаркомы у самцов на поздних (> 13 сут) сроках наблюдения между группами, получившими по 1100 и 550 клеток соответственно.
Возможно, меньшие, но превышающие пороговую, дозы трансплантируемого опухолевого материала вызывают качественно иные, менее выгодные, варианты иммунного ответа, приводящие в дальнейшем к более ускоренной динамике роста ЛФС, чем большие дозы, обусловливающие интенсивный иммунный ответ, соответственно ослабляющий и замедляющий опухолевый рост.
160,00
140.00
120.00 100,00
80,00
60,00
40.00
20.00
0,00
1 3 5 7 9 11 13 15
Сутки
И1100 клеток I 1550 клеток ¥7\ 225 клеток
Рис. 1. Динамика роста ЛФС - самцы (см3)
80,00
70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00 10,00 0,00
1 3 5 7 9 11 13 15
Сутки
12200 клеток ^ 1100 клеток Ц 550 клеток 0225 клеток
Рис. 2. Динамика роста ЛФС - самки (см3)
В заключение можно сделать следующие выводы.
Снижение дозы трансплантируемого опухолевого материала вызывает закономерное уменьшение процента животных, у которых сформировалась ЛФС; увеличение времени, предшествующего появлению первичного опухолевого узла; увеличение продолжительности жизни животных после трансплантации и замедляет динамику роста опухоли. Показано, что успешность трансплантации находится в зависимости от пола животного.
При введении крысам взвеси клеток ЛФС в интервале 550-225 кл/0,1 мл отмечается рост опухоли больше 0, но меньше 100 %, что позволяет рассматривать этот интервал как оптимальный для исследования характеристик роста и развития ЛФС и влияния на них различных факторов. В данном интервале доз установлены статистически значимые половые различия.
Минимальными дозами трансплантируемого опухолевого материала являются 150 кл/0,1 мл для самцов и 225 кл/0,1 мл для самок. У крыс с данной дозой зафиксированы единичные случаи появления пальпируемого узла опухоли на очень поздних сроках (через 4-5 недель после перевивки).
Литература
1. Мерабишвили В. М. Злокачественные новообразования в мире, России, Санкт-Петербурге. СПб., 2007. 424 с.
2. Байков В. В. Морфологическая диагностика плазмоцитарной миеломы по трепанобиопсиям (гистологические и иммуногистохимические критерии) // Арх. патол. 2007. № 2. С. 50-52.
3. Greenlee R. T., Murray T., Bolden S., Wingo P. A. Cancer statistics, 2000 // CA Cancer J. Clin. 2000. Vol. 50. Р. 7-33.
4. PrijckB. De., BaronF., Beguin Y. e. a. Actualites therapeutiques en hematology // Rev. Med. Liege. 2007. Vol. 62. N 5-6. P. 384-390.
5. Ernberg I. Gender Differences in Cancer // Gender Med. 2006. Vol. 3. Suppl. A. P. 35.
6. Мерабишвили В. М. Выживаемость онкологических больных. СПб., 2006. 440 с.
7. Варламов С. А., Дорошенко В. С., Лазарев А. Ф. Ядерный антиген Ki-67 как фактор прогноза при почечно-клеточном раке // Онкоурология. 2008. № 2. С. 22-25.
8. Аль-Шукри А. С., Корнеев И. А., Аль-Шукри С. Х. Изучение прогностической ценности клеток-эффекторов стромы переходноклеточных карцином мочевого пузыря // Там же. 2007. № 4. С. 26-30.
9. Hartmann F. H., Ramp U., Moltzahn F. R. e. a. Long-term outcome of patients with papillary renal cell carcinoma // Eur. Urol. Suppl. 2006. Vol. 5. N 2. Р. 105.
10. Abdel-Latif M., Osman Y., Mosbah A., Shaaban A. Changing histological pattern of bladder carcinoma in Egypt in the last 20 years: shift of squamous to transitional types // Ibid. Р. 227.
11. Обрезан А. Г., Стрельников А. А., Богданов А. Н. и др. Миеломная болезнь: трудности диагностики // Медицина: XXI век. 2007. Т. 7. № 8. С. 54-58.
12. Гельфонд Н. Е., Старкова Е. В., Шуваева О. В., Мичурин И. Е. Элементарный состав опухолевой ткани и сыворотки крови в условиях экспериментального канцерогенеза и его коррекции // Бюл. СО РАМН. 2005. Т. 115. № 1. С. 28-32.
13. Попова Н. А. Модели экспериментальной онкологии // Соросовский образоват. журн. 2000. Т. 8. № 6. С. 33-38.
14. Ручковский Б. С. Роль отечественных ученых в развитии экспериментальной онкологии. Киев, 1953. 266 с.
15. KociokN., UnfriedK., RollerM., Dehnen W. DNA fingerprint analysis reveals differences in mutational patterns in experimentally induced rat tumors, depending on the type of environmental mutagen // Cancer Genet. Cytogenet. 1999. Vol. 111. Р. 71-76.
16. Дубина М. В. Паранеопластические изменения взаимодействия лейкоцитов и эндотелия микрососудов // Патофизиология микроциркуляции и системы гемостаза / Под ред. Н. Н. Петрищева. СПб., 1998. С. 120-140.
17. Несина И. П., Завелевич М. П., Фильченков А. А. и др. Цитогенетические изменения в клетках перевиваемой линии Namalwa злокачественной лимфомы человека, индуцированные ингибиторами репликации и синтеза ДНК // Цитология и генетика. 2003. Т. 37. № 4. С. 3-9.
18. Утешев Б. С., Максимова Г. Ф., Носова Т. А., Березина Т. А. Изменение иммунодепрессивного действия некоторых цитостатиков у мышей с лимфомой 1210 // Повреждение и регуляторные процессы организма: Тез. докл. III всес. съезда патофизиологов. Тбилиси. 1982. 16-19 ноября. Тбилиси, 1982. С. 329.
19. ПлиссГ. Б. Онкологическая характеристика нового штамма лимфосаркомы крысы // Бюл. экспер. биол. и мед. 1961. № 2. С. 95-99.
20. ТрашковА. П., Федоров В. С. Исследование зависимости перевиваемости крысиной лимфосаркомы Плисса от прививаемой дозы // Актуальные проблемы патофизиологии / Под ред. Н. А. Гавришевой, В. И. Николаева. СПб., 2007. С. 126-128.
21. Васильев Г. А., Хайцев Н. В., Лапунова С. В., Васильев А. Г. Влияние стрессорных гипоксических воздействий разной природы на напряжение кислорода в перевиваемой крысиной лимфосаркоме // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: Матер. всерос. конф. М., 1997. С. 19-20.
22. Гулиева С. А., Оруджли Р. Н., Кулиева З. М. и др. Характеристика показателей ферментативной активности, гемостаза и микроэлементов в динамике развития злокачественной опухолевой болезни в эксперименте // Повреждение и регуляторные процессы организма: Тез. докл. III всес. съезда патофизиологов. Тбилиси. 1982. 16-19 ноября. Тбилиси, 1982. С. 308-309.
23. Лаврова В. С., Козлов Ю. А. Влияние роста перевиваемых опухолей и аллоксанового диабета на содержание циклических нуклеотидов в лимфоидных органах крыс // Там же. С. 317.
24. Матюшин А. И., Осняч В. С., Павлова Т. Н. Деонтология медико-биологического эксперимента. М., 1987.
25. Report of the AVMA Panel on Euthanasia // JAVMA. 2001.Vol. 218. № 5. March 1.
Статья принята к печати 18 февраля 2009 г.
