CC BY
0
https://doi.org/10.17116/molgen20234103135
Влияние плазмидного гена flhB компонента секреции жгутиков на жгутикование и подвижность бактерий рода Azospirillum
© Л.П. ПЕТРОВА, И.В. ВОЛОХИНА, А.В. ШЕЛУДЬКО
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов, ФИЦ «Саратовский научный центр РАН» (ИБФРМ РАН), Саратов, Россия
РЕЗЮМЕ
Цель исследования. Аанализ влияния гена flhB2, кодирующего компонент экспортной системы белок FlhB, обеспечивающий сборку жгутика, локализованного на плазмидах AZOBR_p4 (ген AZ0BR_p410073) у Azospirillum baldaniorum Sp245 и ABSP7_p3 (ген AMK58_26270) у A. brasilense Sp7 на жгутикование и подвижность бактерий рода Azospirillum. Материал и методы. В работе использованы штаммы A. baldaniorum Sp245, его Fla- Laf- мутант Sp245.1063 (Sp245-/7hB?::Omegon-Km) и A. brasilense Sp7. Для получения мутантов по гену flhB2 использовали сайт-направленный мутагенез. Морфология бактерий и их подвижность охарактеризованы с применением электронной и фазово-контрастной микроскопии.
Результаты. Получен мутант Sp245-flhB2::Km штама A. baldaniorum Sp245, у которого в кодирующую последовательность (CDS) гена AZ0BR_p410073 клонирован ген устойчивости к канамицину. В отличие от Fla" Laf" мутанта Sp245-flhB1::0megon-Km с инактивированым хромосомным геном flhB1 (ген AZ0BR_150177) у штамма Sp245-flhB2::Km был сохранен синтез функционирующей полярной флагеллы (Fla), но были нарушены синтез и функционирование латеральных жгутиков (Laf), снижена скорость движения и распространения роящихся клеток в полужидких агаризованных средах. Инактивация плазмидного гена AMK58_26270 у Sp7, гомологичного гену AZ0BR_p410073 (97% идентичности), приводила к аналогичному Laf" фенотипу у соответствующего мутанта.
Заключение. В геноме штаммов Sp245 и Sp7 присутствуют два предполагаемых гена flhB, расположенных в хромосоме (flhB1) и, соответственно штаммам, на плазмидах AZ0BR_p4 или ABSP7_p3 (flhB2). Нами установлено, что экспрессия гена flhB2 необходима для сборки Laf. Транскрипция flhB2 регулируется механосигналом, восприятие и генерация которого обеспечивается функционирующим Fla, очевидно с участием белка FlhB, кодируемого хромосомным геном flhBI.
Ключевые слова: Azospirillum, механосенсинг, смешанное жгутикование. ИНФОРМАЦИЯ ОБ АВТОРАХ:
Петрова Л.П. — https://orcid.org/0000-0002-1593-6157; e-mail: [email protected] Волохина И.В. — https://orcid.org/0000-0002-9088-481X; e-mail: [email protected] Шелудько А.В. — https://orcid.org/0000-0002-2535-5225; e-mail: [email protected] Автор, ответственный за переписку: Петрова Л.П. — e-mail: [email protected]
КАК ЦИТИРОВАТЬ:
Петрова Л.П., Волохина И.В., Шелудько А.В. Влияние плазмидного гена flhB компонента секреции жгутиков на жгутикование и подвижность бактерий рода Azospirillum. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2023;41(3):35—42. https://doi.org/10.17116/molgen20234103135
Effect of the plasmid gene flhB of the flagellar export component on flagellation and motility in Azospirillum bacteria
© l.p. petr0va, i.v. v0l0khina, a.v. sheludk0
Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms, Saratov Scientific Centre of the Russian Academy of Sciences (IBPPM RAS), Saratov, Russia
ABSTRACT
Objective. To analyze the effect of the flhB2 gene, which is located on the AZ0BR_p4 (AZ0BR_p410073 gene) plasmid in Azospirillum baldaniorum Sp245 and on the ABSP7_p3 (AMK58_26270 gene) plasmid in A. brasilense Sp7 and codes for the FlhB protein, a flagellar export component that ensures flagellin assembly, on flagellation and motility in these bacteria. Material and methods. We used A. baldaniorum strain Sp245, its Fla- Laf mutant Sp245.1063 (Sp245-flhB1::0megon-Km), and A. brasilense Sp7. Mutants defective in the flhB2 gene were generated by site-directed mutagenesis. Bacterial morphology and motility were characterized by electron and phase-contrast microscopy.
Results. An A. baldaniorum Sp245 mutant, Sp245-flhB2::Km, was generated that had a cloned kanamycin resistance gene in the coding sequence (CDS) AZ0BR_p410073. In contrast to the Fla" Laf" mutant Sp245-flhB1::0megon-Km, whose flhBI chromosomal gene is inactivated (AZ0BR_150177 gene), strain Sp245-flhB2::Km strain retained the synthesis of a functioning polar flagellum (Fla), but the synthesis and functioning of lateral flagella (Laf) was impaired and the movement and spreading rates of swarming cells in semiliquid agarized media were decreased. Inactivation of the AMK58_26270 plasmid gene in Sp7, which is homologous to the AZ0BR_p410073 gene (97% identity), resulted in a similar Laf" phenotype in the corresponding mutant. Conclusion. Two putative flhB genes are present in the genome of strains Sp245 and Sp7. These genes are located in the chromosome (flhBI) and, respectively, on the AZ0BR_p4 or ABSP7_p3 plasmid (flhB2). Expression of the flhB2 gene is required for Laf as-
sembly. Transcription of flhB2 is regulated by a mechanosignal, the perception and generation of which is ensured by the functioning Fla, apparently with the involvement of the FlhB protein, encoded by the flhB1 chromosomal gene.
Keywords: Azospirillum, mechanosensing, mixed flagellation. INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:
Petrova L.P. — https://orcid.org/0000-0002-1593-6157; e-mail: [email protected] Volokhina I.V. — https://orcid.org/0000-0002-9088-481X; e-mail: [email protected] Sheludko A.V. — https://orcid.org/0000-0002-2535-5225; e-mail: [email protected] Corresponding author: Petrova L.P. — e-mail: [email protected]
TO CITE THIS ARTICLE:
Petrova LP, Volokhina IV, Sheludko AV. Effect of the plasmid gene flhB of the flagellar export component on flagellation and motility in Azospirillum bacteria. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya (Molecular Genetics, Microbiology and Virology). 2023;41(3):35-42. (In Russ.). https://doi.org/10.17116/molgen20234103135
Введение
Свободноживущие, способствующие росту растений бактерии рода Azospirillum, используемые в сельскохозяйственных биотехнологиях, обладают выраженной фенотипической пластичностью [1, 2]. Так, некоторые азоспириллы, включая A. baldanio-rum Sp245 (ранее A. brasilense [3]), отвечают на смену механических свойств среды обитания изменениями длины клеток, характера их жгутикования (синтезируют только конститутивный полярный жгутик [Fla] или Fla и индуцибельные латеральные жгутики [Laf], например, при наличии в среде 0,4% и более высоких концентраций агара) и образа жизни (плавание или коллективное роение, образование биопленок) [4—7]. У этих и других микробов ме-ханосенсорные функции могут выполнять жгутики, первыми вступающие в контакт с микроокружением бактерий [4, 7]. Жгутики имеют консервативную структуру и состоят из базального тела, крюка и фи-ламента. Базальное тело выполняет функции якоря жгутика в оболочке клетки, мотора и экспортной машины и включает кольцевые белковые комплексы, стержень и систему секреции III типа [8]. Одним из компонентов системы секреции является белок FlhB, авторасщепление которого необходимо для конформационных изменений в аппарате экспорта и переключения его субстратной специфичности — с тем, чтобы белки стержня и крюка экспортировались до этапа полимеризации белков, образующих сочленение крюка и филамента, и белков-фла-геллинов филамента и белка кэпа [8].
В геноме штамма Sp245 есть два предполагаемых гена flhB, расположенных на хромосоме (flhBl (AZOBR_150177)) и на плазмиде AZOBR_ p4 в кластере предполагаемых генов Laf системы (flhB2 (AZOBR_p410073)) [5, 9]. Предполагаемый белок FlhB2 состоит из 366 аминокислотных остатков и обладает 43% идентичностью и 61% сходством с белком FlhB1. В геноме A. brasilense Sp7 гены AMK58_10035 и AMK58_26270, являющиеся соответственно гомологами AZ0BR_150177 и AZOBR_
p410073 тоже локализованы в хромосоме и плазмиде ABSP7_p3.
Хромосомный ген flhBl необходим для образования и Fla, и Laf. Так, штамм Sp245-fhB1::Omegon-Km имел Fla/Laf" фенотип, а возобновление у компле-ментированных клеток этого мутанта способности к образованию Fla устраняло дефекты биосинтеза Laf [5]. Восстановление структуры Fla у комплемен-танта могло восстановить гипотетический механосен-сорный аппарат, необходимый для индуцибельной сборки нормальных Laf. В то же время, описанное выше влияние приобретения гена flhBl на жгутикование комплементанта мутанта Sp245-flhB1::Omegon-Km может быть связано с участием белка FlhBl в процессах сборки жгутиков двух видов. Анализ подвижности и жгутикования мутантов азоспирилл с инак-тивированным геном flhB2 позволит точнее охарактеризовать функции FlhBl и FlhB2.
Материал и методы
Штаммы бактерий, питательные среды и условия культивирования. Штаммы бактерий, использованные в работе, представлены в табл. 1, прайме-ры для ПЦР — в табл. 2. Бактерии выращивали в ма-латно-солевой среде (МСС [18]) или Luria-Bertani (LB [13]) при 30 °C. При необходимости в среду вносили Бакто агар (20 г/л для плотных сред), канамицин (Km) (30—50 мкг/мл), тетрациклин (Tc) (25 мкг/мл).
Планктонные культуры выращивали в жидких средах при интенсивном покачивании (140 об/мин) на Excella E24 («New Brunswick Scientific», США). Каждые 2 ч измеряли ОП590 бактериальной культуры. Морфологию клеток исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии на Libra 120 («Carl Zeiss», Германия) [5]. Подвижность бактерий оценивали при различных условиях культивирования: через 18 ч инкубации в жидкой среде на качалке (с использованием фазово-контрастной микроскопии); после инокуляции уколом в содержащую 0,4—0,6% Бакто агара среду (МСС) и последующей инкубации в течение 24—96 ч (с измерением диаме-
Таблица 1. Штаммы бактерий, плазмиды, использованные в работе
Штамм, плазмида
Характеристика
Источник
Штамм
Дикий тип, выделен в Бразилии из корней пшеницы [10]
Производный штамма Sp245,содержащий плазмиду pRK415, TcR [5]
Fla~ LaT мутант штамма Sp245 с инсерцией Omegon-Km в ген flhB1 [11] (AZ0BR_150177), KmR
Производный штамма Sp245.1063, содержащий плазмиду pRK415, KmR, TcR [5]
Fla+ Laf производный штамма Sp245.1063, содержащий плазмиду pRK415- [5] 150177, KmR, TcR
LaT мутант штамма Sp245 с инсерцией гена устойчивости к канамицину Данная работа в генflhB2 (AZ0BR_p410073), KmR
Производный штамма Sp245.0001, содержащий плазмиду pRK415, KmR, TcR Данная работа
Laf+ производный штамма Sp245.0001, содержащий плазмиду pRK415-p410073, То же
KmR, TcR
LaT производный штамма Sp245.0001, содержащий плазмиду pRK415-150177, То же
KmR, TcR
Дикий тип, выделен в Бразилии из ризосферы росички лежачей (Digitaria de- [12]
cumbens)
LaT мутант штамма Sp7 с заменой AMK58_26270 (flhB) из ABSP7_p3 на после- Данная работа
довательность AZ0BR_p410073, со вставкой aphAI, KmR supE44 AlacU169 (ф80 lacZ ДМ15) hsdR17recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1, исполь- [13]
зован для поддержания полученных конструкций supEhsdR gal metB; использован для поддержания плазмиды pRK2013 [13]
Плазмида
Плазмида-помощник узкого круга хозяев, repColE1, Tra+, 48 т.п.н., KmR [14]
Производный от RK2 низкокопийный экспрессионный вектор широкого кру- [15]
га хозяев, 10.7 т.п.н., Mob+, TcR pRK415, содержащая 1172-п.н. BamHI фрагмент ДНК Sp245 с 1077-п.н. CDS [5]
AZ0BR_150177 (flhB1) плюс 79 п.н. до и 16 п.н. после этой CDS, TcR pRK415, содержащая 1375-п.н. XbaI—EcoRI фрагмент ДНК Sp245 с 1101- Данная работа
п.н. CDS AZ0BR_p410073 flhB2) плюс 163 п.н. до и 111 п.н. после этой CDS,
TcR
TcR; oriT+ sacB+, gene replacement vector with MCS from pUC18 [16]
pEX18Tc с 1375-п.н. фрагментом ДНК Sp245, содержащим CDS AZ0BR_ Данная работа p410073 со вставкой aphAI, TcR KmR CloneJET PCR Cloning Kit, ThermoScientific, США ThermoScientific
pJET1.2 с 1375-п.н. фрагментом ДНК Sp245, содержащим CDS AZ0BR_ Данная работа
p410073 со вставкой aphAI, KmR ApR KmR, источник Kmr кассеты (aphAI) [17]
Azospirillum baldaniorum Sp245 (IBPPM 219) Sp245(pRK415) Sp245.1063 (IBPPM 521)
Sp245.1063(pRK415) Sp245.1063(pRK415-150177)
Sp245.0001
Sp245.0001(pRK415) Sp245.0001(pRK415-p410073)
Sp245.0001(pRK415-150177)
Azospirillum brasilense: Sp7 (IBPPM 150) Sp7.0001
Escherichia coli DH5a E. coli K802
pRK2013 pRK415
pRK415-150177BB pRK415-p410073XbE
pEX18Tc
pEX18Tc-p410073-SKm
pJET1.2/blunt pJET1.2-p410073-SKm
pUC4K
тра зоны распространения роящихся бактерий в среде). Среднюю скорость движения подвижных клеток определяли с помощью компьютерного анализа видеоизображения способом, описанным в работе [19].
Выделение и очистка ДНК и РНК, манипуляции с ними, ОТ-ПЦР и РВ-ПЦР. Геномную ДНК выделяли из жидких бактериальных культур с использованием набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit («ThermoScientific», США). Для амплификации ДНК использовали готовую смесь экстра-микс для ПЦР HS-Taq PCR («Диаэм», Россия) или высокоточную ДНК полимеразу iProof High-Fidelity DNA Polymerase (Bio-Rad). ПЦР ставили в термоциклере T100 («BioRad Laboratories», США) не менее чем в трех независимых повторностях. Продукты ПЦР визуализировали с помощью электрофореза в геле [13]. Амплико-ны и плазмиды очищали с использованием наборов
GeneJet PCR Purification и GeneJet Plasmid Miniprep Kits («ThermoScientific», США), соответственно. Гидролиз ДНК эндонуклеазами, лигирование ДНК, клонирование рекомбинантных ДНК в клетках E. coli осуществляли общепринятыми методами [13]. Для анализа нуклеотидных последовательностей и подбора праймеров использовали базы данных, представленные на серверах Национального центра биотехнологической информации США (NCBI).
Для выделения РНК бактериальные клетки с агаризованной среды собирали, отмывали 50 мМ фосфатным буфером (ФБ, pH 7) и суспендировали в нем до ОП590=1. РНК выделяли, используя Nu-cleoZOL («Macherey-Nagel», Германия), обрабатывали ДНКазой I («ThermoFS», США). Концентрацию РНК определяли с помощью набора Qubit RNA BR Assay Kits на флуориметре Qubit 4 («ThermoFS»,
Таблица 2. Пары праймеров для ПЦР-амплификации
Название целевого продукта и праймеров „ -
, 5'-3' последовательности прямого (F) и обратного (R) праймеров для его амплификации
AZOBR_p410073 ggtgatgccctctagacccgtctatttcgtt
P410073-XbF CGTGATGCGCCGCGGAATTCGAGGATT
P410073-ER
Km-кассета CATCGGGCTTCCCATACA
Km-F TGCCATTCTCACCGGATT
Km-R
Праймеры для анализа транскрипции генов с использованием ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР), размер амплифицируемого фрагмента
232 п.н. AZOBR_p410056 (lafl) TCTCAAGGTCAACAACGCCA GTCGTTCTGGATCAGCGACT
laf1-rt-F
laf1-rt-R232
217 п.н. AZOBR_p410073 flhB2) GAGTATGACCGCGCCAAGA
flhB2-p4-rt-F GGCGCAGCACATACATCATC
flhB2-p4-rt-R
308 п.н. AZOBR_70032/AZOBR_p1160045 fliC) AGATCAACAGCGCCGAAATG
FliC-chr-rt-F GAAGGTCTGGTCTTCGACG
FliC-chr-rt-R
213 п.н. AZOBR_150177 (flhBl) TCGCGCTGAAATACGACTCC
flhB1-chr-rt-F AGGTAATGACTTCCGCCACC
flhB1-chr-rt-R
302 п.н. rpoD* CGTCACCTATGACGAGCTGA
rpoD-118-rt-F CTCTTCCGATTCGACGATGT
rpoD-118-rt-R Примечание. * — из [20].
США). кДНК синтезировали (ОТ-ПЦР), используя набора MMLV RT kit («Евроген», Россия) с добавлением ингибитора рибонуклеаз Ribolock («Ther-moFS», США). Чистоту РНК проверяли ПЦР на РНК и полученной кДНК с использованием праймеров (табл. 2) для амплификации гена домашнего хозяйства (ген rpoD) [20]. ПЦР в реальном времени (РВ-ПЦР) проводили с использованием набора для ПЦР qPCRmix-HS SYBR+HighROX («Евроген», Россия) на приборе Applied Biosystems 7300 («Applied Biosystems», США) при следующих условиях: 5 мин при 95 °C, затем 40 циклов по 15 с при 95 °C, 30 с при 60 °C и 30 с при 72 °C. В качестве эндогенного контроля использовали ген rpoD [20]. Профили экспрессии генов-мишеней определяли относительно уровня экспрессии rpoD с использованием метода 2-AACT [21].
Получение мутантов. Праймеры для ПЦР-ампли-фикации ДНК Sp245 и плазмиды, использованные в работе, представлены в табл. 1 и 2. Работа по мутагенезу включала клонирование в векторе pJET1.2 ампли-кона, содержащего CDS AZ0BR_p410073 из Sp245. Клонирование осуществляли по SalI сайту AZ0BR_ p410073 гена устойчивости к канамицину из pUC4K (aphAI) в pJET1.2-p410073. Затем p410073-SKm переклонировали в вектор pEX18Tc, неспособный к автономной репликации в клетках азоспирилл. CDS AZ0BR_p410073 (плюс 163 п.н. до и 111 п.н. после CDS) была также наработана в ПЦР на ДНК штамма Sp245 (ампликон 1375 п.н.) и клонирована в экс-прессионном векторе pRK415 под контролем его lac промотора. Для соблюдения правильной ориентации
клонирование проводили по сайтам рестрикции Xbal и EcoRI, которые были заложены в дизайн праймеров. Плазмиды pRK415-p410073 и pEX18Tc-p410073-SKm трансформировали в E. coli DH5a. Введение рекомби-нантной плазмиды pEX18Tc-p410073-SKm в клетки азоспирилл для направленного мутагенеза исследуемых генов или введение в бактерии плазмид pRK415, pRK415-p410073 и pRK415-150177 проводили с помощью трехродительского скрещивания с плазмидой-по-мощником pRK2013, как описано ранее [5]. В случае направленного мутагенеза отбирали устойчивые к канамицину, но чувствительные к тетрациклину клоны азоспирилл (клоны, в которых прошла двойная рекомбинация между плазмидой pEX18Tc-p410073-SKm и целевой ДНК). Для подтверждения вставки гена aphAI в AZ0BR_p410073 использовали прайме-ры к aphAI в парах с праймерами к последовательностям ДНК, прилегающим к AZ0BR_p410073, секве-нирование фрагментов ДНК, прилегающих к aphAI.
Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных проводили с использованием i-критерия Стьюдента (доверительные интервалы даны для 95% уровня значимости) и однофакторного дисперсионного анализа (AN0VA) (при уровне значимости p<0.05). Для статистической обработки использовали пакет программ Microsoft 0ffice Excel 2010.
Результаты
Анализ скорости роста, жгутикования и подвижности бактерий. Получен мутант A. baldaniorum
Таблица 3. Подвижность бактерий в жидкой и полужидкой минимальных синтетических средах (МСС)
Скорость движения клеток (мкм/с) Диаметр (мм) колец роения (коло-
Штамм жидкая МСС МСС + 0,4% Бакто агара ний), сформированных на МСС + 0,4% Бакто агара
Sp245 29,1 + 1,8 а 19,1+1,3 б 19,4+0,6 в
Sp245 (pRK415) 28,0+1,8 а 19,2+1,8 б 18,8+1,3 в
Sp245.1063 н.п. н.п. 5,5+0,8 а
Sp245.1063(pRK415) н.п. н.п. 5,3+0,5 а
Sp245.1063(pRK415-150177) 27,0+1,5 а 18,4+1,4 б 19,4+1,1 в
Sp245.0001 28,7+1,8 а 14,3+0,9 а 10,6+0,5 б
Sp245.0001(pRK415) 27,5+1,6 а 13,7+1,0 а 10,0+0,8 б
Sp245.0001(pRK415-p410073) 28,0+2,0 а 18,7+1,3 б 19,6+0,9 в
Sp245.0001(pRK415-150177) 28,5+1,6 а 13,9+1,1 а 10,5+0,9 б
Sp7 27,9+1,5 А 18,5+1,3 Б 20,7+1,4 Б
Sp7.0001 27,4+1,4 А 14,1 + 1,2 А 8,3+0,7 А
Примечание. Бактерии инкубировали 24 ч в жидкой или 48 ч в полужидкой МСС; диаметр зоны инокуляции бактерий в полужидкой среде составлял 5,1±0,3 мм; н.п. — не перемещаются; приведены средние значения ± доверительные интервалы для 95% уровня значимости; буквами в столбцах обозначены статистически значимые различия (а и А — минимальные значения), выявленные с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ЛМОУЛ; _р<0.05).
Sp245.0001 (Sp245-flhB2::Km), у которого в CDS AZ0BR_p410073 размером 1101 п.н. за 994 п.н. клонирован ген устойчивости к канамицину (aphAI). У Sp245.0001 сохранялся синтез функционирующего Fla, но были нарушены синтез и функционирование Laf (Laf" фенотип), снижены скорость движения и распространения роящихся клеток в полужидких агаризованных средах (рис. 1, табл. 3). Более 80% клеток родительского штамма Sp245 с плотной агаризованной среды имели многочисленные Laf, в случае Sp245.0001 клетки были лишены Laf, и только 20% бактерий несли на своей поверхности редкие или единичные Laf (рис. 1). Введение плазмиды pRK415-p410073 в клетки Sp245.0001 приводило к восстановлению утраченных признаков у ком-плементанта Sp245.0001(pRK415-p410073), что подтверждает влияние AZ0BR_p410073 на исследованые признаки (табл. 3). Плазмиды pRK415 и pRK415-150177 (pRK415, содержащая хромосомный ген flhBI, комплементирующий FlaLaf" фенотип мутанта Sp245-flhBI::0megon-Km (Sp245.1063 [5]), введенные в Sp245.0001, не влияли на жгутикование и роение этих производных мутанта (табл. 3).
Жгутикование и подвижность, характерные для A. baldaniorum Sp245.0001, были аналогичны фенотипу Laf" мутанта A. brasilense Sp7 Sp7.0001 (табл. 3). У Sp7.0001 произведена замена гена flhB AMK58_26270, локализованного в кластере генов биосинтеза Laf плазмиды ABSP7_p3, на последовательность AZ0BR_ p410073, содержащую вставку гена aphAI (fhB2::Km). Гены AMK58_26270 и AZ0BR_p410073 являются гомологами (97% идентичности). Хромосомная копия гена flhB AMK58_10035 (гомолог flhBI Sp245 (AZ0BR_150177)) осталась неизменной у Sp7.0001.
Анализ транскрипции генов flhB и генов fliC и lafl, кодирующих соответственно флагеллины Fla и Laf. В клетках Laf- мутанта Sp245.0001 (fhB2::Km) транс-
крипция lafl была снижена, а в случае fliC (гены AZOBR_70032/AZOBR_p1160045) и flhBl сохранялась на уровне Sp245 (рис. 2). Продукты трансляции хромосомной CDS AZOBR_70032 и CDS AZOBR_p1160045, локализованной на плазми-де AZOBR_p1, были обнаружены в протеоме клеток штамма Sp245, выращенных в жидкой минимальной среде при интенсивной аэрации или в микроаэробных условиях [22]. Поскольку в жидкостях A. baldaniorum продуцируют только Fla, белки, кодируемые AZOBR_70032 и AZOBR_p1160045, по-видимому, образуют филамент Fla [22]. В клетках Fla-Laf- fhB1::Omegon-Km мутанта Sp245.1063 мы наблюдали низкий уровень транскрипции генов fliC, flhB2 и lafl (рис.2).
Обсуждение
Процесс сборки жгутиков предполагает последовательную и своевременную экспрессию генов флагеллярных компонентов [8, 23—25]. Низкий уровень транскрипции flhB2 у Sp245.1063 или отсутствие FlhB2 у Sp245.0001 очевидно влияют на экспрессию генов, белковые продукты которых необходимы для сборки органеллы позже, что согласуется с низким уровень транскрипции lafl и Laf- фенотипом мутантов.
Таким образом, инактивация гена flhB2, локализованного на плазмидах AZOBR_p4 у Sp245 и ABSP7_ p3 у Sp7, приводила к дефектам в сборке многочисленных Laf, снижению скорости движения роящихся бактерий и не оказывала влияния на синтез и функционирование Fla.
Анализ полученных результатов дает основание предположить, что FlhB1, обладающий 43% идентичности и 61% сходства с FlhB2, может участвовать в процессах сборки жгутиков двух видов, посколь-
Рис. 1. Просвечивающая электронная микроскопия клеток A. brasilense Sp245 (А), Sp245.1063 (Б), Sp245.0001 (В).
Бактерии выращивали при 30 °C в жидкой МСС 18 ч (1) или на агаризованной МСС 42 ч (2). У Sp245 86% клеток с плотной агаризо-ванной среды имели многочисленные Laf (А2), в случае Sp245.0001 клетки были лишены Laf и только 20% клеток, несли на своей поверхности редкие или единичные Laf (В2). Масштабная линейка соответствует 1 мкм.
ку у 20% клеток Sp245.0001 кроме Fla присутствовали единичные Laf. Однако 80% бактерий этого мутанта были лишены Laf. Мы наблюдали, что экс-
прессия flhBl у Sp245.0001 и родительского штамма не отличались, оба штамма синтезировали Fla и, вероятно, из-за отсутствия «достаточного» количества
Рис. 2. Результаты анализа транскрипции flhBI (AZOBR_150177 (панель А)), fliC (AZOBR_70032/AZOBR_p1160045 (панель В)), flhB2 (AZOBR_p410073 (панель Б)) и laf1 (AZOBR_p410056 (панель Г)) в клетках A. baldaniorum.
Относительный уровень транскрипции (ОУТ) — отношение результатов ПЦР в реальном времени с кДНК исследуемых генов штаммов Sp245.1063 и Sp245.0001 к аналогичным результатам Sp245. * — сигнал отсутствовал.
FlhBI, используемого для синтеза Fla, клетки Sp245-flhB2::Km мутанта были не способны к сборке многочисленных Laf. В то же время приобретение штаммом Sp245.0001 дополнительной копии flhBI в составе pRK415-150177 не приводило к восстановлению у Sp245.0001(pRK415-150177) фенотипа, характерного для Sp245 (Fla+Laf+), в отличие от комплементан-та Sp245.1063(pRK415-150177), являющегося производным Fla~Lar мутанта Sp245-flhB1::Omegon-Km (см. табл. 3 и [5]). В последнем случае возобновление синтеза Fla, выполняющего механосенсорные функции [4, 7], у комплементанта Sp245.1063, содержащего pRK415-150177, способствовало восстановлению процессов механосенсинга и механотрансдукции, индуцирующих транскрипцию генов биогенеза Laf.
Таким образом, наличие единичных Laf у 20% клеток Sp245.0001 является результатом случайных событий, не зависящих от и экспрессии гена flhBI.
Заключение
В геноме штаммов Sp245 и Sp7 присутствуют два предполагаемых гена flhB, расположенных в хромосоме (flhBI) и, соответственно штаммам, на плазми-дах AZOBR_p4 или ABSP7_p3 (flhBI). Нами установлено, что экспрессия гена flhB2 необходима для сборки Laf. Транскрипция flhB2 регулируется механосигна-лом, восприятие и генерация которого обеспечивается функционирующим Fla, очевидно с участием белка FlhB, кодируемого хромосомным геном flhBI.
Благодарность. Авторы выражают признательность Центру коллективного пользования научным оборудованием в области физико-химической биологии и нанобиотехнологии «Симбиоз» ИБФРМ РАН (Саратов, Россия) за допуск к работе на приборах Leica DM6000 B и Libra 120.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Fukami J, Cerezini P, Hungria M. Azospirillum: benefits that go far beyond biological nitrogen fixation. AMBExpr. 2018;8:73. https://doi.org/10.1186/s13568-018-0608-1
2. Hendriksen NB. Microbial biostimulants — the need for clarification in EU regulation. Trends in Microbiol. 2022;30(4):311-313. https://doi.org/10.1016/j.tim.2022.01.008
3. Dos Santos Ferreira N, Sant'Anna FH, Reis VM, Ambrosini A, Volpiano CG, Rothballer M, et al. Genome-based reclassification of Azospirillum brasilense Sp245 as the type strain of Azospirillum baldaniorum sp. nov. Microbiol Society. 2020;70:6203-6212. https://doi.org/10.1099/ijsem.0.004517
4. Moens S, Schloter M, Vanderleyden J. Expression of the structural gene, laf1, encoding the flagellin of the lateral flagella in Azospirillum brasilense Sp7. J Bacteriol. 1996;178(16):5017-5019. https://doi.org/10.1128/jb.178.16.5017-5019.1996
5. Filip'echeva Yu, Shelud'ko A, Prilipov A, Telesheva E, Mokeev D, Burov A, et al. Chromosomal flhBI gene of the alphaproteobacterium Azospirillum brasilense Sp245 is essential for correct assembly of both constitutive polar flagellum and inducible lateral flagella. Folia Microbiol. 2018;63(2):147-153. https://doi.org/10.1007/s12223-017-0543-6
6. Petrova LP, Yevstigneyeva SS, Borisov IV, Shelud'ko AV, Burygin GL, Kat-sy EI. Plasmid gene AZ0BR_p60126 impacts biosynthesis of lipopolysac-charide II and swarming motility in Azospirillum brasilense Sp245. J Basic Microbiol. 2020;60:613-623. https://doi.org/10.1002/jobm.201900635
7. Ganusova EE, Vo LT, Mukherjee T, Alexandre G. Multiple CheY Proteins Control Surface-Associated Lifestyles of Azospirillum brasilense. Front Mi-crobiol. 2021;12:664826. https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.664826
8. Остерман И.А., Дихтяр Ю.Ю., Богданов А.А., Донцова О.А., Сергиев П.В. Регуляция экспрессии генов бактериальной флагеллы. Биохимия. 2015;80(11):1662-1672.
Osterman IA, Dikhtyar YY, Bogdanov AA, Dontsova PV. Regulation of flagellar gene expression in Bacteria. Biochemistry Moscow. 2015;80:1447-1456. (In Russ.).
https://doi.org/10.1134/S000629791511005X
9. Dubey AP, Pandey P, Singh VS, Mishra MN, Singh S, Mishra R, Tripathi AK. An ECF41 family a factor controls motility and biogenesis of lateral flagella in Azospirillum brasilense Sp245. J Bacteriol. 2020;202(16):e00231-20. https://doi.org/10.1128/JB.00231-20
10. Baldani VLD, Baldani JI, Döbereiner J. Effects of Azospirillum inoculation on root infection and nitrogen incorporation in wheat. Can J Microbi-ol. 1983;29(8):924-929.
https://doi.org/10.1139/m83-148
11. Ковтунов Е.А., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Кацы Е.И. Инсерцион-ный мутагенез хромосомной копии гена flhB сопровождается дефектами в образовании полярного и латерального жгутиков у бактерий Azospirillum brasilense Sp245. Генетика. 2013;49(8):1013-1016.
Kovtunov EA, Petrova LP, Shelud'ko AV, Katsy EI. Transposon insertion into a chromosomal copy of flhB gene is concurrent with defects in the formation of polar and lateral flagella in bacterium Azospirillum brasilense Sp245. Russ J Genet. 2013;49:881-884. (In Russ.). https://doi.org/10.1134/S1022795413080061
В ходе исследования эксперименты на людях или животных не проводились.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
12. Tarrand JX, Krieg NE, Döbereiner J. A taxonomic study of the Spirillum li-poferum group, with descriptions of a new genus, Azospirillum gen. nov. and two species, Azospirillum lipoferum (Beijerinck) comb. nov. and Azospirillum brasilense sp. nov. Can J Microbiol. 1978;24:967-980. https://doi.org/10.1139/m78-160
13. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T, eds. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989.
14. Figurski DH, Helinski DR. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proc Natl AcadSci USA. 1979;76(4):1648-1652. https://doi.org/10.1073/pnas.76.4.1648
15. Keen NT, Tamaki S, Kobayashi D, Trollinger D. Improved broad-host-range plasmids for DNA cloning in Gram-negative bacteria. Gene. 1988;70(1):191-197. https://doi.org/10.1016/0378-1119(88)90117-5
16. Hoang TT, Karkhoff-Schweizer RR, Kutchma AJ, Schweizer HP. A broad-host-range Flp-FRT recombination system for site-specific excision of chro-mosomally-located DNA sequences: application for isolation of unmarked Pseudomonas aeruginosa mutants. Gene. 1998;212(1):77-86. https://doi.org/10.1016/S0378-1119(98)00130-9
17. Vieira J, Messing J. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene. 1982;19(3):259-268.
https://doi.org/10.1016/0378-1119(82)90015-4
18. Döbereiner J, Day JM. Associative symbiosis in tropical grass: Characterization of microorganisms and dinitrogen fixing sites. In: Newton W.E., Ny-man C.J., eds. Proceedings of the 1st International Symposium on Nitrogen Fixation. Pullman: Washington State University Press; 1976;518-538.
19. Schelud'ko AV, Makrushin KV, Tugarova AV, Krestinenko VA, Panasenko VI, Antonyuk LP, Katsy EI. Changes in motility of the rhizobacterium Azospirillum brasilense in the presence of plant lectins. Microbiol Res. 2009;164(2):149-156. https://doi.org/10.1016/j.micres.2006.11.008
20. Kumar S, Rai AK, Mishra MN, Shukla M, Singh PK, Tripathi AK. RpoH2 sigma factor controls the photooxidative stress response in a non-photosynthetic rhizobacterium, Azospirillum brasilense Sp7. Microbiology. 2012;158:2891-2902. https://doi.org/10.1099/mic.0.062380-0
21. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):402-408. https://doi.org/10.1006/meth.2001.1262
22. Wisniewski-Dye' F, Borziak K, Khalsa-Moyers G, Alexandre G, Sukhar-nikov L, Wuichet K, et al. Azospirillum genomes reveal transition of bacteria from aquatic to terrestrial environments. PLoS Genet. 2011;7(12):e1002430. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002430
23. Brutinel ED, Yahr TL. Control of gene expression by type III secretory activity. Curr Opin Microbiol. 2008;11(2):128-133. https://doi.org/10.1016/j.mib.2008.02.010
24. Chevance FFV, Hughes KT. Coordinating assembly of a bacterial macromo-lecular machine. Nat Rev Microbiol. 2008;6:455-465. https://doi.org/10.1038/nrmicro1887
25. Smith TG, Hoover TR. Deciphering bacterial flagellar gene regulatory networks in the genomic era. Adv Appl Microbiol. 2009;67:257-295. https://doi.org/10.1016/S0065-2164(08)01008-3
Поступила в редакцию 16.02.2023
После доработки 31.03.2023
Принята к публикации 04.04.2023
