CC BY
73
УДК 579.66:663.18
А. С. Дерунец*, В. Д. Грошева, А. В. Белодед, М. Г. Гордиенко
Российский химико-технологический университет им. Д.И. Менделеева, Москва, Россия, 125047, Москва, Миусская площадь, дом 9
* e-mail: [email protected]
ВЛИЯНИЕ ОКСИДАТИВНОГО СТРЕССА НА ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
Исследовалось влияние оксидативного стресса на физиолого-биохимические особенности молочнокислых бактерий Lactobacillus casei. Определена LD5o Н2О2 для данной культуры, осуществлен отбор устойчивых к пероксиду водорода популяций молочнокислых бактерий.
Ключевые слова: окислительный (оксидативный) стресс, молочная кислота, молочнокислые бактерии.
Известно, что при изменении (ухудшении) условий культивирования, например при исчерпании питательных веществ, а также источников энергии или при воздействии неблагоприятных факторов, таких как активные формы кислорода (АФК) и т.п., у микроорганизмов активируется ряд защитных механизмов для обеспечения адаптации в пределах нормы реакции вида или для его выживания в виде покоящихся форм в неростовых условиях [1]. При действии повышенных доз АФК на микроорганизмы возникает стресс, характеризуемый как окислительный (оксидативный), а сами стресс-факторы называются агентами окислительного стресса. Долгое время считалось, что стресс неблагоприятно воздействует на микроорганизмы, снижая их физиологическую активность и, как следствие, эффективность биосинтеза. Однако в настоящее время стрессовое воздействие широко используется для повышения эффективности процессов культивирования, поскольку при определенных условиях при воздействии стрессовых факторов возможно улучшение отдельных показателей биосинтеза [2]. Кроме того, микроорганизмы, являющиеся устойчивыми к воздействию одних стрессовых факторов, легко переносят воздействие других (перекрестная
Инокулятом служила суточная культура, выращенная на среде аналогичного состава.
С целью определения ЬБбо пероксид водорода, концентрация которого в серии опытных образцов варьировалась от 0,05 г/л до 3 г/л с шагом в 0,05 единиц, вносили в культуру, находящуюся в фазе замедленного роста, концентрация субстрата (глюкозы) при этом составляла 10-12% от начальной концентрации. ЬБ50 характеризуется уменьшением числа жизнеспособных клеток вдвое за Дт = 1 час.
Из рис. 1 следует (приведены только значимые точки), что ЬБ50 для данной культуры молочнокислых бактерий является концентрация пероксида водорода, равная 0,3 г/л. Для получения культуры молочнокислых бактерий, адаптированных к Н2О2 была выбрана именно эта концентрация.
адаптация), не снижая при этом физиологической активности [3].
Стрессовые факторы инициируют возникновение в ДНК повреждений, которые устраняются с помощью различных систем репарации, одной из которых является система фоторепарации. Фоторепарация обычно происходит на фоне освещения клеток ближним УФ и видимым светом. Этот процесс связан с действием фотолиазы -фотореактивирующего фермента, являющегося флавопротеином.
Исследование влияния оксидативного стресса на физиолого-биохимические характеристики культур молочнокислых бактерий выглядит весьма перспективным для подбора условий интенсификации биосинтеза молочной кислоты. Поэтому задачей данной работы являлось исследование влияния стрессовых факторов на молочнокислые бактерии.
В качестве микроорганизма-продуцента молочной кислоты использовали культуру Lactobacillus casei. Культивирование проводили при температуре 37 0С в колбах Эрленмейера, (объем 100 мл, рабочий объем - 50 мл).
В ходе следующей серии экспериментов осуществлялся отбор устойчивых к пероксиду культур молочнокислых бактерий путем последовательных пассирований в колбах на среде с низкой (20 г/л) и высокой (200 г/л) концентрацией глюкозы. Использовалась питательная среда того же состава, за исключением концентраций глюкозы. Культивирование проводилось как на свету (С1-С3), так и в темноте (Т1-Т3). Н2О2 вносили в количестве 0,3 г/л на 18 час (фаза замедленного роста) после пересева в С1 - Сз и Т1 - Тз. Для каждого эксперимента был свой контроль - культура молочнокислых бактерий, куда Н2О2 не вносился (С1к - Сзк и Т1к - Тзк).
Культивирование на свету проводилось с целью изучения возможной роли фоторепарации в адаптации культуры к оксидативному стрессу,
Таблица 1. Состав среды.
Компонент питательной среды Глюкоза Дрожжевой экстракт К2НРО4 MgSO4 MnSO4
Концентрация 100 г/л 10 г/л 2,0 г/л 0,1 г/л 0,05 г/л
поскольку известно, что механизм фоторепарации присутствует у Lactobacillus casei [4]. Сочетание высоких концентраций глюкозы и пероксида
водорода было осуществлено с целью выявления перекрестной адаптации молочнокислых бактерий.
концентрации глюкозы ц
■ k'v. 11 > I у [ 1И .
и.. :г.. |>i ашнинся воздействию перокеща во !■:[::. м
Контрольные ||бра пил ку.пллры (llfllOKCIU IJC ПШК'И.К'Н)
- Концыпряпна верокенда водорода,
г/л
I3J5Ó7R9 Моаытвого Шфдни. и и
В ходе культивирования определялись следующие характеристики: концентрация биомассы (Сб/М), концентрация глюкозы (Сгл), концентрация молочной кислоты (Смк). Концентрацию глюкозы измеряли методом Бертрана [5], содержание молочной кислоты в культуральной жидкости определяли потенциометрическим титрованием в изопропаноле 1%-ным раствором NaOH, а также с помощью ВЭЖХ (использовали изократическую ВЭЖХ систему серии 1220 Infinity, колонка ZORBAX Eclipse Plus-C18 (4,6 *12.5 мм) марки Agilent в
Рис. 1. Определение ЬОго пероксида водорода.
Международном учебно-научном Центре трансфера фармацевтических и биотехнологий РХТУ им. Д.И. Менделеева). Одна из хроматограмм приведена на рис.2. Калибровка велась по растворам молочной (концентрации 80 г/л, 16 г/л, 8 г/л, 4 г/л) и уксусной (концентрации 100 г/л, 20 г/л, 10 г/л, 5 г/л) кислот. Для подтверждения пиков применялся метод ввода эталона (молочной и уксусной кислот) в пробу. О концентрации биомассы судили по оптической плотности, которую измеряли при длине волны 505 нм, ФЭК «Экотест 2020».
Обозначение Условия Сгл, г/л (остаточная) Смк, г/л Сб/м, г/л (на 18й час)
Ci Высокая (200 г/л) концентрация глюкозы, в среде мела нет 40±1,0 30±1,0 0,3±0,2
С1к 87±1,0 35±1,0 0,6±0,5
Ti 38,0±2,0 15±1,0 0,8±0,2
Т1к 85,0±1,0 25±1,0 0,8±0,5
С2 Высокая (200 г/л) концентрация глюкозы, в среде присутствует мел 60±1,0 11±1,0 2,7±0,5
С2к 68±1,0 13±1,0 3,45±0,1
Т2 60±1,0 11±1,0 4,1±0,5
Т2к 67,0±1,0 13±1,0 4,8±0,5
Сз Низкая (20 г/л) концентрация глюкозы, в среде мела нет 6±1,0 12±1,0 0,16±0,02
Сзк 5±1,0 16±1,0 0,39±0,02
Тз 5±1,0 32±1,0 0,36±0,5
Тзк 10±1,0 11±1,0 1,3±0,2
На основании проанализированной литературы и полученных данных можно говорить о том, что высокие концентрации глюкозы вызывают осмотический шок у микроорганизмов, о чем свидетельствует увеличение времени лаг-фазы и снижение удельной скорости роста по сравнению с контролем (данные не приведены), кроме того, на хроматограмме (рис.2) видно, что при высоких концентрациях глюкозы в отсутствие в среде мела (Т1) компоненты питательной среды (пики 2, 3, 4) расходуются неполностью, соответственно концентрация молочной кислоты (пик 1) низкая (10 г/л). Вязкость среды увеличивается, что свидетельствует о частичном автолизе культуры, а также о возможном выделении в культуральную жидкость полисахаридов, выполняющих защитную функцию в условиях окислительного стресса, что
требует дальнейших исследований. Для случая Т3 (представлена хроматограмма для культуры, находившейся под воздействием пероксида водорода, пик 6 соответствует пероксиду водорода) видно, что концентрация молочной кислоты больше по сравнению с контролем (32 г/л), пики 2, 3, 4, 5 малы. Наблюдается увеличение выхода молочной кислоты в 1,6 раза по сравнению с контролем.
При внесении пероксида водорода в течение первых нескольких пассажей во всех линиях наблюдалось снижение скорости роста молочнокислых бактерий, а также снижение продуктивности по молочной кислоте вплоть до нуля, по сравнению с контрольными вариантами как на свету, так и в темноте. При дальнейшем пассивировании наблюдалось увеличение продуктивности по молочной кислоте на 5-7% при
культивировании на свету, по сравнению с система фоторепарации. К 10 пасссажу перекрестной культивированием в в темноте, что позволяет адаптации обнаружено не было. предположить, что в данном случае активируется
Рис. 2. Хроматограмма
Таким образом, было установлено, что при устойчивых к пероксиду водорода популяций воздействии на культуру L. casei ближнего УФ или молочнокислых бактерий, которыми оказались Т3 и видимого света активируются механизмы С3. фоторепарации. Кроме того был осуществлен отбор
Дерунец Алиса Сергеевна, студентка 5 курса кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Грошева Вероника Дмитриевна, к.т.н., н.с. кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Белодед Андрей Васильевич, к.б.н., доцент кафедры биотехнологии РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Гордиенко Мария Геннадьевна, в.н.с. НИЧ РХТУ им. Д. И. Менделеева, Россия, Москва
Литература
7. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г. И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина 2005. 367 с.
8. Davies J. M. S., Lowry C. V. and Davies K. J. A. Transient adaptation to oxidative stress in yeast. - Archives of biochemistry and biophysics. - 1995. - Vol. 317, issue 1. - P.1-6.
9. 3. Belenky P., Collins J. J. Antioxidant strategies to tolerate antibiotics // Science. - 2011. - Vol. 334, issue 18.
- P. 915-916.
10. Srittmatter C. F. Flavin-linked oxidative enzymes of Lactobacillus casei // J. Biol. Chem. - 1959. - Vol. 234.
- № 10.- P. 2794 -2800.
11. Низовкин В. К. Эбулиостатический метод определения редуцирующих сахаров / В. К. Низовкин, И.З. Емельянова // Журнал прикладной химии. -1959. -Т. 32, № 11.- С. 2516-2521.
Derunets Alice Sergeevna *, Grosheva Veronika Dmitrievna, Beloded Andrey Vasil'evich, Gordienko Maria Gennad'evna
D.I. Mendeleev University of Chemical Technology of Russia, Moscow, Russia. * e-mail: [email protected]
THE EFFECT OF OXIDATIVE STRESS ON PHYSIOLOGICAL AND BIOCHEMICAL CHARACTERISTICS OF LACTIC ACID BACTERIA.
Abstract
The effect of oxidative stress on physiological and biochemical characteristics of lactic acid bacteria Lactobacillus casei is investigated. The LD50 of Н2О2 for this culture of lactic acid bacteria is determined. Moreover, choice of resistant to hydrogen peroxide populations of lactic acid bacteria is carried out.
Key words: oxidative stress, lactic acid, lactic acid bacteria.
