CC BY
90
rium spp. или смесью бактерий число ловушек и клеток с недифференцированным ядром значительно увеличивалось (табл. 1).
Фагоцитарная активность нейтрофилов с неизмененным
Таблица 1
Содержание разных морфологических форм нейтрофилов периферической крови здоровых женщин после взаимодействия с E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. и смесью бактерий (n=10),%
Показатели Нейтрофилы
НН АНЕ АН8 АНЬ АН смесью бактерий
Содержание нейтрофилов с сегментированным ядром, % 59,89±6,19 32,40±5,38* 40,70±2,21* 28,40±4,81* 56,33±6,59
Содержание нейтрофилов с недифференцированным ядром, % 24,11±3,47 31,30±2,31* 32,9±4,72 37,10±3,83* 15,33±1,63
Содержание ловушек, % 16,0±4,22 36,30±3,89* 30,00±2,73* 34,50±4,50* 28,3±5,15*
УДК 611.018.25.017.1.086-055.2
ВЛИЯНИЕ НЕПАТОГЕННЫХ И УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ НОРМОФЛОРЫ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК НА СЕКРЕЦИЮ НЕЙТРОФИЛАМИ АНТИМИКРОБНЫХ ПРОДУКТОВ И ЦИТОКИНОВ
Е.А. МЕЗЕНЦЕВА, Ю.С. АНДРЕЕВА, И.И.ДОЛГУШИН, А.Ю. САВОЧКИНА, К.В. НИКУШКИНА, О.С. АБРАМОВСКИХ, Е.В. ПЛЕХАНОВА, М.А. СВИРИДОВ, С.И. МАРАЧЕВ,
А.И. РЫЖКОВА*
Ключевые слова: бактерицидные факторы, нейтрофилы
Примечание: * - достоверность различий показателей по отношению к НН; НН -неактивированных нейтрофилов; АНЕ - нейтрофилы, активированные E. coli (штамм М-17); АН8 - нейтрофилы, активированные S. aureus (штамм 209); АНЬ - нейтрофилы, активированные Lactobacterium spp.; АН смесью бактерий -нейтрофилы, активированные смесью бактерий
ядром была выше по отношению к E. coli, S. aureus и Lactobacte-rium spp., чем к микроорганизмам, находящихся в микстах (смесь бактерий), при этом поглотительная способность (интенсивность фагоцитоза) нейтрофилов максимально проявлялась по отношению к S. aureus. Индекс ловушки после взаимодействия нейтрофилов с E. coli, S. aureus и Lactobacterium spp достоверно превышал тот же показатель после активации смесью бактерий (табл. 2) и в 2-3 раза превосходил значение интенсивности фагоцитоза.
Таблица 2
Показатели фагоцитоза и содержание E. coli (штамм М-17),
S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp. в нейтрофильных ловушках (n=10)
Показатели Активирующие агенты
Е. coli S. aureus Lactobacterium spp. Смесь бактерий
Активность фагоцитоза,% 76,00±6,49 * 84,00±3,39* 34,5±4,5* 21,22±2,85
Интенсивность фагоцитоза на 1 клетку, усл.ед 2,59±0,56* 8,49±1,08* 1,22±0,40 0,36±0,05
Индекс нейтрофильной ловушки, усл.ед 5,91±0,50* 11,52±1,18* 2,56±0,56* 0,93±0,21
Примечание* - достоверность различий показателей по отношению к
показателям нейтрофилов, активированных смесью бактерий
Нами предложен экспресс-метод обнаружения нейтрофиль-ных внеклеточных ловушек с использованием акридинового оранжевого, позволяющий быстро обнаружить образующиеся структуры после активации нейтрофила и дать количественную характеристику явлению. Используя люминесцентную микроскопию, было обнаружено, что в ответ на действие бактериальных агентов нейтрофил формирует свои ловчие сети, при этом клетки, сохранившие морфологию (клетки с сегментированными ядрами) обладают выраженной способностью к фагоцитозу, однако, количество микроорганизмов, поглощенных нейтрофилом значительно уступает числу бактерий, задерживаемых в ловушках.
Литература
1Андреева Ю.С. Роль нейтрофилов в регуляции микробиоценоза влагалища женщин: Дис...канд.м. наук .- Челябинск, 2005.
2.Гланц С. Медико-биологическая статистика.- М. : Практика, 1999.
3.Долгушин И.И. Нейтрофилы и гомеостаз.- Екатеринбург : Изд-во УрОРАН, 2001.
4.Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники.-МЕДГИЗ. Ленинградское отделение, 1956.
5.Brinkmann V. et al. // Sciense.- 2004.- Vol. 303.- P. 15321535.
Микробицидная функция нейтрофилов заключается в поглощении и внутриклеточной переработке захваченного материала и в секреции антимикробных факторов и иммуно-тропных медиаторов за пределы клетки [2].
Цель - изучение спектра бактерицидных факторов (ли-зоцим, лактоферрин, оксид азота, миелопероксидаза, дефен-сины 1-3, БПИ) и провоспалительных цитокинов в супернатантах нейтрофилов периферической крови после их предварительного взаимодействия с частицами полистирольного латекса и взвесью контрольных штаммов микроорганизмов.
Материалы и методы. Для решения поставленной задачи нейтрофилы выделяли из периферической крови 20 здоровых женщин на двойном градиенте плотности фикол-ла-урографина (Pharmacia, Швеция; Шеринг, Германия). Плотность верхнего слоя градиента составляла 1,075-1,077, нижнего - 1,093-1,095 (Wong L., 1975), доводили до концентрации 5х106 клеток/мл и использовали для получения секреторных продуктов. Выделение секреторных продуктов полиморфноядерных лейкоцитов проводили с помощью метода, разработанного И.И. Долгушиным с соавторами (1992). Для получения супернатантов неактивированных нейтрофилов (СНН) взвесь клеток (концентрация 5х106 клеток/мл) помещали в термостат при температуре +37°С на 30 минут. Для выделения супернатантов активированных нейтрофилов (САН) клетки инкубировали в тех же условиях в присутствии микросфер латекса (диаметр частиц 1,7 мкм) из расчета 50 частиц на один нейтр офил или активировали нейтрофилы 0,1 мл взвеси суточной культуры контрольных моноштаммов S. aureus («Cowan 209»), Е. coli (штамм М-17) (препарат «Колибактерин», ФГПУ "НПО «Микроген» МЗ РФ, г. Москва), Lactobacterium spp. (препарат «Лакто-бактерин сухой», фирма «ИмБио», г. Нижний Новгород), Bifidobacterium spp. (препарат «Бифидумбактерин сухой», ЗАО «Экополис», г. Ковров), доведенной до концентрации 1 млрд. микробных тел в 1мл (по стандарту мутности БАК - 10, ООО «Ормет», г. Екатеринбург) и разведенной в 10 раз, или смесью бактерий, состоящей из 108 КОЕ/мл Lactobacterium spp.+ 106 КОЕ/мл Bifidobacterium spp. + 102 КОЕ/мл S. aureus +102 КОЕ/мл Е. coli на 1 мл взвеси нейтрофилов. После инкубации клетки и частицы латекса удаляли путем центрифугирования при скорости 3000 об/мин в течение 10 минут. Надосадочную жидкость фильтровали через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», USA), полученные супернатанты использовали в опытах.
Определение оксида азота в супернатантах интактных и активированных контрольными штаммами микроорганизмов ней-трофилов проводили по содержанию нитратов и нитритов. Содержание нитратов определяли в виде нитритов по реакции Грисса, после восстановления их губчатым кадмием [5]. Активность пероксидазы определяли на основании фотометрической регистрации понижения концентрации индигокармина, который окислялся перекисью водорода в присутствии пероксидазы [5]. Для определения содержания лизоцима использовали широко распространенный нефелометрический метод [6].
Концентрацию дефенсинов, БПИ, лактоферрина в супернатантах активированых и интактных нейтрофилов определяли методом ИФА с помощью набора реагентов «HNP1-3», «BPI - 1» (HyCult biotechnology, Нидерланды) и «ЛАКТОФЕРРИН-стрип» (ЗАО Вектор-Бест, п. Кольцово). Для определения содержания ИЛ-1а, ИЛ-1р , РАИЛ, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а в супернатантах нейтрофилов использованы тест-системы для иммуноферментно-го анализа, произведенные ТОО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург) [3,4,6]. Полученные результаты подвергнуты статистической обработке с использованием пакетов статистических программ
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии, Челябинская ГМА, 454092, г. Челябинск, Воровского, 64. Тел. (351)232-74-56
БИОСТАТ и Statistica for Windows 6.0. О достоверности различий показателей судили с помощью непараметрических критериев Крускала - Уоллиса и Манна - Уитни. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони [1].
Результаты. Анализ содержания лизоцима в секреторных продуктах нейтрофилов здоровых женщин показал, что после активации частицами латекса происходит усиление секреции лизоцима. Уровень лизоцима в супернатантах нейтрофилов, активированных бактериями, был стабильным. E. coli (штамм М-17), S. aureus (штамм 209), Lactobacterium spp., Bifidobacterium spp. и комплекс перечисленных бактерий не меняет содержание оксида азота в продуктах секреции нейтрофилов. Отмечена тенденция к снижению этого показателя в супернатантах нейтро-филов, активированных частицами латекса. Активность миелопе-роксидазы в супернатантах нейтрофилов активированных частицами латекса, кишечной палочкой, золотистым стафилококком, лактобактериями, бифидобактериями или бактериальной смесью соответствовала показателям неактивированных нейтрофилов.
Количество лактоферрина в супернатантах нейтрофилов, активированных частицами латекса, в 15 раз превосходило аналогичный показатель интактных нейтрофилов. Также достоверно высокий уровень лактоферрина определялся в супернатантах нейтрофилов, активированных бифидобактериями или бактериальной ассоциацией. Содержание дефенсинов 1-3 в супернатантах нейтрофилов, активированных E. coli, S. aureus, Lactobacte-rium spp. и Bifidobacterium spp. несколько снижалось относительно исходного уровня, а уровень БПИ повышался и значительно превосходил базовые значения в супернатантах нейтрофилов, активированных бифидобактериями. После оценки состава мик-робицидных продуктов представляло интерес изучение содержания цитокинов, являющихся медиаторами межклеточных коммуникаций при иммунном ответе, гемопоэзе, воспалении, а также межсистемных взаимодействиях, в супернатантах неактивированных и активированных латексом и взвесью различных микроорганизмов нейтрофилов периферической крови. В результате проведенных исследований обнаружили, что после 30 минутной инкубации без индукторов в супернатантах находились все искомые медиаторы. Хотя они определялись в низких концентрациях (пгімл), лидирующую позицию занимал РАИЛ. Его концентрация в 3-4 раза превосходила уровень RH-1a и ИЛ-8. Содержание ИЛ-1р практически в 2 раза уступало ИЛ-1сс, а концентрация ФНО-a и ИЛ-6 составляла 2,21 и 1,92 пгімл соответственно (табл.).
В ответ на стимуляцию частицами латекса и различными микробными агентами содержание RH-1a в супернатантах ней-трофилов здоровых женщин значительным образом не изменилось, отмечалось незначительное повышение этого показателя при действии немикробного агента, S. aureus, Е. coli или бактериального комплекса. При действии представителей нормобиоцено-зов (лакто- и бифидобактерий) на гранулоциты уровень RH-1a оставался стабильным. Бактериальные агенты значительно не влияли на секрецию нейтрофилами ИЛ-1р. При действии частиц латекса и смеси бактерий содержание ИЛ-1р снижалось и значительно уступало аналогичному показателю секреторных продуктов нейтрофилов, активированных кишечной палочкой.
Содержание РАИЛ в супернатантах нейтрофилов, активированных частицами латекса или смесью бактерий значительно уступало исходному уровню, а показатель РАИЛ в секреторных продуктах нейтрофилов, активированных E.coli достоверно превосходил начальный показатель. Содержание ИЛ-6 в продуктах секреции нейтрофилов, активированных частицами латекса сопровождалось снижением показателя относительно контрольного уровня. Действие кишечной палочки и золотистого стафилококка приводило к усилению секреции этого цитокина, однако статистического подтверждения таких изменений нами не получено. Лакто-, бифидобактерии или бактериальный комплекс поддерживали секрецию ИЛ-6 на начальном уровне.
Уровень хемокина был выше в супернатантах нейтрофилов, активированных S. aureus, Е. coli и значительно превышал исходный уровень в супернатантах, активированных бифидобактериями. Частицы латекса снижали секрецию ИЛ-8, а лактобактерии и бактериальная ассоциация не влияли на уровень хемоаттрактанта. При действии кишечной палочки, золотистого стафилококка, лакто-, бифидобактерий, а также бактериального комплекса нейтрофилы периферической крови здоровых женщин не изменяли секрецию ФНОa и сохраняли ее на исходном уровне, в то же время частицы латекса способствовали усиленной секреции
этого цитокина (табл. 1). Можно заключить, что в супернатантах интактных нейтрофилов находятся активные молекулы (оксид азота), ферменты гранул нейтрофила (лизоцим, пероксидаза), антимикробные пептиды (дефенсины, БПИ и лактоферрин), провоспалительные и противовоспалительные (РАИЛ) цитокины.
В ответ на действие частиц латекса, в продуктах секреции нейтрофилов значительно уменьшается содержание РАИЛ и повышается количество ФНОа, уровень лизоцима и лактоферри-на, остальные показатели значительным образом не изменяются.
При действии кишечной палочки и золотистого стафилококка в супернатантах нейтрофилов регистрируется повышенный уровень всех искомых цитокинов, как провоспалительных, так и противовоспалилельных, но статистически значимо превышает исходный показатель только РАИЛ. Содержание антимикробных факторов при этом остается на прежних значениях. Действие лакто- и бифидобактерий на нейтрофил иное, после активации в супернатантах уровень оксида азота, лизоцима, пероксидазы и дефенсинов не изменяется, а содержание БПИ и лактоферрина повышается и превосходит исходный уровень при действии бифидобактерий или смеси используемых бактерий. При этом лакто- и бифидобактерии не вызывают изменения уровня ИЛ-1а, ИЛ-1р, РАИЛ, ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОа в супернатантах активированных нейтрофилов по сравнению с интактными клетками.
В ответ на стимуляцию как микробными, так и немикробными факторами, нейтрофил секретирует в окружающую среду широкий спектр антимикробных факторов с разным механизмом действия и цитокинов. Часть этих компонентов, обладающих преимущественно прямым бактерицидным эффектом, расходуется на бактерию-активатор, в то же время факторы непрямого (лактоферрин) и внутриклеточного (БПИ) действия определяются в больших количествах в супернатантах нейтрофилов, активированных лакто- и бифидобактериями. Подводя итог, можно предположить, что, на поверхности слизистых оболочек лакто- и бифидобактерии стимулируют секрецию нейтрофилами антимикробных продуктов, активных в отношении условнопатогенных и патогенных бактерий, а блокада цитокинового звена препятствует развитию воспалительной реакции на присутствие нормофлоры на поверхности слизистых оболочек.
Литература
1.Гланц С. Медико-биологическая статистика.- М.: Практика, 1999.
2.Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз.-Екатеринбург : Изд-во УрОРАН, - 2001.
3.Иммунологические методы / Под ред. Г. М. Фримеля.- М.: Медицина, 1987.
4.Иммунологические методы исследования: Уч. пос. /Под ред. Е.А. Олейникова, Л.Я. Эберта.- Саранск, 1981.
5.Показатели липидного обмена в сыворотке крови практически здорового населения, проживающего в южно-уральском регионе в условиях адаптации к климатическим и техногенным воздействиям: Метод.реком. / Э.Н. Коробейникова и др.- Челябинск, 2001.
6.Телешева Л.Ф. Иммунологические факторы секретов репродуктивного тракта женщин: Дис... д.м.н. - Челябинск, 2000.
УДК: 536.7; 621.794; 58, 024
НАНОРАЗМЕРНЫЕ СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ
К.В. АЛЕКСЕЕВ, Р.Н. АЛЯУТДИН, Е.В. БЛЫНСКАЯ, Б.Т. КВИНХ*
Статья посвящена рассмотрению основных групп наноразмерных систем - носителей лекарственных веществ. Приводится сравнительный анализ изучаемых структурных единиц доставки по показателям характеристических особенностей используемых материалов, стабильности и т.д., указываются возможные варианты использования систем в различных областях медицины.
Ключевые слова: нанотехнологии, носители лекарств
Повышение избирательности действия лекарственных веществ является задачей химиотерапии. Важен поиск новых подходов к созданию лекарственных препаратов направленного
* НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН, (131547 Москва, ул. Балтийская, д.8) ММА им. И.М. Сеченова(119991 Москва, ул. Трубецкая, д.8)
