CC BY
44
экспериментальные исследования в биологии и медицине
УДК 576.3:577.12
Л.в. Антонова, А.Ю. Бураго, в.Г. Матвеева, Ю.А. Кудрявцева, М.в. Насонова, Я.Г. торопова,
E.A. великанова, А.С. Головкин
влияние мультипотЕнтных мезенхимальных стромАльных клеток костного мозга на скорость биодеградации матриц из полиоксиалканоатов и поликапролактона
НИИ комплексных проблем сердечно-сосудистых заболеваний СО РАМН (Кемерово)
Изучено влияние мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга (ММСК КМ) на скорость биодеградации, пленочных матриксов из полиоксиалканоатов и поликапролактона. Выявлено, что присутствие клеток на поверхности, пленочных матриксов способствовало ускорению их резорбции. Через 2 месяца после подкожной имплантации, крысам, пленочные матриксы, с ММСК КМ на своей поверхности деградировали, полностью, тогда как матриксы, без клеток частично резорбировались к указанному сроку. Полученные результаты, делают, необходимым дальнейшее изучение механизмов влияния ММСК КМ на скорость резорбции биополимеров.
Ключевые слова: мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки, биополимеры, время биодеградации
impact of bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells on speed of polycaprolactone and polyhydroxyalkanoate scaffolds biodegradation
L.V. Antonova, A.Y. Burago, V.G. Matveyeva, Y.A. Kudryavtseva, M.V. Nasonova,
Y.G. Toropova, E.A. Velikanova, A.S. Golovkin
Institution Research Institute for Complex Issues of Cardiovascular Diseases SB RAMS, Kemerovo
The impact of bone marrow-derived multipotent mesenchymal stromal cells of a bone brain (MSCs BB) on the speed, of polycaprolactone and polyhydroxyalkanoate scaffolds biodegradation was studied. The presence of cells on the scaffolds surface was found to catalyze their resorption. 2 months after MSCs-covered scaffolds had. been subcutaneously implanted, in rats they degraded completely while scaffolds, which had. no MSCs cover, had partially resorbed, by that time. The obtained, results make necessary further studying of MSCs impact mechanisms on biopolymers resorption speed.
Key words: multipotent mesenchymal stromal cells, biopolymers, biodegradation time
В клеточной трансплантологии и тканевой инженерии широко используется возможность культивации клеточных культур на синтетических носителях. Вместе с тем различные клеточные линии обладают специфическими функциональными свойствами и в процессе своей жизнедеятельности синтезируют различные биоактивные вещества, способные оказывать влияние на некоторые характеристики синтетических материалов. Так, мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга (ММСК КМ) способны секретировать как компоненты внеклеточного матрикса (фибронектин, коллаген, протеоглика-ны, ламинин) [6, 7], так и комплекс цитокинов с противовоспалительным и антиапоптотическим действием и хемокинов, участвующих в поддержании гемопоэза (ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-7, ИЛ-8, ИЛ-11, факторы роста стволовых клеток и гепатоцитов, ма-крофагальный, гранулоцитарно-макрофагальный) [4, 6, 11]. Известен также хоминг-эффект ММСК
КМ, реализующийся через выработку цитокина SDF-1 [8].
Биодеградируемые полимеры широко применяются в клеточной трансплантологии и тканевой инженерии. На их основе создаются шовные материалы, трансплантаты для восстановления хрящевой, костной ткани и кожи. Ведутся разработки по созданию сосудистых протезов. Однако в каждом случае выбор полимера обусловлен сроком его био-дергадации, который должен быть достаточным для завершения регенерации или воссоздания органа. Так, для создания сосудистого графта пригодны гемосовместимые биополимеры, скорость биодеградации которых не должна быть меньше 2 — 3 лет. Именно за это время на месте биорезорбируемого сосудистого графта формируется новый собственный сосуд. При этом в случае заселения внутренней поверхности графта функционально активными клетками (эндотелиальными или ММСК КМ) необходимо иметь четкую уверенность, что культи-
вация подобных клеточных линий не повлияет на скорость биодеградации сополимерного каркаса. Таким образом, в связи с широким интересом к биополимерам, обладающим определенным временем биодеградации, остается до конца неизученным влияние функционально активных клеточных линий на скорость биодеградации полимеров.
Цель работы — оценить влияние мультипо-тентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга на скорость биодеградации сопо-лимерных композиций из полиоксиалканоатов и поликапролактона, потенциально пригодных для создания сосудистого графта.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для получения матриц были использованы по-лигидроксибутират (ПГБ) с молекулярной массой (ММ) 541 кДа и сополимер полигидроксибутирата с гидроксивалератом (ПГБВ) ММ 2307 кДа, предоставленные в виде порошка Институтом биохимии и физиологии им. Г.К. Скрябина СО РАН (г. Пущи-но, Московская область), поликапролактон (PCL) ММ 80000кДа (Sigma, США); в качестве растворителя — хлороформ ЗАО «Вектон», Россия. Двухмерные матриксы в виде пленок получали методом полива растворов полимеров на обезжиренную поверхность стекла. Использовали пленочные матриксы (ПМ) следующего состава: ПМ № 1 — композиция ПГБВ ММ 2307 кДа и PCL, ПМ № 2 — композиция ПГБ MM 541 кДа и PCL. Матриксы помещали в лунки 24-луночных планшет.
Культуру ММСК КМ получали путем выделения костного мозга бедренных костей крыс линии Wis-tar. Культивирование клеток проводили при 37 °С и 5% СО2 в среде DMEM (Gibco, США), содержащей 1% HEPES буфера, 10% эмбриональной бычьей сыворотки, 1% L-глутамина, 100 ед./мл пенициллина,
0,1 мкг/мл стрептомицина, 0,1 мкг/мл амфотери-цина В (Sigma Aldrich, США). С целью определения относительного числа клеток, обладавших муль-типотентностью и стволовостью, проводили фенотипический анализ каждого пассажа клеточной культуры методом проточной цитофлуориметрии на цитофлуориметре FACS Calibur (Becton Dickinson, США) с использованием моноклональных антител CD90 и CD11b, меченных FITC, и CD45 и CD106, меченных PE. Жизнеспособность ММСК КМ до и после культивации на сополимерных пленках опре-
деляли путем окрашивания клеток 0,1% раствором трипанового синего. Для культивирования на матрицах использовали ММСК КМ 7-го пассажа. Клетки высевали в концентрации 2,5 х 105 на лунку и культивировали в течение 7 дней. За сутки до окончания времени культивации ММСК КМ на матриксах в среду культивирования двух контрольных лунок с ПМ № 1 и ПМ № 2 добавляли флуорохром РКН2 (Sigma, США). Детекцию флуоресцентно меченных ММСК КМ проводили посредством флуоресцентной микроскопии на инвертированном микроскопе Axio Observer Z1 (Carl Zeiss, Германия). Эффективность адгезии клеток к поверхности ПМ оценивали по количеству прикрепившихся клеток, видимых в десяти полях зрения микроскопа, усредненных и пересчитанных на единицу площади в 1 мм2.
В эксперименте было задействовано 16 животных массой 250 — 300 г. Опыты проводились с учетом требований и принципов гуманного обращения с экспериментальными животными согласно приказу № 742 13.11.84 «Об утверждении правил проведения работ с использованием экперимен-тальных животных». Животных наркотизировали путем внутрибрюшинной инъекции тиопентала натрия из расчета 50 мг/кг. Каждому животному подкожно имплантировали образцы ПМ № 1 и ПМ № 2 с ММСК КМ (опыт) и без них (контроль). Вывод из эксперимента осуществлялся через 2 месяца путем декапитации животных после предварительной наркотизации. Оценку гистологической картины проводили на световом микроскопе AXIO Imager A1 (Carl Zeiss, Германия) с предварительным окрашиванием образцов гематоксилин-эозином по общепринятой методике.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Перед культивацией на матриксах количество жизнеспособных ММСК КМ составило 99,6 %. При фенотипическом анализе ММСК КМ 7 пассажа выявлено, что 90,6 % клеток были 90 + , 45-, 106—, 11b-, что подтвердило мультипотентность и ство-ловость полученных в ходе культивации клеток. Количество ММСК КМ на ПМ №1 и ПМ № 2 в конце культивирования составило соответственно 339.4±74,8 кл/мм2 и 189,5±6,0 кл/мм2. При этом количество жизнеспособных ММСК КМ, снятых с ПМ №1 и ПМ №2, составило 98,5 % и 97,8 % соответственно.
А Б В
Рис. 1. Двухмерные гистограммы распределения ММСК КМ 7 пассажа методом проточной цитофлуориметрии: А - по CD 11Ь - СР 45; Б - по СР 11Ь - СР 106; В - по СР 90 - СР 45.
Известно, что биодеградация полиоксиалкано-атов (ПОА) напрямую зависит от их молекулярной массы: чем меньше молекулярная масса — тем короче срок биорезорбции. При имплантации ПОА распад полимера in vivo происходит внутри капсулы, которая формируется соединительной тканью. Основными клеточными элементами, участвующими в деструкции инкапсулированного полимера, являются макрофаги и гигантские клетки инородных тел. Полное рассасывание ПОА происходит через 6 месяцев [1, 3].
В ряде экспериментов доказана высокая биологическая совместимость PCL. Полимер обладает хорошими адгезивными свойствами по отношению к мезенхимальным стволовым клеткам и низкой цитотоксичностью [2, 9]. В условиях in vivo волокна поликапролактона деградируют, создавая при этом хорошую основу для роста клеток, которые могут сформировать ткань [5]. Однако по данным некоторых авторов, адгезия и рост различных популяций клеток на чистом PCL не удовлетворительна [10].
В ходе нашего эксперимента выявлено, что биодеградация сополимерных матриксов № 1 и № 2, в состав которых входили полиоксиалканоаты и поликапролактон, также осуществлялась внутри сформированных тонких соединительнотканных
капсул, состоящих из фибробластов и коллагена. На рисунке 2 видно, что ПМ № 1 и ПМ № 2 без ММСК КМ деградировали медленно и через 2 месяца визуализировались как фрагментированная желтоватая субстанция, окруженная тонкими соединительнотканными прослойками.
В то же время матриксы № 1 и № 2, на поверхности которых в течение 7 дней культивировались ММСК КМ, полностью деградировали уже через 2 месяца после подкожной имплантации. На месте имплантации сохранялись лишь тонкие соединительнотканные прослойки. При этом по контуру внутренней поверхности соединительнотканных тяжей определяли немногочисленные моноцитар-но-макрофагальные клеточные элементы с остатками гранул полимера в цитоплазме.
заключение
Таким образом, наличие ММСК КМ на поверхности пленочных матриксов способствует ускорению сроков биодеградации сополимерных композиций из полиоксиалканоатов и поликапро-лактона in vivo. Полученные результаты делают необходимым дальнейшее изучение влияния функционально активных клеток на скорость резорбции биосовместимых и биодеградируемых полимеров.
А Б
Рис. 2. Степень резорбции пленочных матриксов без предварительной культивации ММСК КМ на их поверхности и морфология окружающих тканей через 2 месяца после подкожной имплантации (ув. х 100; окраска гематоксилин-эозином): А - ПМ № 1; Б - ПМ № 2.
А Б
Рис. 3. Степень резорбции пленочных матриксов с ММСК КМ и морфология окружающих тканей через 2 месяца после подкожной имплантации (ув. х 100; окраска гематоксилин-эозином): А - ПМ № 1; Б - ПМ № 2.
литература
1. Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К. Сравнительное изучение кинетики биодеградации биополимерных систем на основе поли-3-оксибутирата // Биомед. химия. — 2009. — Т. 55, Вып. 6. - С. 702-712.
2. Волков А.В. Синтетические материалы на основе полимеров органических кислот в тканевой инженерии // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2005. - № 2. -С. 43-45.
3. Николаева Е.Д., Шишацкая Е.И., Моча-лов К.Е. Сравнительное исследование клеточных носителей, полученных из резорбируемых по-лигидроксиалканоатов различного химического состава // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. — 2011. — Т. 6, № 4. — С. 54-63.
4. Boiret N., Rapatel S., Veirat-Masson R. Characterization of nonexpanded mesenchymal progenitor cells from normal adult human bone marrow // Exp. Hematol. - 2005. - Vol. 33. - P. 219-225.
5. Bolgen N., Menceloglu Y.Z., Acatay K. In vitro and in vivo degradation of non-woven materials made of poly(e-caprolactone) nanofibers prepared by elec-
trospinningunder different conditions // J. Biomater. Scin. Polym. Ed. - 2005. - N 16. - P. 1537-1555.
6. Dazzi F., Ramasamy R., Glennie S. The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis // Dlood Rev. - 2006. - Vol. 20. - P. 161-171.
7. Devine S.M., Hoffman R. Role of mesenchymal stem cells in hematopoietic stem cell transplantation // Curr. Opin. Hematol. - 2000. - Vol. 7. - P. 358-363.
8. Hoffman A., Czichos S., Kaps S. The T-box transcription factor Brachury mediates cartilage development in mesenchymal stem cell line C3H10T1/2 // J. Cell. Sci. - 2002. - Vol. 115. - P. 769-781.
9. Neuss S., Apel C., Buttler P. et al. Assessment of stem cell/biomaterial combinations for stem cell-based tissue engineering // Biomaterials. - 2008. -N 29. - P. 302-313.
10. Pankajakshan D., Krishnan K., Krishnan L. Vascular tissue generation in response to signaling molecules integrated with a novel poly(e -caprolactone)-fibrin hybrid scaffold // J. Tissue Eng. Regen. Med. - 2007. - N 1. - P. 389-397.
11. Siegel G., Shaffer R., Dazzi F. The immuno-supressive properties of mesenchymal stem cells // Transplantation. - 2009. - Vol. 87. - N 9. -P. 45-49.
сведения об авторах
Антонова Лариса Валерьевна - старший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН, кандидат медицинских наук (650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6; тел.: 89059060451; e-mail: [email protected]) Матвеева Вера Геннадьевна - научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФгБу «НИИ КПССЗ» СО РАМН (650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6; e-mail: [email protected])
Бураго Андрей Юрьевич - ведущий научный сотрудник лаборатории ультраструктурных исследований тканей ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН, кандидат медицинских наук (650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6; e-mail: [email protected]) Кудрявцева Юлия Александровна - заведующая лабораторией новых биоматериалов ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН, доктор медицинских наук (650002, г Кемерово, Сосновый бульвар, 6; e-mail: [email protected])
Насонова Марина Владимировна - научный сотрудник лаборатории новых биоматериалов ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН (650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6; e-mail: [email protected])
ТороповаЯна Геннадьевна - научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН (650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6; e-mail: [email protected])
Великанова Елена Анатольевна - младший научный сотрудник лаборатории клеточных технологий ФГБУ «НИИ КПССЗ» СО РАМН (650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6; e-mail: [email protected])
Головкин Алексей Сергеевич - заведующий отделом экспериментальной и клинической кардиологии, заведующий лабораторией клеточных технологий ФгБу «НИИ КПССЗ» СО РАМН, кандидат медицинских наук (650002, г. Кемерово, Сосновый бульвар, 6; e-mail: [email protected])
