Влияние модуляторов синтеза оксида азота на активность и аутопроцессинг катепсина в иммуно-компетентных органов крыс в условиях in vitro Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

© Абаленихина Ю.В., Фомина М.А., 2014 УДК 577.1:612.017.1

ВЛИЯНИЕ МОДУЛЯТОРОВ СИНТЕЗА ОКСИДА АЗОТА НА АКТИВНОСТЬ И АУТОПРОЦЕССИНГ КАТЕПСИНА В ИММУНОКОМПЕТЕНТНЫХ ОРГАНОВ КРЫС В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Ю.В. АБАЛЕНИХИНА, М.А. ФОМИНА

Рязанский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, г. Рязань

THE IMPACT OF MODULATORS OF THE SYNTHESIS OF NITRIC OXIDE IN THE ACTIVITY, AUTOPROCESSING CATHEPSIN IN IMMUNOCOMPETENT ORGANS OF RATS IN CONDITIONS OF IN VITRO

JU.V. ABALENIHINA, M.A. FOMINA

Ryazan State I.P. Pavlov University, Ryazan

Изучено in vitro влияние L-аргинина и N-нитро-Ь-аргинин-метилового эфира на активность и аутопроцессинг катепсина В тимуса и селезенки крыс. Полученные результаты демонстрируют активацию катепсина В в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота, при этом увеличивается доля активных молекул. Под действием L-аргинина активность катепсина В не изменяется, при этом снижается доля активных молекул, что демонстрирует формирование адаптивного иммунитета в условиях in vitro стимуляции синтеза оксида азота.

Ключевые слова: катепсин В, L-аргинин, N-нитро^-аргинин-метиловый

эфир.

Influence L-arginine and N-nitro-L-arginine methyl ester, and the activity of cathepsin B autoprotsessing thymus and spleen of rats is studied. These results demonstrate the activation of cathepsin B in conditions of nitric oxide synthesis deficiency that leads to increasing the fraction of active molecules. The activity of cathep-sin B does not changeunder the action of L-arginine, thus the fraction of active molecules is deacreased, that demonstrates the formation of adaptive immunity modeling of nitric oxide synthesisin vitro.

Keywords: cathepsin B, L-arginine, N-nitro-L-arginine methyl ester.

Введение

Цистеиновые протеиназы известны как класс тиоловых протеиназ, которые содержат остатки цистеина в активном центре. Одним из самых крупных и интересных считается семейство папаиноподобных протеолитических ферментов, локализующихся главным образом в лизосомах, имеющих оптимальную кислую среду для максимальной активности катепсинов. В настоящее время, в связи с тем, что защитная функция лизосом характеризуется их участием в лизисе микроорганизмов и вирусов, есть все основания утверждать - этап лизосомального переваривания является неотъемлемой частью общего универсального механизма естественного иммунитета [7, 9].

Таким образом, протеазы вовлечены в процесс формирования иммунного ответа, в регуляции которого участвует оксид азота как молекула, имеющая окислительно-восстановительный потенциал [12]. В организме человека и животных N0 образуется в результате ферментативной реакции

из Ь-аргинина под действием N0-синтаз. Одним из антагонистов синтеза оксида азота является №нитро-Ь-аргинин-метиловый эфир (Ь-№АМЕ), представляющий собой конкурентный эндогенный ингибитор индуцибель-ной N0-синтазы.

Цель исследования

Изучение влияния Ь-аргинина и Ь-NAME на активность и аутопроцессинг катепсина В тимуса и селезенки крыс.

Материалы и методы

Исследование проводили на конвенциональных половозрелых крысах-самцах линии массой 280-320 г.

Содержание и выведение животных из эксперимента выполняли в соответствии с правилами, изложенными в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985) и приказе МЗ РФ №267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Для получения клеточного биологического материала животных вводили в глубокий наркоз, производили обескровливание и стерильно извлекали тимусы и селезенки, далее выделяли тимоциты (спленоци-ты)согласно рекомендациям [3]. Ти-моциты (спленоциты) инкубировали in vitro в полной питательной среде, содержащей 5 м ML-NAME (n=8) или 5 м ML-аргинин (n=8) 24 часа при температуре 370С [4]. Контрольная группа представляла собой тимоциты (спленоциты), инкубированные в тех же условиях в полной питательной среде (n=8). После инкубации полученные клетки осаждали при 600 gи ресуспендировали в 0,25М сахарозе, в полученный материал добавляли Тритон Х-100, что представляло собой пробу для определения общей активности (ОА) катепсинов.

Активность катепсина В определяли спектрофлуориметрическим методом по Barrett & Kirschke [6]. Активность катепсинов выражали в нмоль/сХг белка.

Оценка аутокаталитической активации проводилась путем преинкуби-рования биологического материала в реакционной смеси, не содержащей субстрат, в течение 15 минут при 370С с последующим добавлением последнего [1]. Для сравнения степени аутокатали-тической активации катепсинов подсчитывали коэффициент отношения значения активности ферментов после

прекаталитической инкубации к значению активности без преинкубации.

Содержание оксида азота определяли спектрофотометрией в видимой области спектра по реакции с реактивом Грисса [2].

Для каждой выборки вычисляли характеристики: медиану (Ме), минимальное (min) и максимальное значение (max). Поскольку отмечалось отсутствие согласия данных с нормальным распределением (W-критерий), для оценки достоверности различий независимых выборок использовали ранговый критерий Манна-Уитни (U-тест).

Результаты и их обсуждение

Как показывают результаты выполненных исследований, концентрации метаболитов оксида азота, как для ти-моцитов, так и для спленоцитов отмечается одинаковая тенденция: инкубация в среде с 5 м М аргинином способствует увеличению количества NO2 и NO3 , внесение L-NAME в инкубационную среду влечет понижение концентрации метаболитов оксида азота (табл. 1).

В экспериментальной группе спленоцитов, инкубированных в среде с добавлением L-аргинина статистически значимых различий общей активности катепсина В (14,4 [14,2; 15,3], р=0,24) относительно значений контрольной группы (15,2 [12,6; 17,2]) отмечено не было.

В экспериментальной группе спленоцитов, инкубированных в пол-

ной питательной среде с добавлением 5 м МL-NAME, отмечается следующая тенденция: увеличение общей

активности катепсина В (23,3 [21,7; 23,3], р=0,016) относительно значений контрольной группы (15,2 [12,6;17,2]).

Таблица 1

Концентрация метаболитов оксида азота (мкМ/106 клеток) спленоцитов и тимоцитов крыс в условиях in vitro -модулированного синтеза оксида азота (Ме [min; max])

Экспериментальная модель Тимоциты Спленоциты

Контроль 24,9 [20,4; 32,7] 6,11 [5,7; 8,81]

L-аргинин (5 мМ) 40,0 [35,1; 42,1]*#*(p=0,01) #(p=0,009) 32,7[24,9;38,9]*#*(p=0,01) #(p=0,003)

L-NAME (5 мМ) 15,4 [12,7; 17,3]*(p=0,03) 4,9 [4,3; 5,7]* (p=0,04)

Примечание: статистически значимые различия относительно контроля (р < 0,05); # - статистически значимые различия относительно L-NAME 5 мМ (р < 0,05).

Коэффициент активации контрольной группы составил 0,38[0,15; 0,59] для катепсина В и статистически значимо повышается в группе ^аргинин: 1,79 [0,48; 2,21] (р=0,002). Коэффициент активации в группе L-NAME составил 0,28 [0,23; 0,31] (р=0,02), что статистически значимо ниже относительно контрольного значения.

В экспериментальной группе тимоцитов, инкубированных в среде с Ь-аргинином статистически значимых различий общей активности катепси-на В (15,9 [13,1; 20,8], р=1,00) относительно значения контрольной группы (16,6 [13,3; 25,6]) отмечено не было.

В экспериментальной группе ти-моцитов, инкубированных в полной питательной среде с добавлением 5 м М L-NAME, отмечается увеличение общей активности катепсина В (18,7 [16,9;

27,5], р=0,036) относительно значений контрольной группы (16,6 [13,3; 25,6]).

Коэффициент активации катепсина В тимоцитов в контрольной группе составил 1,15 [1,11; 1,25] и статистически значимо повышается в группе L-аргинин: 1,27 [1,07; 1,33] (р=0,05). Коэффициент активации в группе L-NAMEсоставил 0,64 [0,55; 0,87] (р=0,03), что статистически значимо ниже относительно контрольного значения.

Таким образом, в условиях in vitro моделирования дефицита синтеза оксида азота общая активность катепсина В как в тимоцитах, так и спленоцитах статистически значимо снижается по сравнению с контролем, при этом преобладает доля активных молекул катепсина.

Активация катепсина В может свидетельствовать об индукции им-

мунного ответа. Катепсины, являясь иммунными модуляторами, способны формировать иммунный ответ по двум путям: прямой (деградация патогенов в пределах фаголизосом) и косвенный (активация ключевых рецепторов узнавания) [9]. Таким образом, повышение активности лизосо-мальных цистеиновых протеиназ-спленоцитов и тимоцитов крыс в условиях in vitro моделирования дефицита синтеза оксида азота может быть связано с необходимостью обеспечить рецепторы лигандами для обеспечения иммунной реакции.

Возможно, активация катепсина В, как сигнальной молекулы, связана с запуском процесса апоптоза в условиях угнетения синтеза оксида азота (II). Известно, что угнетение синтеза NO приводит к развитию окислительного стресса и повышению активности ядерного фактора транскрипции NF-kB, который регулирует активность генов, ответственных за развитие воспалительного ответа [10]. По представлениям «классического» апоптоза, каспаза-8 вызывает выход из лизосом активного катепсина В, который вызывает активацию гибели клеток путем частичного расщепления проапоптоз-ных белков, в результате чего происходит их активация [11], возможно в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота происходит высвобождение апоптозных белков.

Кроме этого, активность катепсина В как протеиназы, разрушающей дефектные молекулы белков, может увеличиваться в ответ на повышение поврежденных белков вследствие развития оксидативного стресса.

Одновременно нами было установлено, что активность катепсина В в условиях in vitro стимулирования синтеза оксида азота не изменяется. Избыток субстрата синтеза NO обеспечивает явление адаптации, поддерживая на неизменном уровне активность лизо-сомальных цистеиновых протеиназ.

К настоящему времени аутоката-литический механизм активации был описан для многих цистеиновых про-теиназ, в том числе и для катепсина В [5]. Все лизосомальные протеиназы превращаются в активную зрелую форму в результате ограниченного протеолиза. Результаты изучения активации лизосомальных цистеиновых протеиназ показывают, что неселективный ингибитор индуцибельной NO-синтазы- L-NAME влияет на ауто-процессинг данной группы ферментов. Внесение L-NAME в инкубационную среду способствует активации созревания зимогенов, так как большая часть протеиназ находится в активном состоянии. Представленный факт демонстрирует, что в условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота организм испытывает функциональную потребность в протеиназах.

В условиях in vitro моделирования дополнительного синтеза оксида азота молекулы катепсинов находятся в неактивном состоянии, о чем свидетельствует повышение коэффициента активации. Изложенный факт свидетельствует о том, что в лизосомах происходит накопление прокатепси-нов, которые могут перейти в активные формы, то есть в ответ на патологическое состояние организма с целью коррекции.

Важно отметить, L-аргинин и L-NAME оказывают одинаковое влияние на активность и аутопроцессинг катепсина В тимуса и селезенки крыс, что свидетельствует об общих закономерностях реакции центрального и периферических иммунных органов.

Выводы

1. В условиях моделирования дефицита синтеза оксида азота активность катепсина В увеличивается с преобладанием доли активных молекул, возможно, вследствие развития воспалительных процессов и апоптоза, а так же - как защитный механизм в ответ на появление поврежденных белков активными формами кислорода.

2. В условиях in vitro моделирования дополнительного синтеза оксида азота изменение активности ка-тепсина В не отмечается, при этом снижается доля активных молекул, что демонстрирует формирование адаптивного иммунитета.

Литература

1. Борискина М.А. Изменение активности лизосомальных цистеино-вых протеиназ у больных хроническими лейкозами в динамике заболевания: дис. ... канд. мед. наук. - Рязань, 1996. - 150 с.

2. Метельская В.А. Скрининг-метод определения уровня метаболитов оксида азота в сыворотке крови / В.А. Метельская, Н.Г. Гуманов // Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - №6. - С. 15-18.

3. Полякова В.О. Геропротек-торное и регуляторное действие пептидов на клетки тимуса: дис. ... к.б.н. - СПб., 2003. - 119 с.

4. Стариков Ю.В. Роль молекул оксида азота в программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе: автореф. ... канд. мед. наук. - Новосибирск, 2008. - 22 с.

5. Autocatalytic processing of recombinant human procathepsin B is a bimolecular process / J. Rozman [et al.] // FEBS Lett. - 1999. - Vol. 459. -P. 358-362.

6. Barrett A.J. Cathepsin B, cathepsin H, cathepsin L / A.J. Barrett, H. Kirschke // Methods in Enzymol. -1981. - Vol. 80. - P. 535-561.

7. Conus Sébastien. Cathepsins and their involvement in immune responses / Sébastien Conus, Hans-Uwe Simon // Swiss Medical Weekly. - 2010. - P. 1-12.

8. In vitro effects of nitric oxide donors on apoptosis and oxida-

tive/nitrative protein modifications in ADP-activated platelets / A. Sener [et al.] // Hum. Exp. Toxicol. - 2013. - Vol. 32(3). - P. 225-235.

9. Manoury Be'ne'dicte. Serine and Cysteine Proteases and Their Inhibitors as Antimicrobial Agents and Immune Modulators / Be'ne'dicte Manoury, Ali Roghanian, Jean-Michel Sallenave. - 2011. - P. 27-50.

10. Regulation of programmed cell death by NF-kappa B and its role in tumorigenesis and therapy / Y. Fan [et al.] // Adv. Exp. Med Biol. - 2008. -Vol. 615. - P. 223-250.

11. Role of cathepsin B in dengue virus-mediated apoptosis / A. Morchang Biochem [et al.] // Biophys Res Commun. - 2013. - Vol. 16; 438(1): 20-5.

12. Nitric oxide and redox mechanisms in the immune response // Journal of Leukocyte Biology. - 2011. - Vol. 89. - P. 873-891.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ

Абаленихина Юлия Владимировна - ассистент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.

Фомина Мария Алексеевна - канд. мед. наук, доцент кафедры биологической химии с курсом КЛД ФДПО ГБОУ ВПО РязГМУ Минздрава России, г. Рязань.