CC BY
43
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
ВЛИЯНИЕ МИНЕРАЛЬНЫХ И ОРГАНИЧЕСКИХ УДОБРЕНИЙ
на антиоксидантную емкость почв
О.И. КЛЯЙН, асп., м. н. с. Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха,
И В. НИКОЛАЕВ, асп., м. н. с. Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха, Н.А. КУЛИКОВА, с. н. с. Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха, факультет почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова, д-р биол. наук,
Е.В. СТЕПАНОВА, с. н. с. Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха, канд. биол. наук,
О.В. КОРОЛЕВА, проф. Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха, д-р биол. наук
В настоящее время установлено, что свободные радикалы широко представлены не только в биологических объектах, но также и в различных природных средах, включая почвы, где они являются одним из основных факторов, влияющих на скорость процессов биодеградации [4]. Поэтому антиоксидантная емкость (АОЕ) почв, с одной стороны, определяет разложение полимеров животного и растительного происхождения до подвижных легкодоступных форм, а с другой - возможность накопления в почве устойчивых к разложению органических веществ - гуминовых соединений. По существующим представлениям почвенные антиоксиданты могут быть представлены, главным образом, танинами, низкомолекулярными фенольными соединениями и гуминовыми веществами, однако окончательного мнения по этому вопросу еще не сложилось. Кроме того, неясным остается вопрос о влиянии на антиоксидантную емкость почв внешних факторов, в частности, внесения минеральных и органических удобрений. Целью настоящего исследования была сравнительная оценка влияния различных удобрений на АОЕ почвы, а также поиску взаимосвязи АОЕ с другими почвенными показателями.
Эксперименты проводили в условиях пахотного чернозема (Краснодарский край). В опытные делянки в апреле в качестве основного удобрения вносили аммиачную селитру (N34), Лигногумат (0,2 кг/га) и биопрепарат (150 мл/га). В качестве биопрепарата использовали культуральную жидкость гриба белой гнили Trametes hirsuta 075 (Wulf. Ex. Fr) Quel.,
klein [email protected]
являющегося продуцентом гуминоподобных веществ, которые, как уже говорилось выше, могут выступать в качестве природных антиоксидантов. В качестве возделываемой культуры использовали ячмень. Почвенные образцы для анализов АОЕ отбирали спустя 2 и 14 недель после внесения препаратов. Кроме того, анализ почвенных образцов проводили по показателям, которые, согласно существующим в литературе данным, могут быть взаимосвязаны с АОЕ почв: содержание фенольных веществ, полифенолоксидазная активность, пероксидазная активность и содержание органического углерода.
Экстракцию ферментов (полифено-локсидаза, пероксидаза) из почв осуществляли после тщательного отделения растительных остатков путем обработки 140 мМ натрий-фосфатным буфером (рН 7,10) в соотношении 1:10 (1 г почвы : 10 мл буфера). Для выделения ферментов получаемую суспензию непрерывно перемешивали на Rotamix (Elmi, Литва) со скоростью 90 об/мин в течение 24 ч при 25°С. Далее экстракты фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента». Полифенолоксидазную активность определяли спектрофотометрически при постоянной температуре 25°С с использованием в качестве субстрата сирингалдазина. Реакционная смесь содержала 2 мл 0,4 мМ сирингалдазина в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,50) и 100 мкл исследуемой пробы. Измерения проводили при длине волны 530 нм, кинетику окисления субстрата детектировали в течение 3 мин [5]. Для измерения пероксидазной активности в качестве субстрата использовали 2,2'азино-
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
109
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
Таблица
Влияние исследованных минеральных и органических удобрений
Время отбора, недели Контроль Аммиачная селитра Лигногумат Биопрепарат
АОЕ, мкмоль ТЭ/г
До обработки 3,81±0,03
2 3,51±0,03 5,39±0,45 5,86±0,32 3,88±0,27
14 4,71±0,04 5,54±0,024 5,32±0,08 4,56±0,10
ОСФ, мг ЭКГ/г
До обработки 0,420±0,007
2 0,427±0,07 0,615±0,016 0,818±0,013 0,473±0,007
14 0,554±0,002 0,671±0,010 0,578±0,003 0,533±0,003
Содержание органического углерода, %
До обработки 2,27±0,04
2 2,0±0,1 2,91±0,05 2,06±0,04 2,14±0,07
14 2,23±0,04 2,37±0,07 2,52±0,03 2,24±0,04
Полифенолоксидазная активность, МЕх103
До обработки 6,9±2,2
2 9,1±1,0 9,1±1,0 12±2,5 11,2±3,4
14 4,2±0,4 0,6±0,003 2,1±0,6 6,4±0,1
Пероксидазная активность, МЕх103
До обработки 2,1±0,1
2 2,0±0,1 2,2±0,2 2,2±0,2 1,9±0,1
14 5,4±0,1 5,3±0,1 5,2±0,1 20,7±0,1
бис(3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (АБТС) в концентрации 1,1 г/л АБТС в 0,1 М ацетатном буфере (рН 4,25). Реакционная смесь содержала 2 мл раствора субстрата и 50 мкл исследуемого образца, реакция инициировалась добавлением 5 мкл 3 %-ной перекиси водорода. Кинетику реакции детектировали в течение 3 мин по изменению оптической плотности при длине волны 436 нм. Ферментативную активность исследуемых образцов выражали в международных единицах активности (МЕ).
Экстракцию и определение фенольных соединений из почв проводили согласно методике [2]. Для экстракции фенольных компонентов навески почв массой около 3 г смешивались с 30 мл 1 М раствора гидроксида натрия и непрерывно перемешивались на Rotamix (Elmi, Литва) со скоростью 90 об/ мин. Полученные экстракты центрифугировали на Centrifuge 5702R (Eppendorf, Германия) в течение 10 мин со скоростью 4400 об/мин. Надосадочную жидкость отделяли, нейтрализовали до рН 7,00 соляной кислотой, раствор доводили до конечного объема 100 мл и очищали с помощью мембранных фильтров с диаметром пор 0,45 мкм. Полученный рас-
твор использовали для последующего анализа общего содержания фенольных веществ и АОЕ. АОЕ определяли по отношению к катион-радикалу АБТС согласно [3] и выражали в эквивалентах тролокса (ТЭ). Общее содержание фенольных веществ (ОСФ) выражали в эквивалентах галловой кислоты (ЭГК). Измерения проводили на спектрофотометре Carry Bio 100 UV-VIS (США). Результаты выражали в пересчете на сухой вес почвы. Содержание органического углерода в почвах определяли по модифицированному методу Тюрина [1].
Проведенные эксперименты показали, что в процессе эксперимента в почве наблюдался рост АОЕ во всех исследованных вариантах (таблица). Так, через две недели после внесения исследуемых препаратов АОЕ составляла 102-154 % от начальных значений этого показателя. Исключение составил контрольный вариант, где было отмечено снижение АОЕ до 92 %. Наибольший рост этого показателя (с 3,81±0,03 до 5,86±0,32 мкмоль/ ТЭ) был отмечен в варианте с внесением Лигногумата, что объясняется, по-видимому, высоким содержанием в нем фенолов. Действительно, ОСФ в этом варианте было максимальным и составляло 0,818±0,013 мг ЭКГ/г.
110
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
ЛЕСНАЯ СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ
Динамика содержания фенольных соединений показывает, что содержащиеся в Лигногумате органические вещества являются доступными для разложения. Как видно из данных, представленных в таблице, после первоначального роста ОСФ через 14 недель после внесения этот показатель снижался до 0,578±0,003 мг ЭКГ/г. При этом во всех остальных вариантах, включая контрольный, наблюдали устойчивый рост ОСФ, что свидетельствует о росте микробиологической активности почвы в течение вегетационного периода. Косвенным показателем отмеченного роста микробиологической активности является увеличение пероксидазной активности почв, также зарегистрированное для всех вариантов, включая вариант с Лигногуматом. Таким образом, сложная динамика АОЕ и ОСФ, наблюдаемая в варианте с внесением Лигногумата, обусловлена, с одной стороны, поступлением и разложением фенольных соединений, а с другой - ростом микробиологической активности почвы. При этом следует отметить, что аммиачная селитра обладала более пролонгированным положительным эффектом на микробиологическую активность почвы, чем Лигногумат. Через 14 недель после внесения препаратов АОЕ и ОСФ в варианте с аммиачной селитрой было выше, чем в варианте с Лигногуматом, тогда как в начале эксперимента наблюдали обратную зависимость. Скорее всего, это связано с тем, что аммиачная селитра содержит азот как в форме нитратов, обладающих большой подвижностью и высокой доступностью, так и в форме аммония, который первоначально интенсивно сорбируется почвенным поглощающим комплексом, теряя при этом подвижность в почвенном растворе, но оставаясь доступным для растений и микроорганизмов.
Наибольшая микробиологическая активность была отмечена через 14 недель после начала эксперимента в варианте с внесением Биопрепарата, где пероксидаз-ная активность достигала 20,7±0,1 МЕх103, что составило 986 % от начальных значений этого показателя. Тем не менее, содержание фенольных соединений и АОЕ в этом варианте значимо не отличались от контрольных
и были значительно меньше, чем в вариантах с внесением аммиачной селитры и Лигногу-мата (Таблица). Следует также отметить, что нами не было обнаружено взаимосвязи между АОЕ и другим показателем микробиологической деятельности - полифенолоксидазной активностью. Это свидетельствует о том, что микробиологическая активность почвы не является показателем, определяющим АОЕ.
Для установления зависимости между АОЕ и другими исследованными в работе почвенными показателями (содержание фенольных соединений, полифенолоксидазная и пероксидазная активность, содержание органического углерода) был проведен корреляционный анализ. Результаты показали, что единственная значимая (р < 0,05) прямая линейная взаимосвязь существует между АОЕ и содержанием фенольных соединений (рисунок). Это позволяет сделать вывод о непосредственном влиянии фенольных соединений на антиоксидантный свойства почв.
Особый интерес вызывает тот факт, что нами не было обнаружено взаимосвязи между АОЕ и содержанием органического углерода в почве. Это свидетельствует о том, что антиоксидантные свойства почв определяются не только количественным содержанием почвенного органического вещества, но также и его качественным составом.
Таким образом, проведенные исследования показали, что внесение как минеральных, так и органических удобрений приводит к значимому увеличению АОЕ почв. При этом использованное в работе минеральное удобрение (аммиачная селитра) обладает более пролонги-
8-,
АОЕ мкмоль ТЭ/г
642 — 0,2
: = 0,83.
• •
ОСФ, мг ЭГК/г
—I---------1----------1-----------1
0,4 0,6 0,8 1
Рисунок. Корреляционное поле пары переменных антиоксидантная емкость (АОЕ) - общее содержание фенольных веществ (ОСФ)
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 1/2012
111
