CC BY
66
УДК 616.24-006.6-092.9:615.277.3
О.В. Калинина1, Б. А. Фролов1, А. А.Штиль2, Н.М. Перетолчина2, З.С. Смирнова ВЛИЯНИЕ МИЛИАЦИНА НА ПРОТИВООПУХОЛЕВУЮ АКТИВНОСТЬ МЕТОТРЕКСАТА НА МОДЕЛИ ПЕРЕВИВАЕМОЙ КАРЦИНОМЫ ЛЕГКИХ ЛЬЮИС
'Оренбургская государственная медицинская академия, Оренбург 2Р0НЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва
Контактная информация:
Калинина Ольга Вячеславовна, ассистент кафедры патологической физиологии
адрес: 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6; тел. +7(3532)-77-96-07, факс +7(3532)-77-55-72
e-mail: olgakalina78@mail. ru
Статья поступила 27.05.2009, принята к печати 20.10.2009 Резюме
В эксперименте, выполненном на 63 мышах-самцах гибридов I поколения BDF1 (C57Bl/6*DBA/2), на модели перевиваемой карциномы легких Льюис изучено влияние тритерпеноида растительного происхождения - милиацина - на противоопухолевую активность метотрексата.
Установлено, что милиацин уменьшает токсическое действие метотрексата на организм мышей с опухолью LLC и повышает терапевтическую эффективность цитостатика по критериям торможения роста эпидермо-идной карциномы легких и увеличения продолжительности жизни опытных мышей по сравнению с контрольными животными.
Ключевые слова: метотрексат, тритерпеноиды, милиацин, карцинома легких Льюис.
O.V. Kalinina1, B.A. Frolov1, A.A. Shtil2, N.M. Peretolchina2, Z.S. Smirnova2
THE INFLUENCE OF MILIACIN ON ANTITUMORIGENIC ACTIVITY OF METOTREXATE ON THE MODEL OF TRANSPLANTED LLC
'Orenburg Medical Academy, Orenburg
2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center of RAMS, Moscow Abstract
We have studied the influence of triterpenoid of the plant origin - miliacin - on the antitumor activity of me-totrexate in the experiment on the 63 mice - males of the hybrids of the 1st generation BDFj (C57Bl/6*DBA/2) on the model of the transplanted carcinoma.
It was obtained that miliacin decreases the toxic effect of metotrexate in mice with the tumor LLC and increases the therapeutic effectiveness of citostatic according to the criteria of inhibition of growth of epidermoid lung carcinoma and the increasing life span of experimental animals in comparison with control ones.
Key words: methotrexate, triterpenoids, miliacin, lung Luice carcinoma.
Введение
Химиотерапия злокачественных опухолей является одним из основных методов лечения онкологических больных, однако применение противоопухолевых препаратов сопровождается выраженными побочными эффектами из-за их низкой избирательности действия [1; 7; 8]. Химиопрепараты оказывают повреждающее действие как на опухолевые, так и на нормальные клетки и ткани организма - костный мозг, лимфоидные органы, эпителий полости рта и желудочно-кишечного тракта, печень, волосяные фолликулы, репродуктивные органы. Как следствие указанных особенностей действия химиопрепаратов на организм к их побочным эффектам следует отнести миелодепрессию, диспептические расстройства, подавление реакций гуморального и клеточного иммунитета, функций репродуктивных органов, печени, алопецию. В связи с этим разработка подходов, направленных на уменьшение побочных эффектов химиотерапии, является актуальной задачей. В частности, для решения этой задачи используются тритер-пеновые соединения [2; 5; 10], обладающие широким спектром фармакологических свойств. К числу таких соединений относится милиацин, для которого показано выраженное иммунопротекторное и гепатопро-текторное действие при использовании в комбинации
с метотрексатом (МТХ) [4; 6]. Вместе с тем, уменьшение риска побочных эффектов химиотерапии может представлять практический интерес лишь в случае, если тритерпеноид не снижает противоопухолевого действия цитостатика. В связи с вышеизложенным, целью настоящей работы явилась оценка влияния милиацина на противоопухолевый эффект МТХ на эпидермоидной карциноме легких мышей.
Материалы и методы
Эксперименты проведены на 63 мышах-самцах гибридов I поколения BDFi (C57B1/6*DBA/2), полученных из питомника РАМН «Столбовая», массой 20-22 г. В качестве модели использовали перевиваемую эпидермоидную карциному легких Льюис.
Штамм карциномы Льюис получен из лаборатории экспериментальной терапии метастазов НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и поддерживался путем внутримышечных перевивок на мышах-самцах линии C57B1/6. Для проведения эксперимента опухолевую ткань измельчали ножницами до гомогенной консистенции, добавляли среду 199 (1:10) и по 0,5 мл полученной суспензии (-50 мг опухолевой массы) вводили п-к в область правой подмышечной впадины мышам-самцам BDF1. В работе использован штамм LLC третьего пассажа [11].
46 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ ВЛИЯНИЕ МИЛИАЦИНА НА...
После трансплантации опухолевых клеток LLC животные были разделены на четыре группы:
I - мыши (18 жив.) нелеченные (контроль);
II - мыши (15 жив.), получавшие через 48 ч после инокуляции опухоли внутрибрюшинно однократно МТХ (фирма Эбеве, Австрия) в дозе 10 мг/кг;
III - мыши (15 жив.), получавшие через 48 ч после перевивки опухоли МТХ с последующим 3-кратным введением растворителя милиацина - твина-21 в
0,9 %-ном р-ре хлорида натрия (1,6*10-7 моль/кг);
IV - мыши (15 жив.), получавшие через 48 ч после перевивки опухоли МТХ с последующим 3-кратным введением милиацина.
Милиацин и растворитель вводили внутрибрю-шинно через 60 мин, 24 и 48 ч после введения МТХ.
Милиацин получен из кристаллов просяного масла, выпадающих при его отстаивании на холоду. Очистку препарата проводили его перекристаллизацией из хлороформа. На основании масс-спектрометрии, данных ЯМР и ИК-спектроскопии, анализа хроматографической однородности и качественного состава выделенный препарат (рис. 1) отнесен к группе пента-циклических тритерпеноидов, имеющих структуру 3-Р-метоксигерманицена [9].
Рис. 1. Химическая структура пентациклического три-терпеноида - милиацина (Sß-метокси- 18-олеанена).
Критериями оценки противоопухолевого эффекта служили [11]:
Торможение роста опухоли (ТРО) Измеряли три максимальных взаимно перпендикулярных размера опухоли: длина (L), ширина (S), высота (H) у каждого животного и вычисляли объем (V)
V ( мм3) = L X S X H
и средний объем опухоли в группе. Измерение параметров опухоли проводили на 5; 7; 12; 17 и 19 сутки после введения МТХ.
Торможение роста опухоли вычисляли по формуле:
TPO(%) =
Vk - Vo Vk
■ XІ00, где
Ук - средний объем (мм3) опухолей в нелеченной группе (I); Уо - средний объем опухолей (мм3) в сравниваемых леченных группах (II, III, IV).
Увеличение продолжительности жизни (УПЖ) Сравнительную оценку противоопухолевого эффекта по продолжительности жизни нелеченных животных и животных сравниваемых леченных групп (II; III; IV) проводили после гибели всех жи-
вотных от опухолевого процесса, вычисляя среднюю продолжительность жизни (дни).
Увеличение продолжительности жизни рассчитывали по формуле:
УПЖ(%) :
СПЖо - СПЖк )
XІ00.
где
СПЖк
СПЖк - средняя продолжительность жизни животных в нелеченной группе, СПЖо - средняя продолжительность жизни животных в леченных группах.
Минимальные критерии активности:
1. торможение роста опухоли > 50%;
2. увеличение продолжительности жизни > 25%.
Токсичность препаратов оценивали по ранней гибели мышей в леченных группах по сравнению с гибелью нелеченных животных.
Результаты обрабатывали с использованием непараметрического критерия х2 и критерия Стью-дента [3]. Различия считали статистически достоверными при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Анализ динамики роста LLC (рис. 2) свидетельствует о том, что во всех группах у животных, получавших МТХ (II; III; IV), препарат вызывал замедление роста опухолей.
Рис. 2. Динамика роста опухоли LLC в исследуемых группах животных. *р < 0,05 достоверность по отношению к I группе.
Однако, если у животных, получавших только МТХ (группа II) или МТХ с растворителем (группа III), значимое ТРО наблюдали лишь на протяжении 7 суток после введения МТХ (ТРО = 77 %, 54 % и 83 %, 59 %, соответственно) (табл. 1), то у мышей IV группы, которым вводили МТХ + милиацин, значимое ТРО отмечали в течение всего периода наблюдения (ТРО = 91 %; 89 %; 84 %; 63 %; 60 % соответственно срокам измерения опухоли). Следует отметить, что даже на 19 сутки после лечения ТРО у мышей IV группы сохранялось высоким и соответствовало таковому у животных II и
III групп на 7 сутки после введения МТХ.
МТХ оказывал выраженное токсическое действие, вызывая гибель 33 % мышей (группа II) в течение первых 5 суток (табл. 2). При этом введение МТХ+растворителя (группа III) не оказывало влияния на токсичность МХТ. В то же время, милиацин (группа IV) существенно уменьшал токсическое действие МТХ, снижая показатель гибели мышей (по сравнению с группой II) в 2,5 раза. Эти результаты соответствуют ранее полученным данным [12] о защитном влиянии милиацина в условиях экстремальных воздействий на организм, включая воздействие токсических факторов.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ОНКОЛОГИЯ ВЛИЯНИЕ МИЛИАЦИНА НА... 47
Таблица 1
Влияние милиацина на противоопухолевый эффект метотрексата у мышей с ЬЬС
ТРО,%
№ группы Вводимые препараты Дни после введения метотрексата УПЖ,%
5 7 12 17 19
II МТХ 77* 54* 19** 0** 0** 9
III МТХ+ растворитель 83* 59* 43*** 13*** 12*** 0
IV МТХ+милиацин 91* 89* 84* 63* 60* 36
* р<0,05 - достоверные отличия относительно нелеченной группы (I); **р<0,05 - достоверные отличия относительно IV группы;
***р<0,05 - достоверные отличия относительно IV группы.
Таблица 2
Влияние милиацина на токсичность метотрексата у мышей ВРР1 с трансплантированной ЬЬС
№ Группы Группа животных п животных в группе Выживаемость животных в первые 5 суток после введения МТХ Гибель от токсичности, %
Погибшие (абс) Выжившие (абс)
I Контроль 18 0 18 0
II МТХ 15 5 10 33
III МТХ+растворитель 15 4 11 27
IV МТХ+милиацин 15 2 13 13
♦ I группа -■—II группа -А—III группа
■ -■х--- IVгруппа
сутки
Рис. 3. Динамика гибели мышей ВБР1 в исследуемых группах животных с ЬЬС в интервале с 23 по 41 сутки после трансплантации опухоли: *р<0,05 достоверность по отношению к I группе.
Снижение токсического действия МТХ под влиянием милиацина позволило получить высокий противоопухолевый эффект у выживших мышей (IV группа), леченных МТХ с последующим 3-х кратным введением милиацина.
Действие МТХ в комбинации с милиацином увеличило продолжительность жизни мышей, в среднем, на 36 % по сравнению с нелеченными животными (рис. 3), при этом значение УПЖ в этой группе мышей (см. табл. 1) было выше минимального статистически значимого критерия (25 %).
В то же время у мышей II и III групп не выявлено увеличения продолжительности жизни мышей с ЬЬС: 9 % и 0 % соответственно.
Таким образом, 3-кратное применение ми-лиацина после введения МТХ повышает противоопухолевую эффективность МТХ в отношении карциномы легких ЬЬС, снижая при этом острую летальную токсичность МТХ.
Полученные данные позволяют считать ми-лиацин эффективным органопротектором [4; 6], не снижающим противоопухолевую активность МТХ.
Выводы
1. Тритерпеноид растительного происхождения милиацин повышает терапевтическую эффективность МТХ, и их сочетанное применение вызывает высокое торможение роста ЬЬС в течение 12 дней после введения цитостатика - ТРО = 91-84 %, а также статистически значимое ТРО сохраняется в течение длительного периода наблюдения (на 19 сутки ТРО=60 %)
2. МТХ в сочетании с милиацином увеличивают продолжительность жизни мышей с ЬЬС на 36 %, в то время как МТХ в монотерапии - на 9 %.
3. МТХ в дозе 10 мг/кг при однократном в/б введении оказывает токсическое действие на мышей ББр! с ЬЬС, вызывая гибель 33 % жив. в течение первых 5 суток после его применения.
4. Милиацин уменьшает токсическое действие МТХ на организм мышей с опухолью ЬЬС, снижая гибель животных до 13 %.
Литература
1. Ветошкина Т.В., Дубская Т.Ю., Гольдберг В.Е. Ранние и отдаленные последствия токсического дей-
ствия на печень противоопухолевого препарата платины // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1997. Т. 60, № 4. С. 57-9.
2. Гольдберг Е.Д., Амосова Е.Н., Зуева Е.П. и др. Повышение эффективности химиотерапевтического и
хирургического методов лечения перевиваемых опухолей препаратами солодки // Бюлл. эксп. биол. мед. 2008. Т. 145, № 2. С. 213-7.
3. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медикобиологических исследованиях. - Ленинград: Медицина, 1973. - 141 с.
4. Железнова А.Д., Железнов Л.М., Штиль А.А. и др. Морфологические проявления защитного влияния милиацина в органах иммуногенеза при действии метотрексата // Бюлл. эксп. биол. мед. - 2007. Т. 144, № 10 С. 458-63.
5. Жукова Н.А., Семенов Д.Е., Сорокина И.В. и др. Влияние бетулоновой кислоты и ее производного [3-
оксо-20(29)-лупен-28-оил]-3-аминопропионовой кислоты на структуру печени мышей с лимфомой RLS // Бюлл. эксп. биол. мед. 2005. Т. 140, № 9. С. 348-51.
6. Калинина О.В., Красиков С.И, Шехтман А.М. и др. Гепатопротекторное действие милиацина при
токсическом поражении печени метотрексатом // Российский биотерапевтический журнал. 2009.
Т.8, № 1. С. 48-54.
7. Кинзирская Ю.А., Богуш Т.А., Остапчук Н.В. и др. Гепатотоксическое действие лекарственных препаратов некоторых фармакологических групп // Клиническая медицина. 2003. № 10. С. 11-6.
8. Молодых О.П., Лушникова Е.Л., Клинникова М.Г. и др. Структурная реорганизация печени крыс при цитотоксическом действии доксорубицина // Бюлл. эксп. биол. мед. 2006. Т. 141, № 5 С. 579-85.
9. Олифсон Л.Е., Осадчая Н.Д., Нузов Б.Г. и др. Химическая природа и биологическая активность милиацина // Вопросы питания. 1991. № 2. С. 57-9.
10. Разина Т.Г., Зуева Е.П., Амосова Е.Н. и др. Глицам как средство повышения эффективности химиотерапии и хирургического метода лечения экспериментальных опухолей // Вопросы онкологии. 1999. Т. 45, № 5. С. 554-6.
11. Трещалина Е.М., Жукова О. С., Герасимова Г.К. и др. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. Под ред. чл.-корр. РАМН проф. Р.У. Хаб-риева. - М.: Медицина, 2005. - С. 637-74.
12. Фролов Б.А., Панфилова Т.В., Штиль А.А. и др. Милиацин как иммунопротектор. Механизмы защитного влияния при иммуносупрессии в условиях воздействия на организм дестабилизирующих факторов: Актуальные вопросы теоретической и клинической медицины. Сборник научных трудов Оренбургской медицинской академии (Том ХХХ1). Под ред. проф. Б.А. Фролова. - Оренбург, 2005. -С. 167-9.
