CC BY
58
ИНСТИТУТ СИСТЕМНЫХ ИССЛЕДОВАНИИ ЛЕСА
6. Воларович, М.П. Исследование высокодисперсной фракции торфа / М.П. Воларович, Н.К. Ельницкая // Сб. Комплексное использование торфа. - М.: Недра, 1965.
7. Глебова, Г.И. Определение размера и формы частиц гумусовых кислот с помощью электронной микроскопии / Г.И. Глебова // Почвоведение. -1972. - № 7. - С. 115-119.
8. Федотов, Г.Н. Микрофазное расслоение в гумусовых системах / Г.Н. Федотов, Г.В. Добровольский, С.А. Шоба, Т.Ф. Рудометкина и др.// Доклады АН РФ. - 2009. - Т. 429. - № 3. - С.336-338.
9. Piccolo A. “The Supramolecular Structure of Humic Substances”. Soil Science. 2001. 166(11). pp. 810-832.
10. Schaumann G.E. Review Article Soil organic matter beyond molecular structure Part I: Macromolecular and supramolecular characteristics. J. Plant Nutr. Soil Sci. 2006, 169, pp. 145-156.
11. Sutton R, Sposito G. “Molecular structure in soil humic substances: The new view”. Environmental Science and Technology. 2005. 39. рр. 9009-9015.
12. Wilson M.A., Tran N.H., Milev A.S., Kannangara G.S.K., Volk H., Lu G.Q.M. Nanomaterials in soils. Geoderma, 2008. 146. рр. 291-302.
13. Nardi S., Arnoldi G. and Dell’Agnola G. Release of the hormone-like activities from Allophob-ora rosea (sav.) and Allophobora caliginosa (sav.) feces. CanJ. Soil Sci. 1988. 68. pp. 563-567.
14. Piccolo A., Nardi S. and Cancheri G. Structural characteristics of humic substances as related to nitrate uptake and growth regulation in plant systems. Soil Biol. Biochem. 1992. 24. pp. 373-380.
15. Piccolo A. S., Nardi and Cancheri G. Macromolecular changes of soil humic substances induced by interactions with organic acids. Eur. J. Soil Sci. 1996. 47. pp. 319-328.
16. Piccolo A. S., Nardi, and G. Cancheri. Micellelike conformation of humic substances as revealed by size-exclusion chromatography. Chemosphere. 1996. 33. pp. 595-600.
17. Piccolo A., Conte P. and Cozzolino A. Effects of mineral and monocarboxylic acids on the molecular association of dissolved humic substances. Eur. J. Soil Sci. 1999. 50. pp. 687-694.
18. Cozzolino A., Conte P., Piccolo A., 2001.
Conformational changes of humic substances induced by some hydroxy-, keto-, and sulfonic acids. Soil Biology and Biochemistry 33, 563-571.
19. Baalousha M., Motelica-Heino M., Galaup S., Le Coustumer P. Supramolecular structure of humic acids by TEM with improved sample preparation and staining”. Microscopy Research and Technique. 2005. 66(6). pp. 299 - 306.
20. Balnois E., WilkinsonK.J., 1999. Atomic force microscopy of humic substances: effects of pH and ionic strength. Environmental Science & Technology 33, 3911-3971.
21. Gerin P.A. and Dufrene Y.F. Native surface structure of natural soil particles determined by combining atomic force microscopy and X-ray photoelectron spectroscopy // Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2003, Vol. 28, Pages 295-305.
22. Heil D. and Sposito G. Organic Matter Role in Illitic Soil Colloids Flocculation: III. Scanning Force Microscopy Soil Sci. Soc. Am. J. 59 (1995), pp. 266-269.
ВЛИЯНИЕ МИКРОФАЗНОГО РАССЛОЕНИЯ ПОЧВЕННЫХ ГЕЛЕЙ НА БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ПОЧВ
Г.Н. ФЕДОТОВ, ст. научн. сотр. Института экологического почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, д-р биол. наук,
Т.Ф. РУДОМЕТКИНА, ст. научн. сотр. МГУЛ, канд. хим. наук
Ферменты - биологические катализаторы, ускоряющие в сотни и тысячи раз химические реакции в живых организмах. Разнообразные ферменты накапливаются в почве в результате жизнедеятельности почвенных микроорганизмов, мезофауны и корневой системы растений. Они участвуют в важных биохимических процессах [1].
Многие трудности при определении ферментативной активности в почвенных пробах обусловлены невозможностью освободить ферменты из почвенных частиц. Внеклеточные ферменты обычно связаны с
различными коллоидными фракциями почвы, с гуминовыми веществами и илами [2]. Активность фермента может уменьшаться в результате его взаимодействия с коллоидными частицами, которые затрудняют доступ субстрата к активному центру, а также в результате связывания субстрата.
Для того чтобы исключить влияние связывания субстрата в качестве изучаемого фермента, нами была выбрана каталаза. Этот фермент катализирует реакцию разложения пероксида водорода, который образуется в процессе дыхания живых организмов и в ре-
88
ЛЕСНОИ ВЕСТНИК 7/2010
ИНСТИТУТ СИСТЕМНЫХ ИССЛЕДОВАНИИ ЛЕСА
зультате различных биохимических реакций окисления органических веществ. Роль каталазы в почве заключается в том, что она разрушает ядовитый для организмов пероксид водорода.
Показано, что каталаза, как и многие другие ферменты, иммобилизуется гумусом [3-7]. Однако механизмы иммобилизации ферментов в почве до сих пор не выяснены. Ряд авторов [12, 13] считают, что органическое вещество в почве тесно связано с почвенными минералами и, следовательно, ферменты ассоциируются с органоминеральным комплексом.
В настоящее время гумусовые вещества рассматривают как набор супрамолекулярных соединений и ансамблей [14, 15]. Считается, что в подобных системах наноструктурная организация возникает при микрофазном расслоении супраполимерной гумусовой матрицы [8]. Это означает, что ферменты входят в состав супраполимерной гумусовой матрицы почв, и при микрофазном расслоении последней часть ферментов должна попасть в гидрофобные области, имеющие большую плотность. В результате активность ферментов должна уменьшиться как из-за стесненности условий, в которые они попадают, и соответствущего искажения их конформаций, так и из-за уменьшения их доступности для субстрата.
Результаты по изучению влияния обменных катионов на ферментативную активность почв [9-11] подтверждают эти предположения. Показано, что увеличение концентрации обменного алюминия ведет к понижению ферментативной активности, а, как известно, увеличение концентрации обменного алюминия усиливает микрофазное расслоение в гумусовых системах [8].
Целью работы являлась проверка влияния степени микрофазного расслоения в супраполимерной гумусовой матрице различных почв на их ферментативную активность.
Было изучено влияние концентрации обменных катионов алюминия, железа, меди и цинка в черноземе, дерново-подзолистой и серой лесной почвах.
Каталазную активность почв изучали при варьировании концентрации ионов метал-
лов до 10-15 % емкости катионного обмена. Сорбцию ионов металлов на почвах проводили из растворов с последующим отделением почв центрифугированием и высушиванием до воздушно-сухого состояния при 40 °С.
Измеряли каталазную активность почв по изменению концентрации пероксида водорода, добавленного в водную суспензию навески набухшей почвы, после встряхивания полученной суспензии в течение 30 мин. Для приготовления образцов набухших почв к 200 г растертых почв добавляли 36 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивали шпателем. Стаканы с почвами помещали в эксикатор, на дно которого было налито небольшое количество воды. Для предотвращения образования микрофлоры туда же помещали стаканчик с толуолом. Эксикаторы с почвами оставляли на срок не менее 1 недели для прохождения процесса набухания. После этого непосредственно перед исследованиями определяли влажность набухших почв.
Определение степени микрофазного расслоения почвенных гелей проводили, выделяя гели обработкой дистиллированной водой высушенных образцов, отобранных из гумусово-аккумулятивных горизонтов дерново-подзолистой почвы из окрестностей почвы р. Яхрома, серой лесной почвы Владимирского ополья и курского чернозема, до и после внесения в них модификаторов. Гелевые пленки, поднимающиеся на поверхности воды, помещали на атомно-гладкую поверхность слюды.
Исследование проводили при помощи растрового электронного микроскопа JEOL-6060A (фирмы JEOL, Япония) с вольфрамовым катодом. На образцы перед исследованием напыляли платину, используя установку JFC-1600 (фирмы JEOL, Япония).
В работе использовали также сканирующий туннельный микроскоп «ФемтоСкан» (фирмы ООО НПП «Центр перспективных технологий», Россия).
Исследование образцов при помощи электронной и туннельной микроскопий, показало, что при увеличении концентрации вводимых ионов металлов микрофазное расслоение в почвенных гелях усиливается. При этом каталазная активность почв уменьшается в несколько раз (рис. 1-3).
ЛЕСНОИ ВЕСТНИК 7/2010
89
Каталазная активность, мг/г я Каталазная активность, мг/г
ИНСТИТУТ СИСТЕМНЫХ ИССЛЕДОВАНИИ ЛЕСА
. 1. Каталазная активность дерново-подзолистой почвы в зависимости от количества внесенных в нее меди и цинка
Содержание элемента, мг/г
Рис. 2. Каталазная активность чернозема, дерново-подзолистой и серой лесной почв в зависимости от количества внесенного в них железа
90
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 7/2010
ИНСТИТУТ СИСТЕМНЫХ ИССЛЕДОВАНИИ ЛЕСА
Рис. 3. Каталазная активность чернозема, дерново-подзолистой и серой лесной почв в зависимости от количества внесенного в них алюминия
500 нм
Дерново-подзолистая почва Серая лесная почва Чернозем
Рис. 4. Изображение топографии поверхности гелей, выделенных из дерново-подзолистой и серой лесной почв и чернозема, полученное на туннельном микроскопе
ЛЕСНОЙ ВЕСТНИК 7/2010
91
ИНСТИТУТ СИСТЕМНЫХ ИССЛЕДОВАНИИ ЛЕСА
Обращает на себя внимание резкое уменьшение каталазной активности при небольшом количестве введенных металлов, а затем при дальнейшем увеличении концентрации добавок происходит более плавное ее снижение. Также меняется и микрофазное расслоение в почвенных гелях - сильно при небольших концентрациях, а затем изменения становятся менее значительными. Это подтверждается слабым уменьшением каталазной активности серой лесной почвы при введении ионов металлов по сравнению с черноземом и дерново-подзолистой почвой (рис. 1-3). Супраполимерная гумусовая матрица исходной серой лесной почвы оказалась уже достаточно сильно микрофазнорасслоен-ной (рис. 4), и введение ионов металлов оказывало на нее значительно меньшее влияние.
В случае иммобилизованных ферментов структурные изменения могут способствовать или препятствовать образованию связи фермент-субстрат. В результате вхождения в выделившуюся при микрофазном расслоении фазу каталаза может начать с ней взаимодействовать, что может привести к нарушению связей, стабилизирующих четвертичную структуру фермента. Модификация четвертичной структуры вызывает изменение трехмерной структуры активного центра, что в свою очередь препятствует молекулам субстрата и/или продукта свободно связываться с ферментом. Именно это может приводить к инактивации фермента.
Для каталазы маловероятно уменьшение скорости ферментативной реакции за счет затруднения доступа пероксида водорода к активному центру, но для других почвенных ферментов, которые образуют фермент-суб-стратные комплексы с крупными молекулами субстратов, замедление реакции по этому механизму может иметь большое значение.
Для ряда ферментов, таких как цел-люлаза, характерно не движение субстрата к ферменту, а обратная картина - движение фермента к молекулам субстрата. Поэтому некоторые внеклеточные ферменты должны быть способны проникать на участки с высокой концентрацией субстратов. Их закрепление при микрофазном расслоении может помешать такому перемещению.
Таким образом, можно предположить, что скорость различных ферментативных реакций при микрофазном расслоении будет уменьшаться по-разному, а, следовательно, по-разному будут изменяться условия существования различных микроорганизмов - активность одних будет подавляться в большей степени, чем других.
Проведенные исследования свидетельствуют, что микрофазное расслоение в супраполимерной гумусовой матрице, приводящее к уменьшению ферментативной активности почв, может оказать негативное влияние на ее биологическую активность при применении веществ, улучшающих структуру почвы, механизм действия которых основан на изменении наноструктурной организации супраполимерной гумусовой матрицы.
Библиографический список
1. Хазиев, Ф.Х. Ферментативная активность почв: метод. пос. / Ф.Х. Хазиев - М.: Наука, 1976. -180 с.
2. Тейт, Р. Органическое вещество почвы: Биологические и экологические аспекты / Р. Тейт. М.: Мир, 1991. - 400 с.
3. Тульская, Е.М. Роль органического вещества при иммобилизации ферментов / Е.М. Тульская // Вестник МГУ - Сер. 17. - 1982. - № 2. - С. 76-78.
4. Тульская, Е.М. Иммобилизация каталазы почвами / Е.М. Тульская, Д.Г. Звягинцев // Почвоведение, 1981. - № 12. - С. 91-96.
5. Тульская, Е.М. Влияние протеолитических ферментов на каталазу в почвах / Е.М. Тульская, Д.Г. Звягинцев // Почвоведение, 1981. - № 10. -С. 46-53.
6. Тульская, Е.М. Иммобилизация каталазы и специфика каталазной активности / Е.М. Тульская, Д.Г. Звягинцев // Почвоведение, 1980. - № 1. -С. 90-96.
7. Тульская, Е.М. Локализация и специфичность действия каталазы в почвах. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. канд. биол. наук / Е.М. Тульская. - М.: МГУ, 1980. - 24 с.
8. Федотов, Г.Н. Микрофазное расслоение в гумусовых системах / Федотов Г.Н., Добровольский Г.В., Шоба С.А., Рудометкина Т.Ф. и др. // Докл. АН РФ, 2009. - Т. 429. - № 3. - С. 336-338.
9. Абрамян, С.А. Влияние обменных катионов на ферментативную активность почв / С.А. Абрамян, А.Ш. Галстян // Биологический журнал Армении, 1981. - Т. 34. - № 2. - С. 142-148.
10. Абрамян, С.А. Ферментативная активность почв в зависимости от рН среды и состава обменных катионов. Автореферат дисс. на соискание уч. ст.
92
ЛЕСНОИ ВЕСТНИК 7/2010
