CC BY
47
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
РЕГУЛЯЦИЯ ИММУНИТЕТА
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2016 УДК 612.018.2.06:612.017.1:612.8].084
Шурлыгина А.В., Литвиненко Г.И., Гилинский М.А., Латышева Т.В., Мельникова Е.В., Тендитник М.В., Храпова М.В., Труфакин В.А.
ВЛИЯНИЕ МЕЛАТОНИНА НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУННОЙ И НЕРВНОЙ СИСТЕМ МЫШЕЙ ЛИНИЙ CBA И C57BL/6J ПРИ НАРУШЕНИИ СВЕТОВОГО РЕЖИМА
ФГБУ «Научно-исследовательский институт физиологии и фундаментальной медицины» Федерального агентства научных организаций, 630117, г. Новосибирск, Россия
Цель исследования - изучение влияния мелатонина (МТ) на иммунокомпетентные клетки и метаболизма моноаминов в гипоталамусе у мышей CBA (с высокой продукцией МТ) и C57BL/6J (с низкой продукцией МТ) при нарушении светового режима. Часть животных содержали 14 дней при круглосуточном освещении (КО), другая часть находилась при световом режиме 12 ч свет/12 ч темнота. С 7 по 14-е сутки эксперимента в питьевую воду добавляли мелатонин (0,01 мг на 1 г веса тела). Контрольные группы употребляли питьевую воду. На 15-е сутки животных забивали. В органах иммунной системы и крови определяли содержание различных субпопуляций Т- и В-клеток (CD3+, CD3+hi, CD4+8-, CD4-8+, CD4+8+, CD4+25+, CD19+) и лимфоцитов в различных фазах клеточного цикла методом проточной цитометрии. В гипоталамусе определяли содержание норадреналина, дофамина, серотонина и их метаболитов методом электрохимической детекции. Обнаружены межлинейные различия в реакции иммунных и нейрохимических показателей на КО и мелатонин. При КО у мышей СВА снижается количество В-клеток в крови и селезенке, а также содержание DOPAC, DOPAC/DA, 5HIAA/5HT в гипоталамусе. У мышей C57BL/6J повышается количество В-клеток в крови и селезенке, нейрохимические показатели не меняются. У мышей СВА, содержавшихся при КО, мелатонин не приводит к восстановлению нарушенных параметров иммунной системы, но нормализует метаболизм дофамина в гипоталамусе. У мышей C57BL/6J, находившихся при КО, мелатонин нормализует большинство иммунных показателей. Результаты работы свидетельствуют о том, что реакция иммунной системы и нейрохимических показателей головного мозга на изменение светового режима и применение МТ в определенной степени связана с генотипом.
Ключевые слова: световой режим; мыши CBA и C57BL/6J; лимфоциты; гипоталамус; моноамины; мелатонин.
Для цитирования: Шурлыгина А.В., Литвиненко Г.И., Гилинский М.А., Латышева Т.В., Мельникова Е.В., Тендитник М.В., Храпова М.В., Труфакин В.А. Влияние мелатонина на показатели иммунной и нервной систем мышей линий CBA и C57BL/6J при нарушении светового режима. Иммунология. 2016; 37(2): 68-75. DOI: 10.18821/0206-4952-201637-2-68-75
ShurlyginaA.V., Litvinenko G.I., GilinskiiM.A., Latysheva T.V., MelnikovaE.V., TenditnikM.V., KhrapovaM.V., Trufakin V.A. EFFECT OF MELATONIN ON IMMUNE AND NERVOUS SYSTEMS OF CBA AND C57BL/6J MICE UNDER DISTURBED LIGHTING CONDITIONS
Federal Agency of Scientific Organizations Federal State Scientific Institution "Research Institute of Physiology and Fundamental Medicine", 630117, Novosibirsk, Russia
The purpose of the research is to examine of the effect of melatonin (MT) on immunocompetent cells and monoamine metabolism in the hypothalamus of CBA mice (with high production of MT) and C57BL/6J mice (with low production of MT) upon the disturbance of lighing conditions. For 14 days part of the mice were exposed to constant lighting (12 h light/12 h light - LL), the other part of the mice were kept in 12 h light/12 h darkness lighting conditions (LD). From the 7th to the 14th day of the experiment, melatonin was added to the drinking water (0.01 mg per 1 g of body weight). The control group drank clean water. On the 15th day the animals were killed. The content of different subpopulations of T- and B-cells (CD3+, CD3+hi, CD4+8-, CD4-8+, CD4+8+, CD4+25+, CD19+) and lymphocytes in different phases of the cell cycle in the organs of the immune system and blood were determined by flow cytometry. The contents of noradrenaline, dopamine, serotonin, and their metabolites were determined in the hypothalamus by electrochemical detection. Interline differences in the response of immune and neurochemical indicators to LL and melatonin were discovered. In CBA mice under LL the number of B-cells in the blood and spleen, as well as the content of DOPAC, DOPAC/DA, 5HIAA/5HT in the hypothalamus decreased. In the C57BL/6J mice, the number of B-cells in the blood and spleen increased, while the neurochemical indicators remained the same. In the CBA mice which were kept under LL, melatonin did not lead to the restoration of the disordered parameters of the immune system, but led to normalization of dopamine metabolism in the hypothalamus. In the C57BL/6J mice which were exposed to LL, melatonin normalized most of the immune parameters. The results of the study indicate that the response of the immune system and monoamine metabolism of the brain to changes in light conditions and the use of MT is to some degree associated with genotype.
Keywords: lighting conditions; CBA and C57BL/6J mice; lymphocytes; hypothalamus; monoamines; melatonin.
Для корреспонденции: Шурлыгина Анна Вениаминовна - д-р мед. наук, проф., гл. науч. сотр. лаб. хронофизиологии, E-mail: [email protected];
ORIGINAL ARTICLE
For citation: ShurlyginaA.V., Litvinenko G.I., GilinskiiM.A., Latysheva T.V., MelnikovaE.V., TenditnikM.V., KhrapovaM.V., Trufakin V.A. Effect of melatonin on immune and nervous systems of CBA and C57BL/6J mice under disturbed lighting conditions. Immunologiya.2016; 37(2): 68-75. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-2-68-75
For correspondence: Shurlygina Anna V., Dr. med. Sciences, Professor, chief researcher of the laboratory of chronophysiology, E-mail: [email protected]
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Funding. The study had no sponsorship.
Received 02.07.15 Accepted 10.11.15
введение
Мелатонин (МТ) - гормон, продуцируемый шишковидной железой, регулирует ряд функций центральной и вегетативной нервной систем, эндокринных органов и иммунной системы, корректирует эндогенные ритмы относительно ритмов окружающей среды. Его хронобиологические свойства имеют значение при лечении различных циркадианных расстройств сна, например, при смене часовых поясов или при работе вахтовым методом на Севере [1]. Известно, что световой режим - один из самых сильных синхронизаторов суточных биологических ритмов у млекопитающих. Нарушение ритма чередования светлого и темного времени суток вызывает состояние десинхроно-за - рассогласования во времени физиологических процессов. Это является значительным стрессовым фактором, который приводит к увеличению риска развития психоэмоциональных нарушений (депрессии, тревожности), расстройств сна, иммунодефицитных состояний, аллергических и онкологических заболеваний [2-4]. Экзогенный МТ, вводимый в организм в вечернее время, способен нивелировать негативные последствия нарушения светового режима [5, 6].
Адаптация к жизни в условиях нарушенного светового режима и ее последствия для организма в значительной степени индивидуализированы. В последнее время установлено, что эти индивидуальные различия связаны с генотипом [7, 8].
Линейные лабораторные мыши являются удобной моделью для исследования влияния светового режима на связь «генотип - нервная и эндокринная системы - иммунологический статус». Обнаружено, что инверсия светового режима по-разному влияет на иммунные параметры мышей разных линий -C57BL/6J, Balb/c, A/J, CB6 F1 [9]. Мыши инбредных линий СВА и C57BL/6, широко использующиеся в экспериментах, являются оппозитными по ряду иммунных параметров поведенческих характеристик, стресс-реактивности [10-12]. Мыши СВА характеризуются высоким («нормальным»), а мыши c57Bl/6 - низким уровнем МТ за счет естественной мутации гена, кодирующего синтез арилалкиламин-N-ацетилтрансферазы (AA NAT), ключевого фермента превращения серотонина в МТ [13]. Однако роль генотипа в формировании программы ответа иммунной системы на нарушение светового режима и применение МТ пока остается малоизученной.
Цель данного исследования: изучение влияния МТ на субпопуляционный состав лимфоцитов перифе-
рической крови и органов иммунной системы, метаболизм моноаминов в гипоталамусе у мышей cBA и c57BL/6J при «нормальном» световом режиме и круглосуточном освещении (КО).
Материал и методы
В эксперименте использованы самцы мышей CBA и C57BL/6J в возрасте 4 мес, весом 26-30 г, родившиеся и содержавшиеся в виварии ФГБУ «Институт клинической иммунологии» (Новосибирск). Эксперимент проведен в весеннее (март) время года. Мыши содержались при постоянной температуре (22±2oC) на стандартной лабораторной диете со свободным доступом к пище и воде. МТ добавляли в питьевую воду в дозе 0,01 мг на 1 г веса тела. Животные были разделены на 8 групп по 7 особей в каждой: 1 и 2-я группы (контроль) - соответственно мыши линий cBA и c57BL/6J содержались 14 сут при световом режиме 12 ч свет:12 ч темнота (12:12); 3 и 4-я группы - мыши линий СВА и C57BL/6J находились при КО в течение 14 сут; 5 и 6-я группы - мыши линий CBA и C57BL/6J содержались 14 сут при световом режиме 12:12 с добавлением в питьевую воду МТ в течение последних 7 сут (12:12 + МТ); 7 и 8-я группы - мыши линии cBA и c57BL/6J содержались при КО в течение 14 сут с добавлением в питьевую воду МТ в течение последних 7 суток (КО + МТ). Все экспериментальные процедуры выполнены с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.
На 15-е сутки эксперимента животных взвешивали и забивали декапитацией под этаминаловым наркозом в утреннее время суток (с 10.00 до 12.00 ч). Забирали кровь из декапитационной раны, лимфоидные органы (тимус и селезенку). Органы взвешивали и вычисляли их весовые индексы по формуле a:b, где а - масса органа в мг, b - масса тела в г. Клеточную суспензию из органов готовили мягким раздавливанием в стеклянном гомогенизаторе. Подсчитывали количество ядросодержащих клеток в крови и в суспензии из лимфоидных органов с помощью камеры Горяева.
Субпопуляции лимфоцитов CD3+, CD3+h , CD4+8-, CD4-8+ , CD4+8+, CD4+25+, CD19+ в периферической крови, в тимусе и селезенке определяли с использованием моноклональных антител, меченных FITC и фикоэритрином (BD Pharmingen, США), на проточном цитофлуориметре FACSCantoII (Becton Dickinson, США).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Для оценки соотношения клеток в различных фазах клеточного цикла клеточную суспензию тимуса и селезенки дважды отмывали холодным фосфатно-солевым буфером (ФСБ, рН = 7,4) и фиксировали в 70% этаноле. Через час образцы центрифугировали и удаляли спирт. Фиксированные клетки инкубировали в 1 мл раствора пропидиума иодида (10 мкг/мл в ФСБ) и РНКазы (0,2 мг/мл) в течение 15 мин при комнатной температуре, а затем анализировали на проточном ци-тофлюориметре FACSCantoII.
В гипоталамусе определяли содержание нор-адреналина (noradrenaline, NA) дофамина (dopamine, DA), серотонина (5-hydroxytryptamine, 5-НТ), диок-сифенилуксусной кислоты (3,4-dihydroxyphenylacetic acid, DOPAC), 5-гидроксииндолуксусной кислоты (5-hydroxyindoleacetic acid, 5-HIAA) в соответствии с усовершенствованными методами, опубликованными ранее [14].
Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных программ для ПК «Statistica 7». С помощью модуля описательной статистики вычисляли среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку ^Е). Достоверность различий между группами оценивали по критерию Манна-Уитни. Статистически значимыми считали различия при р < 0,05.
результаты и обсуждение
Вес, весовые индексы тимуса и селезенки (табл. 1). Содержание при КО у мышей СВА не оказало влияния на весовые показатели органов иммунной системы, а у мышей C57BL/6J привело к снижению веса и индекса селезенки. У мышей линии СВА при световом режиме 12:12 МТ увеличил индекс тимуса и снизил индекс селезенки. Применение МТ у мышей СВА, содержавшихся при КО, напротив привело к снижению веса и индекса тимуса. У мышей линии С57BL/6J в
Таблица 1
вес и весовые индексы тимуса и селезенки мышей CBA и C57BL/6J при световом режиме 12:12, КО и введении МТ (М±£Б)
Линия мышей
CBA C57BL/6J
Показатель Световой режим
12:12 КО 12:12 КО
инт. МТ инт. МТ инт. МТ инт. МТ
n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7
Масса мыши (г) 27,91±0,92 28,10±0,86 29,54±0,68 27,79±0,91 26,89±0,87 28,25±0,67 25,93±0,60 25,43±0,75
Масса тимуса (мг) 33,17±5,87 34,43±3,01 33,29±1,55 27,17±0,83+ 42,57±3,95 50,43±3,04 45,71±3,60 46,71±4,81
Индекс тимуса 0,92±0,12 1,23±0,12* 1,13±0,05 0,92±0,06+ 1,58±0,14* 1,73±0,14 1,76±0,12 1,83±0,17
Масса селезенки (мг) 83,14±3,70 75,43±3,93 77,67±6,29 80,43±4,87 102,71±4,92* 90,29±3,67 79,29±3,84 о 108,86±15,66
Индекс селезенки 3,05±0,14 2,68±0,08* 2,59±0,21 2,92±0,21 3,83±0,18* 3,09±0,09 о 3,06±0,12 о 3,64±0,19 +
Примечание. Достоверные отличия (р < 0,05): * - от СВА интактные 12:12; + - от СВА и С57BL/6J КО; о - от С57BL/6J интактные 12:12, КО - круглосуточное освещение,
Таблица 2
Процентное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов в периферической крови мышей CBA и C57BL/6J при световом режиме 12:12, КО и употреблении ими МТ (M±SE)
Линия мышей
CBA C57BL/6J
Показатель Световой режим
12:12 КО 12:12 КО
инт. МТ инт. МТ инт. МТ инт. МТ
n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7
Количество лейкоци- 7,64±1,11 9,37±0,72 8,96±0,91 9,54±0,48* 12,24±1,59 * 9,12±0,95 16,66±0,91 13,59±2,14
тов в 1 мл (•Ю6)
% CD3+ 58,61±1,93 64,83±1,08* 63,06±1,04 63,30±1,44 36,54±1,16 * 31,50±0,97 о 32,83±1,27 о 30,79±2,50
% CD19+ 33,07±1,61 28,84±0,60 27,71±0,65* 28,37±1,44* 61,50±1,26* 64,80±0,96 о 64,00±1,34 65,30±2,72
% CD4+8- 38,92±2,08 40,17±0,79 42,67±1,05 42,67±1,16 21,66±1,00* 20,09±1,56 20,06±0,83 18,51±1,47
% CD4-8+ 18,75±0,30 24,40±1,36* 20,12±0,67 19,67±0,45 14,34±0,75* 11,79±0,35 о 12,01±0,34 о 11,51±0,83 о
% CD4+25+ 2,92±0,09 2,76±0,12 2,95±0,10 3,03±0,10 2,03±0,14* 1,77±0,14 2,14±0,08 1,80±0,16 +
CD3+ (106/мл) 4,41±0,57 6,08±0,49* 5,65±0,59 6,06±0,34 4,46±0,60 2,88±0,33 5,49±0,43 4,06±0,60
CD19+ (106/мл) 2,58±0,46 2,70±0,21 2,47±0,25 2,75±0,22 7,58±1,03* 5,90±0,6 10,64±0,57 о 8,98±1,66
CD4+8- (106/мл) 2,91±0,43 3,75±0,27 4,12±0,41 3,68±0,46 2,62±0,35 1,80±0,1 3,35±0,25 2,43±0,34 +
CD4-8+ (106/мл) 1,44±0,24 2,32±0,25* 1,91±0,13 1,87±0,13* 1,76±0,24 1,09±0,1 о 2,01±0,14 1,53±0,23
CD4+25+ (106/мл) 0,22±0,04 0,26±0,02* 0,28±0,03 0,29±0,01 0,25±0,04 0,16±0,02 0,36±0,03 о 0,24±0,04 +
Примечание. Достоверные отличия (р < 0,05): * - от СВА 12:12; + - от СВА и С57BL/6J КО; о - от С57BL/6J 12:12. КО - круглосуточное освещение.
ORIGINAL ARTICLE
Таблица 3
Клеточный состав тимуса мышей cBA и c57BL/6J при световом режиме 12:12, КО и употреблении МТ (M±SE)
Линия мышей
CBA I C57BL/6J
световой режим
показатель 12:12 КО 12:12 КО
инт. МТ инт. МТ инт. МТ инт. МТ
n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7 n = 7
Общее количе- 14,08±2,52 21,17±1,80* 69,86±15,69* 73,88±10,34* 105,52±12,97* 171,93±20,65 182,23±24,65 о 94,24±8,35 +
ство клеток в
тимусе (•lO6)
% CD3+ 78,23±1,74 75,59±1,02 73,07±4,09 78,24±1,80 64,94±1,08* 62,77±1,24 68,57±1,08 о 67,06±1,04
% CD3hi 17,11±1,49 16,22±0,63 15,51±0,73 19,19±1,12 + 12,01±0,54* 13,19±0,45 15,83±0,69 о 16,11±1,24 о
% CD4+8- 9,96±0,99 8,18±0,43 8,76±0,42 14,16±0,72 +* 6,93±0,54* 7,84±0,15 8,80±0,43 о 10,37±0,87 о
% CD4+8+ 84,30±1,60 86,45±0,71 82,83±2,33 77,43±1,78 +* 88,80±0,75* 88,70±0,24 86,99±0,59 о 84,89±1,05 о
% CD4-8+ 3,11±0,51 2,97±0,28 2,54±0,08 3,00±0,22 + 1,87±0,19* 1,59±0,10 2,24±0,17 1,96±0,18
CD3+ (106) 10,79±1,86 15,98±1,35* 40,50±5,90* 57,03±7,02* 68,38±8,21* 107,82±13,04 136,44±13,43 о 64,12±5,90 +
CD3hi (106) 1,96±0,39 3,94±0,52* 10,50±2,06* 14,05±1,86* 12,71±1,60* 22,62±2,82 о 28,15±3,49 о 15,78±1,64 +
CD4+8- (106) 1,17±0,24 1,74±0,11 5,98±1,23* 10,49±1,59 +* 7,33±1,01* 13,53±1,70 о 15,57±1,86 о 10,06±0,93 +
CD4+8+ (106) 12,02±2,16 18,81±1,87 37,39±4,51* 56,85±7,70 +* 93,71±11,56* 152,44±18,21 175,88±16,93 о 79,61±7,50 +
CD4-8+ (106) 0,41±0,08 0,65±0,10 1,74±0,35* 2,32±0,48* 1,97±0,29* 2,74±0,40 3,97±0,51 о 1,91±0,23 +
< 2n % 0,27±0,14 0,14±0,11 0,15±0,03 0,05±0,02 + 0,29±0,06 0,19±0,05 0,16±0,07 0,30±0,06
2n % 91,97±0,88 92,06±0,80 94,34±0,45 94,40±0,40* 96,67±0,30* 97,29±0,46 95,22±0,57 о 93,76±1,04 о
> 2n % 7,76±0,86 7,80±0,81 5,53±0,43 5,55±0,39* 3,04±0,32* 2,53±0,45 4,62±0,61 о 5,94±1,01 о
Примечание. Достоверные отличия (p < 0,05): * - от СВА интактные 12:12; + - от СВА и C57BL/6J КО; о - от C57BL/6J интактные 12:12.
КО - круглосуточное освещение; > 2п - гипердиплоидные клетки (фазы S+G2/M); 2п - диплоидные клетки в фазе G0/G1; < 2п - гиподипло-идные клетки (апоптоз).
группе 12:12+МТ снизился индекс селезенки, а в группе КО+МТ - повысился до уровня контроля индекс и вес органа.
Клеточный состав крови (табл. 2)
У животных линии СВА после содержания в условиях КО в крови снижалось процентное содержание CD19+ клеток. После применения МТ этот показатель оставался сниженным, общее количество лейкоцитов и абсолютное содержание CD4"8+ лимфоцитов в 1 мл крови снижалось по сравнению с контрольной группой. У мышей, содержавшихся при режиме освещения 12:12 МТ увеличивал процентное содержание CD3+, CD4-8+ и абсолютное количество CD3+, CD4-8+, CD4+25+ клеток.
У мышей линии C57BL/6J при содержании в условиях КО процентное содержание лимфоцитов CD3+, CD4"8+ в крови снижалось, а абсолютные уровни CD19+, CD4+25+ -возрастали. МТ снижал процентное содержание CD4"8+, нормализовывал процент CD3+ лимфоцитов и абсолютное количество CD19+, CD4+25+ клеток. При световом режиме 12:12 у мышей этой линии МТ снижал процент CD3+, CD4"8+ лимфоцитов, а процентное и абсолютное содержание CD19+ - увеличивал.
Клеточный состав тимуса (табл. 3).
У мышей линии СВА под влиянием КО увеличилось общее количество клеток в тимусе, а также абсолютный уровень всех исследованных субпопуляций тимоцитов. После употребления МТ животными, находившимися при КО, процентное содержание в тимусе дифференцированных клеток CD3+Ы, CD4"8+,
CD4+8" увеличилось, снизился процент незрелых Т-клеток (CD4+8+), повысилось абсолютное количество CD4+8", CD4+8+, снизился процент клеток в состоянии апоптоза (< 2п). По сравнению с контрольной группой в группе КО + МТ было снижено процентное содержание в тимусе CD4+8+ клеток, повышен процент CD4+8", абсолютное количество всех исследованных субпопуляций лимфоцитов осталось повышенным. При употреблении МТ мышами линии СВА, содержавшимися при световом режиме 12:12, изменения в клеточном составе тимуса были менее выражены: общее количество клеток в органе повысилось незначительно, увеличилось абсолютное содержание СD3+, СD3+Ы лимфоцитов.
У мышей линии C57BL/6J содержание при КО вызвало повышение процента зрелых субпопуляций тимоцитов (СD3+, СD3+hl, СD4"8+) и, соответственно, снижение процента дубль-позитивных клеток СD4+8+. Повысилось общее количество клеток в органе, абсолютное количество всех субпопуляций, процентное содержание клеток в активных фазах клеточного цикла (> 2п). Под влиянием МТ у животных этой линии, содержавшихся при КО, нормализовалось общее количество клеток в органе, абсолютное число СD3+, СD3+hl, СD4+8+, СD4-8+, процентное содержание СD3+ лимфоцитов. Однако относительные уровни СD3+hl, СD4+8", увеличенные при КО, повысились до более высоких цифр. Остался сниженным, как и при КО, процент СD4+8+ клеток. При световом режиме 12:12 МТ повысил только абсолютное содержание в тимусе СD3+hl, СD4+8- лимфоцитов.
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Таблица 4
Процентное и абсолютное содержание субпопуляций лимфоцитов в селезенке мышей линий CBA и C57/BL6 при световом режиме 12:12, КО и применении МТ (М±££)
Показатель
Линия мышей
СВА
С57BL/6J
световой режим
12:12 КО 12:12 КО
инт. МТ инт. МТ инт. МТ инт. МТ
п = 7 п = 7 п = 7 п = 7 п = 7 п = 7 п = 7 п = 7
Общее количе- 33,17±3,01 20,40±1,17* 118,57±25,03* 112,50±13,15* 79,64±7,78* 117,14±11,42 208,00±18,19 о 93,57±14,11 +
ство клеток в
селезенке (•Ю6)
% СD3+ 39,07±0,71 42,46±1,46* 40,14±0,55 35,69±1,42*+ 35,30±0,51* 32,37±1,19 33,30±0,51 о 28,00±1,55 + о
% СD19+ 52,97±0,81 50,80±1,36 49,00±1,23 50,90±1,14 54,06±1,07 59,01±0,72 о 59,43±0,61 о 58,37±2,25
% СD4+8- 25,07±0,61 26,27±0,82 26,51±0,35 25,40±1,02 20,99±0,39* 20,41±0,43 20,59±0,44 18,23±1,20 о
% СD4"8+ 14,44±0,50 15,51±0,78 13,94±0,46 11,27±0,26*+ 14,03±0,34 11,13±0,46 о 11,87±0,39 о 8,47±0,75 + о
%СD4+25+ 2,70±0,09 2,81±0,08 2,77±0,07 2,84±0,13 2,93±0,08 2,61±0,10 о 3,04±0,10 2,64±0,25
СD3+ (106) 12,89±1,01 8,62±0,47* 38,65±5,80* 40,12±4,66* 28,23±2,95* 37,86±3,87 69,78±6,09 о 27,84±4,70 +
СD19+ (106) 17,62±1,78 10,41±0,77* 46,66±7,13* 56,65±5,87* 43,07±4,35* 69,14±6,69 о 123,24±10,22 о 53,16±6,43 +
СD4+8- (106) 8,26±0,63 5,33±0,28* 25,45±3,60* 28,72±3,63* 16,82±1,84* 23,78±2,12 о 43,52±4,14 о 18,17±3,21 +
СD4"8+ (106) 4,79±0,45 3,14±0,18* 16,32±3,34* 12,66±1,50* 11,19±1,11* 13,01±1,33 25,37±1,95 о 9,04±1,45 +
СD4+25+ (106) 0,88±0,06 0,57±0,03* 3,25±0,66* 3,21±0,42* 2,34±0,25* 3,11±0,37 4,84±1,03 2,58±0,55
< 2п % 0,37±0,12 0,29±0,07 0,25±0,04 0,14±0,02*+ 0,56±0,09 0,19±0,06 о 0,22±0,03 о 0,30±0,10
2п % 97,10±0,15 97,69±0,12* 97,37±0,47 97,09±0,15 95,63±0,39* 96,83±0,11 о 96,24±0,35 93,83±1,45 +
> 2п % 2,53±0,11 2,03±0,14* 2,00±0,25 2,77±0,15 + 3,81±0,36* 2,99±0,10 3,57±0,31 4,42±0,38
Примечание. Достоверные отличия (р < 0,05): * - от СВА интактные 12:12; + - от СВА и С57ВЬШ КО; о - от С57ВЬ^ интактные 12:12. КО - круглосуточное освещение; > 2п - гипердиплоидные клетки (фазы S+G2/M); 2п - диплоидные клетки в фазе G0/G1; < 2п - гиподипло-идные клетки (апоптоз)..
Клеточный состав селезенки (табл. 4)
У мышей линии СВА под влиянием КО в селезенке повышалось общее количество клеток и абсолютное содержание СD3+, СD19+, СD4+8-, СD4-8+, СD4+25+ спленоцитов. В группе КО + МТ общее количество клеток в органе и абсолютное содержание СD3+, СD19+, СD4+8-, СD4-8+, СD4+25+ лимфоцитов оставались повышенным, процентное содержание СD3+, СD4"8+ лимфоцитов снижалось по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы. МТ также снижал процент гиподиплоидных клеток (< 2п) и повышал пролиферативную активность спленоцитов (процент клеток в фазе S + 02/М, > 2п), которая однако не превышала аналогичный показатель контрольной группы. У мышей линии СВА, находившихся при освещении 12:12, МТ оказывал противоположное действие: у них снижалось и общее количество клеток в селезенке, и абсолютное содержание СD3+, СD19+, СD4+8-, СD4-8+, СD4+25+ лимфоцитов, возрастал процент СD3+ спленоцитов, снижался процент клеток в активных фазах клеточного цикла (> 2п).
У мышей линии C57BL/6Jпосле содержания в условиях КО процент СD3+, СD4"8+ спленоцитов снизился, а общее количество клеток в селезенке, абсолютное количество СD3+, СD19+, СD4+8-, СD4-8+ и процент СD19+ лимфоцитов увеличились, снизился процент клеток в состоянии апоптоза (< 2п). Под влиянием
МТ у животных, находившихся при КО, снизилось до уровня контроля общее количество клеток в органе и абсолютное количество СD3+, СD19+, СD4+8-, СD4-8+ клеток. Процентное содержание СD3+, СD4+8-, СD4-8+ уменьшилось и стало ниже, чем в контрольной группе, нормализовались процент СD19+ клеток и содержание клеток в фазах апоптоза (< 2п) и 00/01 (2п). При световом режиме 12:12 у животных этой линии под влиянием МТ увеличились процентное и абсолютное содержание СD19+ лимфоцитов, абсолютный уровень СD4+8-, снизился процент СD4-8+, СD4+25+ лимфоцитов, процент клеток в стадии апоптоза (< 2п), повысился процент клеток фазе 00/01 (2п).
Уровень норадреналина, дофамина, серотонина и их метаболитов в гипоталамусе
Межлинейные различия в нейромедиаторном спектре гипоталамуса проявлялись в разной степени у мышей, находившихся при световом режиме 12:12 и при круглосуточном освещении (КО). При режиме 12:12 у мышей С57ВЬ^ по сравнению с мышами СВА оказались сниженными уровень DOPAС и отношение 5Н1АА/5НТ в гипоталамусе. При КО количество межлинейных различий возрастало: у мышей С57ВЬ^ по сравнению с мышами СВА оказался сниженным уровень МА и DA, но более высоким - содержание DOPAС и отношения DOPAС/DA (рис. 1).
У мышей СВА под влиянием КО происходило снижение DOPAС и соотношения 5Н1АА/5НТ. У мышей
1400,0000-, 1200,00001000,0000800,0000600,0000400,0000 -200,0000 -0,0000 -
NA,
ng/g
DOPAC,
DA,
ng/g
ng/g
□ CBA и ht. CT
5HIAA,
ng/g
5HT,
ng/g
0,9000 и 0,8000 -0,7000 -0,6000 -0,5000 -0,4000 -0,3000 -0,2000 -0,10000,0000 -
ORIGINAL ARTICLE
DOPAC/DA ng/g 5HIAA/5HT ng/g
C57BL/6J CT инт.
I CBA инт. КО
C57BL/6J КО
Рис. 1. Межлинейные различия содержания моноаминов в гипоталамусе мышей CBA и C57BL/6J при световом режиме 12:12 (СТ) и круглосуточном освещении (КО). * - достоверные отличия от СВА при световом режиме 12:12 (р < 0,05); о - достоверные отличия от СВА при КО (р < 0,05). Вертикальные линии - стандартная ошибка (SE).
С57BL/6J КО не влиял на исследованные показатели. МТ при световом режиме 12:12 у мышей СВА снижал уровень DOPAС, а при КО - нормализовывал количество DOPAС и повышал соотношение DOPAС/DA.
У мышей C57BL/6J при световом режиме 12:12 МТ снижал DOPAС, 5НТ и соотношение DOPAС/DA, а при КО - не влиял на содержание моноаминов и их метаболитов (рис. 2).
Таким образом, в настоящем исследовании продемонстрированы различия в реакции иммунной системы и моноаминов гипоталамуса мышей разных генотипов (С57BL/6J - мелатонин-дефицитных и СВА - с высокой продукцией мелатонина) на нарушение светового режима (КО) и на применение МТ в условиях различного светового режима.
У мышей линии СВА КО вызывало снижение процента В-клеток в крови, повышение цитоза тимуса и селезенки и абсолютного количества всех субпопуляций спленоцитов без усиления пролиферации, что позволяет предположить либо усиленную миграцию клеток в органы, либо задержку в них клеток. Причиной этого может быть повышение уровня кортикостерона, возникающее в данной экспериментальной ситуации, которая является стрес-сорным фактором [15]. Повышение кортикостерона может быть также следствием подавления синтеза мелатонина в условиях КО [16], когда отменяется его антиглюкокортикоидный эффект [17]. Это предположение подтверждается данными литературы о том, что при высоких концентрациях эндогенного кортикостерона у мышей (в фазе физической активности) возрастает количество клеток в тимусе, селезенке и лимфатических узлах [18]. В изменения клеточного состава органов иммунной системы при КО, вероятно, вносят вклад и нейрохимические сдвиги в гипоталамусе, которые могут быть обу-
словлены дисфункцией молекулярного механизма циркадных часов в супрахиазматических ядрах (СХЯ) гипоталамуса [19], приводящей к нарушению митохондриального синтеза МАОа - одного из ключевых ферментов деградации дофамина и серо-тонина [20].
Употребление с питьевой водой МТ при световом режиме 12:12 у мышей СВА приводило к повышению процента Т-клеток в периферической крови и селезенке и к снижению абсолютного количества и пролиферации спленоцитов. При этом МТ снижал DOPAС в гипоталамусе, что соответствует данным М. Badruzzaman и соавт. [21]. В связи с имеющимися сведениями об иммуностимулирующем действии DA-системы мозга [22] можно предполагать, что супрессия пролиферации спленоцитов связана с угнетением метаболизма DA. В тимусе под влиянием МТ происходит увеличение количества более дифференцированных Т-клеток, вероятно, в связи с непосредственным влиянием гормона на центральный Т-лимфопоэз, так как именно на Т-лимфоцитах определяется высокая плотность МТ-рецепторов [23]. Применение МТ у мышей СВА, находившихся в условиях КО, наблюдалась тенденция к нормализации иммунных реакций и метаболизма DA в гипоталамусе, что может отражать восстановление функциональной активности нейронов СХЯ и их взаимодействий с дофаминовой системой мозга
[19, 20].
У мышей C57BL/6J в противоположность мышам СВА при КО повышалась доля В-клеток и в периферической крови, и в селезенке. В отличие от мышей СВА тимус животных С57BL/6J реагировал на КО повышением процента дифференцированных и снижением доли незрелых субпопуляций, а также повышением пролиферации. Возможно, определенную
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
1600,0000 П
м, пд/д
РОРАС, пд/д
СВА инт. СТ СВА инт. КО
РА,
пд/д
' 5Н1АА, 1 пд/д
СВАСТ+МТ СВАКО+МТ
5НТ,
пд/д
1200,000 П 1000,000800,000600,000400,000200,000-
0,000
1
МА,
пд/д
1
ООРАС,
пд/д
С57В1_/би СТ инт. С57В1_/би КО
о/к, пд/д
5Н1АА,
пд/д
5НТ,
пд/д
С57В1-ЛУ СТ+МТ С57В^ КО+МТ
ООРАСЮА пд/д
[ I СВА инт. СТ Ш СВА инт. КО
5Н1АА/5НТ пд/д
| СВАСТ+МТ 1 СВАКО+МТ
0,900 -| 0,800 -0,700 -0,600 -0,500 -0,400 -0,300 -0,200 -0,100 -0,000 -
ООРАСЮА пд/д
| С57В1_^ СТ инт. Я С57Виби КО
5Н1АА/5НТ пд/д
3 С57В1_^ СТ+МТ 1 С57В1_/би КО+МТ
Рис. 2. Влияние мелатонина на содержание моноаминов в гипоталамусе мышей СВА и С57ВЬ/6.Г. * - достоверные отличия (р < 0,05) от СВА при световом режиме 12:12 (СТ); о - достоверные отличия (р < 0,05) от СВА при круглосуточном освещении (КО); х - достоверные отличия (р < 0,05) от С57ВЬ/6. при световом режиме 12:12 (СТ). Вертикальные линии - стандартная ошибка ^Е).
роль здесь так же, как и у мышей СВА, играет угнетение активности нейронов СХЯ в условиях КО [19], которые могут оказывать влияние на функции органов иммунной системы через норадренергические терминали, обнаруженные в тимусе и селезенке [24].
Таким образом, результаты настоящей работы свидетельствуют о связи с генотипом реакции иммунной системы и нейрохимических показателей головного мозга на изменение светового режима. Эффекты МТ также оказались связанными и с генотипом, и со световым режимом, при котором находились животные. Полученные данные позволяют предполагать наличие многокомпонентного механизма влияния циркадианной системы на иммунитет и нейрохимические структуры головного мозга.
Не исключено, в зависимости от генотипа, исходного уровня продукции МТ, наличия или отсутствия десинхронизирующего фактора реализуются различные пути нейроиммунной регуляции. Эти механизмы пока не ясны, но результаты настоящего исследования позволяют говорить о необходимости разработки персонифицированных подходов к применению МТ в лечебных целях в зависимости от индивидуального уровня его продукции и наличия десинхронизирующих факторов (например, сменная работа, трансмеридианные перемещения) в жизненной схеме конкретного пациента.
Исследование не имело спонсорской поддержки.
Автор заявляет об отсутствии конфликта интересов.
литература
10. Дубровина Н.И., Зиновьев Д.Р., Зиновьева Д.В. Угашение условной реакции пассивного избегания у мышей разных линий. Журн. высш. нервн. деят. 2010; 60 (6): 712-8.
11. Потапова О.В., Черданцева Л.А., Шаркова Т.В., Шкурупий В.А., Лузгина Н.Г., Ковнер А.В. Морфофункциональные особенности легочных макрофагов у мышей оппозитных линий СВА и С57В1^. Фундаментальные исследования. 2010; 10: 34-9.
14. Гилинский М.А., Кумарев В.П. Электрохимический способ определения моноаминов мозга. Физиол. журн. СССР. 1985; 71 (10): 1302-5.
18. Труфакин В.А., Шурлыгина А.В., Дергачева Т.И., Литвиненко Г.И., Вербицкая Л.В. Хронобиология иммунной системы. Вестник РАМН. 1999; (4): 40-4.
22. Девойно Л.В., Идова Г.В., Альперина Е.Л., Чейдо М.А., Давыдова С.М., Геворгян М.М. Нейромедиаторные системы мозга в модуляции иммунной реакции (дофамин, серотонин, ГАМК). Нейроиммунология. 2005; 3 (1): 11-8.
references
1. Pandi-Perumal S.R., Srinivasan V., Maestroni G.J.M., Cardinali
D.P., Poeggeler В., Hardeland R. Melatonin Nature's most versatile biological signal? FEBS Journal. 2006; 273 (13): 2813-38.
2. Karatsoreos I.N. Links between circadian rhythms and psychiatric disease. Front. Behav. Neurosci. 2014; 8: 162. eCollection 2014.
3. Monsees G.M., Kraft P., Hankinson S.E., Hunter D.J., Schernhammer
E.S. Circadian genes and breast cancer susceptibility in rotating shift workers. Int. J. Cancer. 2012; 131 (11): 2547-52.
4. Monteleone P., Martiadis V., Maj M. Circadian rhythms and treatment implications in depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 2011; 35 (7): 1569-74.
5. Schulz P., Steimer T. Neurobiology of circadian systems. CNS Drugs. 2009; 23 (Suppl. 2): 3-13.
6. Schernhammer E.S., Schulmeister K. Melatonin and cancer risk: does light at night compromise physiologic cancer protection by lowering serum melatonin levels? Br. J. Cancer. 2004; 90 (5): 941-3.
7. Rabstein S., Harth V., Justenhoven C., Pesch B., Plottner S., Heinze E. et al. GENICA Consortium. Polymorphisms in circadian genes, night work and breast cancer: results from the GENICA study. Chronobiol. Int. 2014; 31 (10): 1115-22.
8. Grundy A., Schuetz J.M., Lai A.S., Janoo-Gilani R., Leach S., Burstyn I. et al. Shift work, circadian gene variants and risk of breast cancer. Cancer Epidemiol. 2013; 37 (5): 606-12.
9. Peleg L., Nesbitt M.N., Ashkenazi I.E. Strain dependent response of circadian rhythms during exposure to continuous illumination. Life Sci. 1989; 44 (13): 893-900.
10. Dubrovina N.I., Zinov'ev D.R., Zinov'eva D.V. Extinction and the
ORIGINAL ARTICLE
conditional reaction of passive avoidance in mice of different lines. Zurn. vysshey nervnoy deyatel'nosti. 2010; 60 (6): 712—8.
11. Potapova O.V., Cherdantseva L.A., Sharkova T.V., Shkurupiy V.A., Luzgina N.G., Kovner A.V. Morphofunctional characteristics of pulmonary macrophages in mice opposing lines CBA and C57BL/6J. Fundamental'nye issledovaniya. 2010; 10: 34—9.
12. Kazdoba T.M., Del Vecchio R.A., Hyde L.A. Automated evaluation of sensitivity to foot shock in mice: inbred strain differences and pharmacological validation. Behav. Pharmacol. 2007; 18 (2): 89-102.
13. Kennaway D.J., Voultsios A., Varcoe T.J., Moyer R.W. Melatonin in mice: rhythms, response to light, adrenergic stimulation, and metabolism. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 2002; 282 (2): 358-65.
14. Gilinskiy M.A., Kumarev V.P. Electrochemical method of determination of monoamines in the brain. Fisiol. zhurn. SSSR. 1985; 71 (10): 1302-5.
15. Rahman S.A., Kollara A., Brown T.J., Casper R.F. Selectively filtering short wavelengths attenuates the disruptive effects of nocturnal light on endocrine and molecular circadian phase markers in rats. Endocrinology. 2008; 149 (12): 6125-35.
16. Stevens R.G. Artificial lighting in the industrialized world: circadian disruption and breast cancer. Cancer Causes Control. 2006; 17 (4): 501-7.
17. Campino C., Valenzuela F., Arteaga E. et al. Melatonin reduces cortisol response to ACTH in humans. Rev. Med. Chil. 2008; 136 (11): 1390-7.
18. Trufakin V.A., Shurlygina A.V., Dergacheva T.I., Litvinenko G.I., Verbitskaya L.V. Chronobiology of the immune system. Vestnik RAMN. 1999; (4): 40--4.
19. Tapia-Osorio A., Salgado-Delgado R., Angeles-Castellanos M., Escobar C. Disruption of circadian rhythms due to chronic constant light leads to depressive and anxiety-like behaviors in the rat. Behav. Brain Res. 2013; 252: 1-9.
20. Hampp G., Albrecht U. The circadian clock and mood-related behavior. Commun. Integr. Biol. 2008; 1 (1): 1-3.
21. Badruzzaman M., Bapary M.A., Takemura A. Possible roles of pho-toperiod and melatonin in reproductive activity via changes in dop-aminergic activity in the brain of a tropical damselfish, Chrysiptera cyanea. Gen. Comp. Endocrinol. 2013; 194: 240-7.
22. Devoyno L.V., Idova G.V., Al'perina E.L., Cheydo M.A., Davydova S.M., Gevorgyan M.M. Neurotransmitter systems in the brain in modulating immune responses (dopamine, serotonin, GABA). Ney-roimmunologiya. 2005; 3 (1): 11—8.
23. Rafiielidrissi M., Calvo J.R., Harmauch A. Interconnection thymus and epiphysis. J. Neuroimmunol. 1998; 86 (2): 190-7.
24. Logan R.W., Arjona A., Sarkar D.K. Role of sympathetic nervous system in the entrainment of circadian natural-killer cell function. Brain Behav. Immun. 2011; 25 (1): 101-19.
Поступила 02.07.15 Принята к печати 10.11.15
