CC BY
56
ISSN 2304-9081
Учредители: Уральское отделение РАН Оренбургский научный центр УрО РАН
Бюллетень Оренбургского научного центра
УрО РАН
2015 * № 3
Электронный журнал On-line версия журнала на сайте http://www.elmag.uran.ru
© Коллектив авторов, 2015 УДК 579.22
Н.И. Романов, С.А. Аленъкина, В.Е. Никитина
ВЛИЯНИЕ ЛЕКТИНОВ ЭНДОФИТНОГО И ЭПИФИТНОГО ШТАММОВ АЗОСПИРИЛЛ НА АКТИВНОСТЬ ПЕКТОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ РАСТИТЕЛЬНОЙ КЛЕТКИ
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН, Саратов, Россия
Цель. Сравнительная оценка способности лектинов A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245 оказывать регулирующее воздействие на активность пектинолитических ферментов в корнях проростков пшеницы.
Материалы и методы. Использованы спектрофотометрические методы определения активности полигалактуроназы, пектатлиазы и пектинэстеразы в клетках корней проростков пшеницы.
Резулътаты. Лектины азоспирилл способны вызывать индукцию пектинразру-шающих ферментов самих растений, являющихся одним из основных факторов, способствующих разрушению клеточных стенок и внедрению микроорганизмов в ткани растения.
Заключение. Полученные результаты дают основания полагать, что лектины азоспирилл могут вызывать индукцию защитных механизмов растений, что в сочетании с ро-стстимулирующим эффектом бактерий способствует формированию устойчивости и продуктивности растений.
Ключевые слова: ризосфера, ассоциативная азотфиксация, лектины азоспирилл, корни проростков пшеницы, пектолитические ферменты
N.I. Romanov, S.A. Alen 'kina, V.E. Nikitina
EFFECT OF THE LECTINS OF AN ENDOPHYTIC AND AN EPIPHYTIC AZOSPIRILLUM STRAINS ON THE PECTOLYTIC ENZYME ACTIVITY OF THE PLANT CELL
Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms RАS, Saratov Russia
Objective. The aim of this work was to comparatively evaluate the ability of lectins from Azospirillum brasilense Sp7 and A. brasilense Sp245 to regulate pectolytic enzyme activity in wheat seedling roots.
Materials and methods. Spectrophotometry methods were used to determine the activities of polygalacturonase, pectatelyase, and pectinesterase in the cells of wheat seedling roots.
Results. Azospirillum lectins are capable of inducing pectin-degrading enzymes in plants themselves, which are some of the principal factors contributing to cell wall degradation and microorganism entry into plant tissues.
Conclusions. The obtained results suggest that Azospirillum lectins can induce plant defense mechanisms, which, in combination with the plant-growth-promoting effect, is conducive to better plant resistance and productivity.
Keywords: Rhizosphere, аssociative nitrogen fixation, Azospirillum, lectins, wheat roots, pectolytic enzymes.
Введение
Бактерии рода Azospirillum (альфа-субкласс протеобактерий) известны много лет как улучшающие рост растений ризобактерии (plant growth promoting rhizobacteria - PGPR) [1].
Бактерии обладают рядом очень важных свойств для эффективного ассоциативного взаимодействия с растениями: способностью к азотфиксации, продукции фитогормонов, солюбилизации фосфатов, улучшению водного и минерального статуса, продукции ряда соединений, увеличивающих мембранную активность и пролиферацию тканей корневой системы, уменьшению влияния стрессоров на растение и осуществлению контроля многочисленных фитопатогенов [2]. Они были изолированы из ризосферы многих трав и злаков, произрастающих как в тропическом, так и умеренном климате. Азоспириллы, в основном, колонизируют поверхность корня, и лишь некоторые штаммы способны проникать во внутренние ткани корня [3, 4]. Вопросы, связанные с проникновением бактерий в ткани корня растений являются одними из невыясненных в исследовании азотфиксирующих бактериально-растительных ассоциаций.
Фитопатогенные и мутуалистические микроорганизмы, такие как Rhi-zobium и Azospirillum, являются известными продуцентами ферментов, деградирующих пектин клеточной стенки растений [5]. В то же время показана способность ризобий индуцировать активность этих ферментов в самой растительной клетке на начальных этапах взаимодействия [6].
С действием пектолитических ферментов связывают не только процессы разрушения пектиновых веществ при проникновении и продвижении по тканям растения, но и изменение проницаемости для воды и ионов. Повреждающее действие пектолитических ферментов вызывает сдвиг физиологических процессов и развитие в тканях растения ответных реакций, соотношение которых может определять исход взаимоотношений между организмами.
Как показано [7], в большинстве случаев пектинолитические ферменты растений являются гликопротеинами и, следовательно, несут детерминанты специфичности. Присутствие в молекулах пектолитических ферментов углеводов может обусловливать специфическое взаимодействие с лектинами, в том числе бактериальными [8].
В.Е. Никитина с соавт. (1996) показали присутствие на поверхности клеток азоспирилл лектинов, вовлеченных в бактериальную адгезию к кор-
Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН (электронный журнал), 2015, № 3 ням [9]. С поверхности двух отличающихся по способу колонизации растений штаммов ассоциативных азотфиксирующих бактерий - A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245 были изолированы лектины, являющиеся гликопротеи-нами с различными молекулярными массами и углеводной специфичностью [10, 11]. Установлено, что лектины азоспирилл являются полифункциональными молекулами, и, помимо адгезивной функции, они способны влиять на метаболизм растительной клетки - стимулировать прорастание семян [12], проявлять по отношению к растительной клетке митогенную и ферментмо-дифицирующую активности [13, 14], изменять содержание стрессовых метаболитов в растительной клетке, что свидетельствует о способности лектинов выступать в качестве индукторов адаптационных процессов корней проростков пшеницы [15].
В связи с вышесказанным целью данной работы была сравнительная оценка способности лектинов A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245 оказывать регулирующее воздействие на активность пектинолитических ферментов в корнях проростков пшеницы.
Материалы и методы
В работе использованы лектины двух штаммов бактерий рода Azospiril-lum - A. brasilense Sp7 (эпифитный), полученный из Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН (г. Москва), и A. brasilense Sp245 (эндофит-ный) из коллекции микроорганизмов ИБФРМ РАН.
Выращивание культур, выделение и очистку лектинов проводили, как описано ранее [9, 11]. Количество белка определяли по методу M.M. Bradford [16].
Семена пшеницы Triticum aestivum L. сорта «Саратовская 29» (НИИ сельского хозяйства Юго-Востока РСХА, Саратов, Россия) были поверхностно стерилизованы в 70% (v/v) этаноле 1 мин, отмыты стерильной водой. Для получения корней проростков семена были выращены в асептических условиях в чашках Петри на стерильной дистиллированной воде. Корни после экспозиции с препаратами лектинов, гомогенизировали в 0.15 М фосфатном буфере (рН 7.8). Гомогенат центрифугировали при 7000g, надосадочную жидкость использовали для определения активности ферментов.
Активность полигалактуроназы, пектатлиазы и пектинэстеразы определяли по известной методике [17]. Активность ферментов выражали числом единиц активности фермента в 1 г сырой массы корней.
Опыты проводили в трехкратной биологической и пятикратной аналитической повторностях. Цифровой материал обработан статистически с помощью программы «Анализ данных электронных таблиц Microsoft Excel». Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.
Результаты и обсуждение
Для проведения экспериментов по изучению влияния лектинов A. brasilense Sp7 и A. brasilense Sp245 на активность пектинолитических ферментов были взяты концентрации лектинов от 5 до 40 мкг/мл. Время инкубирования лектинов с корнями проростков составляло 15-120 мин. Результаты проведенных исследований показали, что изучаемые лектины в концентрациях от 5 до 20 мкг/мл после 1ч воздействия на корни проростков пшеницы способны вызывать индукцию активности полигалактуроназы, пектинэстеразы, пектат-лиазы - ферментов пектинолитического комплекса клеточной стенки растений (рисунок).
контроль пектатлиаза полигалактуроназа пектинэстераза
Рис. Влияние лектинов А. brasilense Sp7 и Sp245 на активность пектолити-ческих ферментов корней проростков пшеницы. Контроль - корни: активность пектатлиазы - 20 ед/г сырой массы, полигалактуроназы - 10 ед/г сырой массы, пектинэстеразы - 25 ед/г сырой массы. Концентрация лектинов - 10 мкг/мл. Время инкубации - 1ч.
Наибольший эффект наблюдался по отношению к полигалактуроназе, увеличение активности для лектинов А. ЬгазИете Бр7 и Бр245 составляло 60 и 80%, соответственно. Лектин эндофитного штамма А. ЬгазИете Бр245 проявлял наиболее высокую индуцирующую активность по отношению ко всем изучаемым ферментам.
Заключение
Полученные данные свидетельствуют о том, что лектины азоспирилл способны вызывать индукцию пектинразрушающих ферментов самих растений, являющихся одним из основных факторов, способствующих разрушению клеточных стенок и внедрению микроорганизмов в ткани растения и в этом прослеживается сходство с бобово-ризобиальным симбиозом [6].
Кроме того, представленные результаты и предыдущие данные, свидетельствующие о способности лектинов азоспирилл вызывать спектр ответных биохимических реакций, являющихся частью сигнальных систем [15], дают основания полагать, что лектины азоспирилл могут вызывать индукцию защитных механизмов растений, что в сочетании с ростстимулирующим эффектом бактерий способствует формированию устойчивости и продуктивности растений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Okon Y., Vanderleyden J. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants. ASM News. 1997. 63: 366-370.
2. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003). Can. J. Microbiol. 2004. 50: 521-577.
3. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. FEMS Microbiol. Rev. 2000. 24: 487-506.
4. Saikia S.P., Bora D., Goswami A., Mudoi K.D., Gogoi A. A review on the role of Azospirillum in the yield improvement of non leguminous crops. African J. Microbiol. Res. 2012. 6: 1085-1102.
5. Khammas K.M., Ageron., Grimond P.A., Kaiser P. Azospirillum irakense spp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil. Res. Microbiol. 1989. 140: 679-693.
6. Xie F., Murray J.D., Kim J., Heckmann A.B., Edwards A., Oldroyd G.E.D., Downiе J. A. Legume pectate lyase required for root infection by rhizobia. PNAS. 2012. 109: 633-638.
7. Albersheim P., Valent B. Host-pathogen interactions in plants. J Cell Biology. 1978. 78: 627-643.
8. Cervone F., Anderbhan T., Corn R. H. A., Wood R. K. S. Effects of french bean tissue on Colletotrichum lindemuthianum polygalacturonase. Phytopathol. Z. 1981. 102: 238-246.
9. Никитина В.Е., Аленькина С.А., Пономарева Е.Г., Савенкова Н.Н. Изучение роли лектинов клеточной поверхности азоспирилл во взаимодействии с корнями пшеницы. Микробиология. 1996. 65 (2): 165-170.
10. Никитина В.Е., Пономарева Е.Г., Аленькина С.А. Лектины клеточной поверхности азоспирилл и их роль в ассоциативных взаимоотношениях с растениями. В кн.: Молекулярные основы взаимоотношений ассоциативных микроорганизмов с растениями / Под ред. В В. Игнатова. М.: Наука, 2005: 70-97.
11. Шелудько А.В., Пономарева Е.Г., Варшаломидзе О.Э., Ветчинкина Е.И., Кацы Е.И., Никитина В.Е. Гемагглютинирующая активность и подвижность бактерий Azospirillum brasilense в присутствии разных источников азота. Микробиология. 2009. 78 (6): 749-756.
12. Никитина В.Е., Богомолова Н.В., Пономарева Е.Г., Соколов О.И. Влияние лектинов
азоспирилл на способность семян к прорастанию. Известия РАН. Серия биологическая. 2004. 4: 431-435.
13. Alen'kina S.A., Payusova O.A., Nikitina V.E. Effect of Azospirillum lectins on the activities of wheat-root hydrolytic enzymes. Plant and Soil. 2006. 283: 147-151.
14. Чернышева М.П., Аленькина С.А., Никитина В.Е., Игнатов В.В. Внеклеточные протео-литические ферменты штамма Azospirillum brasilense Sp7 и регулирование их активности гомологичным лектином. Прикл. биохимия и микробиология. 2005. 41 (4): 444-448.
15. Alen'kina S.A., Bogatyrev V.A., Matora L.Yu., Sokolova M.K., Chernysheva M.P., Trutne-va K.A., Nikitina V.E. Signal effects of the lectin from the associative nitrogen-fixing bacterium Azospirillum brasilense Sp7 in bacterial-plant root interactions. Plant and Soil. 2014. 381: 337-349.
16. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976. 72: 248-254.
17. Ермаков А.И., Арасимович В.В., Ярош Н.П., Перуанский Ю.В., Луковникова Г.А., Иконникова М.И. Методы биохимического исследования растений / Под ред. А.И. Ермакова. Л.: Агропромиздат, Ленингр. отд., 1987. 430 с.
Поступила 18.08.2015
(Контактная информация: Аленькина Светлана Александровна - к.б.н, старший научный сотрудник Института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН; адрес: 410049, г. Саратов, пр-т Энтузиастов, 13; тел. (8452) 970444; E-mail: [email protected]).
LITERATURA
1. Okon Y., Vanderleyden J. Root-associated Azospirillum species can stimulate plants. ASM News. 1997. 63: 366-370.
2. Bashan Y., Holguin G., de-Bashan L.E. Azospirillum-plant relationships: physiological, molecular, agricultural, and environmental advances (1997-2003). Can. J. Microbiol. 2004. 50: 521-577.
3. Steenhoudt O., Vanderleyden J. Azospirillum, a free-living nitrogen-fixing bacterium closely associated with grasses: genetic, biochemical and ecological aspects. FEMS Microbiol. Rev. 2000. 24: 487-506.
4. Saikia S.P., Bora D., Goswami A., Mudoi K.D., Gogoi A. A review on the role of Azospirillum in the yield improvement of non leguminous crops. African J. Microbiol. Res. 2012. 6: 1085-1102.
5. Khammas K.M., Ageron., Grimond P.A., Kaiser P. Azospirillum irakense spp. nov., a nitrogen-fixing bacterium associated with rice roots and rhizosphere soil. Res. Microbiol. 1989. 140: 679-693.
6. Xie F., Murray J.D., Kim J., Heckmann A.B., Edwards A., Oldroyd G.E.D., Downie J. A. Legume pectate lyase required for root infection by rhizobia. PNAS. 2012. 109: 633-638.
7. Albersheim P., Valent B. Host-pathogen interactions in plants. J Cell Biology. 1978. 78: 627-643.
8. Cervone F., Anderbhan T., Corn R. H. A., Wood R. K. S. Effects of french bean tissue on Colletotrichum lindemuthianum polygalacturonase. Phytopathol. Z. 1981. 102: 238-246.
9. Nikitina V.E., Alen'kina S.A., Ponomareva E.G., Savenkova N.N. Izuchenie roli lektinov kletochnoj poverhnosti azospirill vo vzaimodejstvii s kornjami pshenicy. Mikrobiologija. 1996. 65 (2): 165-170.
10. Nikitina V.E., Ponomareva E.G., Alen'kina S.A. Lektiny kletochnoj poverhnosti azospirill i ih rol' v associativnyh vzaimootnoshenijah s rastenijami. V kn.: Molekuljarnye osnovy vzaimootnoshenij associativnyh mikroorganizmov s rastenijami / Pod red. V.V. Ignatova. M.: Nauka, 2005: 70-97.
11. Shelud'ko A.V., Ponomareva E.G., Varshalomidze O.Je., Vetchinkina E.I., Kacy E.I., Nikitina V.E. Gemaggljutinirujushhaja aktivnost' i podvizhnost' bakterij Azospirillum brasilense v prisutstvii raznyh istochnikov azota. Mikrobiologija. 2009. 78 (6): 749-756.
12. Nikitina V.E., Bogomolova N.V., Ponomareva E.G., Sokolov O.I. Vlijanie lektinov azospi-rill na sposobnost' semjan k prorastaniju. Izvestija RAN. Serija biologiche-skaja. 2004. 4: 431-435.
13. Alen'kina S.A., Payusova O.A., Nikitina V.E. Effect of Azospirillum lectins on the activities of wheat-root hydrolytic enzymes. Plant and Soil. 2006. 283: 147-151.
14. Chernysheva M.P., Alen'kina S.A., Nikitina V.E., Ignatov V.V. Vnekletochnye proteo-liticheskie fermenty shtamma Azospirillum brasilense Sp7 i regulirovanie ih aktivno-sti gomologichnym lektinom. Prikl. biohimija i mikrobiologija. 2005. 41 (4): 444-448.
15. Alen'kina S.A., Bogatyrev V.A., Matora L.Yu., Sokolova M.K., Chernysheva M.P., Trutne-va K.A., Nikitina V.E. Signal effects of the lectin from the associative nitrogen-fixing bacterium Azospirillum brasilense Sp7 in bacterial-plant root interactions. Plant and Soil. 2014. 381: 337-349.
16. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 1976. 72: 248-254.
17. Ermakov A.I., Arasimovich V.V., Jarosh N.P., Peruanskij Ju.V., Lukovnikova G.A., Ikonnikova M.I. Metody biohimicheskogo issledovanija rastenij / Pod red. A.I. Ermakova. L.: Agropromizdat, Leningr. otd., 1987. 430 s.
Образец ссылки на статью:
Романов Н.И., Аленькина С.А., Никитина В.Е. Влияние лектинов эндофитного и эпифит-
ного штаммов азоспирилл на активность пектолитических ферментов растительной клетки. Бюллетень Оренбургского научного центра УрО РАН. 2015. 3: 1-7 [Электронный ресурс] (URL: http://elmag.uran.ru:9673/magazine/Numbers/2015-3/Articles/NIR-2015-3.pdf).
