CC BY
59
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ЛАДАСТЕНА... 39
УДК 612.411/418:615.275.2
А.В. Таллерова, Л.П. Коваленко, А.Д. Дурнев, С.Б. Середенин
ВЛИЯНИЕ ЛАДАСТЕНА НА СУБПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ Т-ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ И ПОВЕДЕНИЕ МЫШЕЙ С57БЬ/6
ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ МОДЕЛИРОВАНИИ ТРЕВОЖНОЙ ДЕПРЕССИИ
НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН, Москва
Контактная информация
Таллерова Анна Владимировна, научный сотрудник лаборатории лекарственной токсикологии адрес: 125315, Москва, ул. Балтийская, 8; тел. +7(495)601-21-27 e-mail: [email protected]
Статья поступила 10.06.2011; подписана в печать 18.01.2012.
Резюме
Исследовано влияние антиастенического препарата ладастен (N-(2-adamantyl)-N-(para-bromophenyl)-amine) при 5-дневном в/б введении в дозе 30 мг/кг на субпопуляционный состав лимфоцитов селезёнки и поведение мышей самцов линии С57БЬ/6 в условиях хронического стрессирования по методу зоосоциального конфликта.
После 20 дней стрессирования животных наблюдали снижение индекса массы тимуса, процентного содержания Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов селезёнки (CD4+CD8-), снижение всех параметров спонтанной двигательной активности, увеличение выраженности тревожного поведения в тесте приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) и депрессивно-подобное поведение в тесте «принудительное плавание» по Porsolt (1111).
Пятидневное введение ладастена в дозе 30 мг/кг в/б мышам самцам линии C57BL/6, начиная с 16 дня стрессирования способствовало достоверному уменьшению выраженности тревожно-депрессивного состояния и восстанавливало субпопуляционный состав Т-лимфоцитов селезёнки до контрольных значений.
Полученные результаты определяют перспективы разработки показаний для применения ладастена в качестве средства иммунокоррекции при депрессии.
Ключевые слова: ладастен, тревожно-депрессивное состояние, поведение, лимфоциты.
A.V. Tallerova, L.P. Kovalenko, A.D. Durnev, S.B. Seredenin
THE INFLUENCE OF LADASTEN ON SPLEEN T-LYMPHOCYTE SUBPOPULATIONS AND BEHAVIOR OF MALE MICE C57BL/6 IN EXPERIMENTAL MODEL OF ANXIOUS DEPRESSION STATE
Zakusov Institute of Pharmacology RAMS, Moscow
Abstract
The aim of the study was to investigate the effects of antiastenic drug Ladasten (N-(2-adamantyl)-N-(para-bromophenyl)-amine) on spleen T-lymphocytes subpopulations and behavior depressed male mice C57BL/6.
Anxious depression state forming by repeated fights in male mice, the zoo-social conflicts. Ladasten (30mg/kg,
i.p.) administered 5 days after 15 days fights. To determine spleen T-lymphocyte subpopulations we used 3-colors (CD3-FITC/CD4-PE/CD8-PeCy5) stained by flow cytometry method. Spontaneous motor activity measured in an IR Actimeter, elevated plus-maze (EPM) used to assess anxiety. Forced swimming test by Porsolt (FST) by video-based motor activity analysis system used for evaluate depression state. Parameters analyzed after 24h last drug injections. For statistic analyses we used Student’s t-test and Mann-Whitney U test.
After 20 days stressed mice recorded decreased thymic index, percentage of splenocytes CD4+CD8-, spontaneous motor activity, detected increased anxiety in EPM and depression state in FST.
5 days ladasten administration from 16 day stress male mice C57BL/6 significantly limit anxious depressive state development and led percentage of spleen T-lymphocyte subpopulations to control meanings.
Thus findings suggest antiastenic drug ladasten is a possible drug-candidate for immunocorrection of depression.
Key words: ladasten, anxious depression state, behavior, lymphocytes.
Введение
Актинический В последние годы установлена роль иммунной дисрегуляции в патогенезе депрессии [2; 4; 6]. В частности, у больных депрессией выявлены различные иммунные сдвиги в виде дисбаланса субпопуляционного состава Т-лимфо-цитов со снижением числа циркулирующих в периферической кр ови Т-хелперов (Т-лимфоцитов с фенотипом СБ4 ), поляризации состава внутри Т-хелперной популяции (Т^ЛЪ2) в сторону ТК2, угнетения фагоцитарных реакций макрофагов и ней-трофилов, повышения содержания в крови маркеров воспаления [2; 6; 9; 10; 11]. Применение современных антидепрессантов позволяет устранить
клиническую симптоматику, характерную для глубоких депрессивных состояний, однако при этом не отмечается восстановления иммунных показателей в полном объеме, что многие авторы считают причиной возникновения рецидивов депрессии [4; 6; 15]. Ряд авторов полагают целесообразным введение в фармакотерапию депрессии иммуномодулирующих препаратов, нормализующих иммунологические показатели [6].
В наших исследованиях ранее было установлено нормализующее влияние противоастеническо-го препарата ладастен на содержание цитокинов ряда Т^: 1Ь-4, 1Ь-6 и 1Ь-17 в сыворотке крови у мышей самцов линии С57БЬ/6 в экспериментальной модели тревожной депрессии [16].
Целью настоящей работы явилось исследование эффекта ладастена на субпопуляционный состав Т-лимфоцитов селезёнки и поведение самцов мышей линии C57BL/6, находящихся в условиях хронического психоэмоционального стресса на стадии глубокого тревожно-депрессивного состояния.
Материалы и методы
Ладастен М-(2-адамантил)-М-(п-бромфенил)-амин синтезирован и фармакологически изучен в НИИ фармакологии имени В.В Закусова РАМН [2]. У препарата выявлены психостимулирующая, ан-ксиолитическая и иммунотропная активности [3].
Опыты проведены на мышах самцах линии C57BL/6 массой 18-20 г (питомник «Столбовая» РАМН). Животных содержали в стандартных условиях в виварии НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН со свободным доступом к корму и воде.
Для формирования тревожно-депрессивного состояния у самцов мышей линии C57BL/6 использовали модель зоосоциального конфликта, предусматривающую ежедневные конфронтации между самцами в соответствии с описанной методикой; глубокое тревожно-депрессивное состояние с выраженным иммунодефицитом у животных достигается после 20 дней стрессирования [1; 7].
Были сформированы две группы стрессиро-ванных самцов по 10 особей в каждой. Первую инъецировали физиологическим раствором, второй вводили пятикратно в/б ладастен в дозе 30 мг/кг, начиная с 16 дня стрессирования, анализ исследуемых параметров проводили через сутки после последнего введения препарата. Выбор дозы ладасте-на основан на данных проведённых ранее исследований [2; 16].
Параметры двигательной активности регистрировали в течение 3 мин на инфракрасном акти-метре PanLab (Испания). Тревожное поведение оценивали по методике ПКЛ. У каждого животного в течение 300 сек регистрировали число заходов и время, проведённое в открытых и закрытых рукавах лабиринта. Увеличение времени нахождения в тёмных отсеках лабиринта по сравнению с контролем расценивали как проявление тревожного поведения [1]. Оценку выраженности депрессивного состояния проводили с помощью видеоустановки IIII по Porsolt НПК Открытая наука (Россия). С помощью программного обеспечения RealTimer в режиме работы с видеозаписью за 5 мин теста оценивали время пассивного плавания (дрейф и полная неподвижность) в воде, а также латентное время до проявления первой иммобильности. Увеличение длительности пассивного плавания мышей и уменьшение латентного времени расценивали как свидетельство выраженного депрессивноподобного состояния [1; 8].
Тимус и селезенку выделяли и взвешивали, результаты выражали в относительных значениях массы органа в мг на 10 г массы мыши.
Оценку субпопуляционного состава Т-лимфо-цитов селезенки мышей проводили методом трехцветного цитометрического анализа на проточном лазерном цитометре EPICS XL 4 color (Beckman Coulter, США). Клеточную суспензию спленоцитов готовили при помощи стеклянного гомогенизатора, ресуспендирование проводили в физиологическом растворе. К 100 мкл гомогената добавляли расчётное количество моноклональных антител к молекулам CD3-FITC/CD4-PE/CD8-PeCy5 (eBioScience, Австрия). Инкубировали при комнатной температуре (2025 °С) 15 мин, для последующего лизиса эритроцитов
в пробу вносили З00 мкл лизирующего реагента Op-tilyse C. Через 20 мин пробу стабилизировали З00 мкл физиологического раствора. В каждой пробе анализировали не менее 10 000 событий. Результаты обрабатывали в программе WinMDI 2,7 и выражали в процентах клеток, несущих данный маркер.
Статистическую обработку данных проводили по t-критерию Стьюдента и непараметрическому критерию Mann-Whitney U Test.
Результаты и обсуждение
Из данных представленных в табл. 1, следует, что у животных, подвергнутых 20-дневному стрес-сированию, значительно (р<0,0З) изменяются показатели спонтанной двигательной активности. По сравнению с интактными животными у стрессиро-ванных самцов, получавших физиологический раствор, на 38 % снижается локомоторная двигательная активность, в 1,4 раз снижается число эпизодов вставания на задние лапы. Кроме того, у самцов опытной группы уменьшается число быстрых движений в 1,З раза, в 1,3 раза увеличивается время покоя, но при этом возрастает максимальная скорость движения в 1,3 раза и сохраняются величины пройденных дистанций. Таким образом, продолжительные периоды неподвижности сопровождаются кратковременными вспышками активности. Согласно Цикунову С.Г. и др. [8], данное поведение является проявлением тревожности. Также происходит снижение времени пребывания в открытых рукавах ПКЛ в 3,8 раза (табл. 2), уменьшение латентного и увеличение пассивного времени плавания в тесте ПП на 47 и 39 % соответственно (табл. 3).
У стрессированных самцов на фоне введения ладастена восстанавливались все параметры спонтанной двигательной активности до значений, характерных для интактных животных. В тесте ПКЛ на ЗЗ % увеличивалось время пребывания в открытых рукавах (см. табл. 2) и на 24 % увеличивалось латентное время до проявления первой иммобильности в тесте ПП (см. табл. 3).
У животных, подвергнутых стрессированию, по сравнению с интактными особями наблюдалось уменьшение в 1,З раза массы тимуса. Значимого изменения массы селезёнки не наблюдалось (табл. 4). При этом в селезёнке было снижено процентное содержание Т-клеток (CD3+ фенотип) на 13 %, за счёт значимого снижения на 22 % (р<0,0З) Т-хелперной субпопуляции лимфоцитов (CD4 CD8-). Уменьшение количества субпопуляции Т-эффекторов (CD4-CD8+) не носило достоверного характера.
Введение ладастена не влияло на изменение массы лимфоидных органов, вызванное ежедневным стрессированием мышей, но при этом предотвращало снижение содержания Т-лимфоцитов селезёнки, восстанавливало процентное содержание субпопуляции Т-хелперов до контрольных значений (см. рис.). Полученные результаты согласуются с данными литературы о том, что хронический социальный стресс, вызванный повторным опытом социальных поражений у мышей самцов, приводит к развитию тревожно-депрессивного состояния и иммунодефицита проявляющегося в снижении числа Т-клеток CD3+, CD4+ в селезёнке [1; З; 7].
Пятидневное введение ладастена мышам самцам линии C57BL/6 на стадии выраженной депрессии после 1З дней стрессирования способствовало уменьшению выраженности тревожно-депрессивного состояния и восстанавливало субпопуляционный состав Т-лимфоцитов селезёнки.
Таблица 1
Оценка влияния ладастена на параметры спонтанной двигательной активности экспериментальных мышей самцов линии С57ВЬ/6
Г руппы (п=10) Показатель
Спонтанная двигательная активность, у.е. ^макс СМ/С ^средн См/С Расстояние, см Время покоя, % Медленные движения, % Быстрые движения, % Число стоек
Локомоторная двигательная активность Стереотипное движение
Интактные мыши 487,0±35,2 90,3±30,0 23,8±6,3 3,7±1,2 667,5±118,8 47,0±3,2 32,5±2,0 20,5±3,2 54,9±5,5
Стрессированные (20 дней) мьппи Физиологический раствор 350,0±31,7* 91,6±29,3 32,1±7,3* 4,1±1,3 737,9±237,6 61,5±3,2* 22,9±4,5 13,6±4,5* 40,2±2,1*
Ладастен, 30 мг/кг, в/б 460,7±35,1 135,6±36,3 27,3±5,5 5,6±1,6 909,9±261,3 44,7±5,2 30,2±2,9 25,0±6,2 49,7±5,3
d,I(II,c и г)средН - максимальная и средняя скорости мыши см/с; *различия достоверны (р<0,05) по сравнению с интактным контролем. Сравнение по непараметрическому критерию Mann-Whitney, U-Test
Таблица 2
Влияние ладастена на выраженность депрессивного состояния экспериментальных мышей самцов линии С57БЬ/6 в тесте «принудительное плавание» по РогеоИ_____________________________________________
Показатель Мыши
Интактные Стрессированные
Физ. р-р Ладастен, 30 мг/кг, в/б
Латентное время до проявления первой иммобильности, сек 85,2±4,б 45,3±12,3* 59,8±15,7#
Дрейф, сек 94,б±13,7 155,2±19,4* 203,б±9,5*
Полная неподвижность, сек 4б,б±15,1 51,2±11,1 19,б±7,2*#
*различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с интактным контролем; #различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с группой физиологический раствор. Сравнение по непараметрическому критерию Мапи^ЬИиеу, И-Теє1
Таблица 3
Влияние ладастена на выраженность тревожного состояния экспериментальных мышей самцов линии С57БЬ/6 в тесте «ПКЛ»
Показатель Мыши
Интактные Стрессированные
Время в открытых рукавах, % 17,2±4,8 Физ. р-р Ладастен, 30мг/кг, в/б
4,5±1,7* 10,1±3,б*#
Время в закрытых рукавах, % б7,8±5,7 81,8±3,4 77,1±4,4
*различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с интактным контролем; #различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с группой физиологический раствор.
Сравнение по непараметрическому критерию Mann-Whitney U Test
Таблица 4
Влияние ладастена на индексы массы тимуса и селезёнки экспериментальных мышей самцов линии С57БЬ/6
Показатель Мыши
Интактные Стрессированные
Индекс массы тимуса, мг/10г мыши 22,2±1,0 Физ. р-р Ладастен, 30мг/кг, в/б
14,8±2,9* 14,4±2,8*
Индекс массы селезёнки, мг/10г мыши 41,3±2,3 39,4±9,5 70,б±18,9
СБ3+ 32,0±0,8 27,9±1,3# 31,3±1,0
СВ4+СБ8" 21,8±1,0 17,1±1,1# 19,3±0,9
СВ4'СБ8+ 10,7±0,7 9,4±0,5 11,0±0,5
*различия достоверны (р < 0,05) по сравнению с интактным контролем; #различия достоверны (р < 0,05) с интактным контролем по 1-критерию Стьюдента
СМ-РЕ
Рис. Оценка влияния ладастена на процентное содержание популяции Т-хелперов (СВ4+СБ8) экспериментальных мышей самцов линии С57БЬ/6 методом ПЦ (данные см. в табл. 5., стр. 43).
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ВЛИЯНИЕ ЛАДАСТЕНА... 43
Таблица 5
Гистограмма оценки влияния ладастена на процентное содержание субпопуляции Т-хелперов (СВ4+СБ8") экспериментальных мышей самцов линии С57БЬ/6 методом проточной цитометрии__________________________
Показатель Интактные мыши Стрессированные мыши
Физиологический раствор Ладастен, 30мг/кг, в/б
CD3+ 32,0±0,8 27,9±1,3* 31,3±1,0
CD4+CD8" 21,8±1,0 17,1±1,1* 19,3±0,9
CD4"CD8+ 10,7±0,7 9,4±0,5 11,0±0,5
*различия достоверны (р < 0,05) с интактным контролем по t-критерию Стьюдента
Таким образом, способность противоастениче-ского препарата ладастен при тревожно-депрессивном состоянии предупреждать развитие иммунного дисбаланса определяет перспективы разработки показаний для применения ладастена в качестве средства иммунокоррекции при депрессии.
Выводы
1. Ладастен в дозе 30 мг/кг значимо уменьшает выраженность тревожно-
депрессивного поведения самцов мышей линии С57БЬ/6, подвергнутых 20-дневному хроническому зоосоциальномому стрессу.
2. Пятидневное введение ладастена в дозе 30 мг/кг на стадии выраженной депрессии самцам мышей линии С57БЬ/6 восстанавливает субпопуляционный состав Т-лимфоцитов селезёнки в экспериментальной модели тревожной депрессии у мышей.
Литература
1. Августинович Д.Ф., Алексеенко О.В., Бакштановская И.В. и др. Динамические изменения серотонер-гической и дофаминергической активности мозга в процессе развития тревожной депрессии: экспериментальное исследование // Успехи физиологических наук. - 2004. - T. 35, № 4. - С. 19-40.
2. Александровский Ю.А., Казанцева К.В., Ахапкин Р.В. Психоиммунологические исследования в современной психиатрии (Обзор материалов XLVIII международного невролого-психиатрического конгресса) // Фарматека. - 2009. - Т. 181, № 7. - С. 8-12.
3. Вахитова Ю.В., Ямиданов Р.С., Вахитов В.А., Середенин С.Б. Анализ изменения экспрессии генов в головном мозге крыс после однократного воздействия производного 2-аминоадамантана с использованием кДНК макрочипов // Молекулярная Биология. - 2005. - Т. 39, № 2. - С. 276-85.
4. Казанцева К.В. Цитокиновые нарушения при шизофрении и аффективных расстройствах (аналитический обзор) // Фарматека. Спецвыпуск: Психиатрия. - 2008. - Т. 216, № 0(3). - С. 8-14.
5. Кудрявцева Н.Н., Августинович Д.Ф., Бондарь Н.П., и др. Экспериментальный подход к скринингу психотропных препаратов в условиях, приближённых к клиническим (обзор) // Нейронауки. - 2007. - Т. 9, № 1. - С. 5-18.
6. Кутько И.И., Фролов В.М., Рачкаускас Г.С. Новые подходы к лечению депрессивных расстройств // Новости медицины и фармации. - 2007. - Т. 227, № 19. - С. 12.
7. Тендитник М.В., Шурлыгина А.В., Мельникова Е.В. и др. Эффекты диазепама на субпопуляционный состав лимфоцитов иммунокомпетентных органов тревожных самцов мышей // Бюллетень СО РАМН. - 2010. - Т. 30, № 4. - С. 46-50.
8. Цикунов С.Г., Клюева Н.Н., Кусов А.Г. и др. Изменения липидного спектра сыворотки крови и печени крыс, вызванные тяжелой психогенной травмой // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2006. - Т. 141, №5. - С. 575-9.
9. Marshall G.D. Internal and external environmental influences in allergic diseases // J. Am. Osteopath. Assoc. - 2004. - 104(5). - P. 1-6.
10. Dunn A.J., Swiergiel A.H., de Beaurepaire R. Cytokines as mediators of depression: What can we learn from animal studies? // Neuroscience & Biobehavioral Reviews. - 2005. - 29(4-5). - P. 891-909.
11. Dantzer R., Bluthe R.-M., Castanon N. Cytokines, Sickness Behavior, and Depression // Psychoneuroimmunology. - 2007. - 4. - P. 281-318.
12. Kim Y.K., Na S.K., Shin K.H., et al. Cytokine imbalance in the pathophysiology of major depressive disorder // Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. - 2007. - 31(5). - P. 1044-53.
13. Leonard B.E., Myint A. Changes in the immune system in depression and dementia:causal or coincidental effects? // Dialogues Clin. Neurosci. - 2006. - 8(2). - P. 163-74.
14. Leonard B.E., Myint A.M. Inflammation and depression: Is there a causal connection with dementia? // Neu-rotox. Res. - 2006. - 10(2). - P. 149-60.
15. Obuchowicz E., Kowalski J., Labuzek K. et al. Amitriptyline and nortriptyline inhibit interleukin-1p and tumour necrosis factor-а release by rat mixed glial and microglial cell cultures // Int. J. Neuropsychopharmacol. - 2006. - 9(1). - P. 27-35.
16. Tallerova A., Kovalenko L., Durnev A., Seredenin S. The study of effects of psychotropic drug Ladasten on LPS-induced changes cytokines profile and behavior in mice C57Bl/6 // Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology. - 2010. - 107(Suppl. 1). - P. 606.
