CC BY
128
УДК 577.352.3 Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
С. Г. ДЗУГКОЕВ1, Ф. С. ДЗУГКОЕВА1, Н. Г. ГУМАНОВА2, В. А. МЕТЕЛЬСКАЯ
ВЛИЯНИЕ коэнзима q10, афобазола и l-карнитина на эндотелиальную функцию у крыс с экспериментальным САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ
Отдел патобиохимии ФГБУН «Институт биомедицинских исследований»
ВНЦ РАН и Правительства РСО — Алания,
Россия, 362019, г. Владикавказ, ул. Пушкинская, 40. E-mail: [email protected];
2отдел изучения биохимических маркеров риска хронических НИЗ ФГБУ «ГНИЦ профилактической медицины Минздравсоцразвития России»,
Россия, 101990, г. Москва, Петроверигский переулок, 10
На фоне всех препаратов (коэнзима Q10, афобазола, L-карнитина) по сравнению с группой крыс с ЭСД достоверно (р<0,001) увеличилась концентрация NOx, что сопровождалось повышением уровня экспрессии eNOS. Одновременно снижается концентрация МДА и повышается активность СОД у крыс с ЭСД под влиянием коэнзима Q10, афобазола и L-карнитина (р<0,001). Лечение ЭСД во всех вариантах приводило к снижению упруго-эластических свойств сосудов, повышению средней и систолической скоростей кровотока и жидкостного обмена в сосудах микроциркуляции.
Ключевые слова: экспериментальный СД, антиоксиданты, оксид азота, экспрессия eNOS, гемодинамика.
S. G. DZUGKOEV1, F. S. DZUGKOEVA1, N. G. GUMANOVA2, V. A. METELSKAYA2
THE INFLUENCE OF COENZYME Q10, AFOBASOL AND L-CARNITINE ON ENDOTHELIAL FUNCTION
IN RATS WITH EXPERIMENTAL DIABETES MELLITUS
1 Department of patochemistry Federal state budget establishment of science Institute of biomedical research
of RAS VSC and government of RNO - Alania,
Russia, 362019, Vladikavkaz, Pushkin’s street, 40. E-mail: [email protected];
2department study of biochemical markers of chronic NCD Federal state budget establishment «SRC of preventive medicine, Department of health and social development of Russia»,
Russia, 101990, Moscow, 10, Lane, Petroverigski
All studied substances (coenzyme Q10, afobasol, L-carnitine) significantly increased NOх level as compared to rats with EDM with parallel enhance of eNOS expression level. Decrease of membrane MDA concentration was accompanied by the increase of SOD activity with coenzyme Q10, afobasol, and L-carnitine treatment (р<0,001). The treatment of experimental diabetes leads to a decrease in elasticity of blood vessels, and the increase in the average and systolic velocity of blood flow and perfusion in the microvessels.
Key words: alloxan-induced diabetes mellitus, antioxidants, nitric oxide, eNOS expression, hemodynamics.
Введение
Одним из проявлений сосудистых осложнений сахарного диабета (СД) являются микроангиопатии -повреждение мелких сосудов почек, сетчатки глаза и периферической сосудистой системы. Среди нескольких гипотез, объясняющих сосудистые диабетические поражения, особое место занимает развитие окислительного стресса вследствие повышенной генерации активных форм кислорода (АФК), основная утечка которых происходит из дыхательной цепи на уровне III компонента. Наряду с этим при СД снижается активность ферментов антиоксидантной системы: суперок-сиддисмутазы (СОД), каталазы, глютатионредуктазы и церулоплазмина, что способствует интенсификации перекисного окисления липидов (ПОЛ) [11, 12, 15]. Однако существуют данные, свидетельствующие о повышении активности антиоксидантных ферментов [18]. Нарушение функции сосудистого эндотелия в условиях окислительного стресса может быть обусловлено либо сниженной продукцией эндотелиальными клетками оксида азота (N0), либо нарушением биодоступности этого важнейшего вазодилатирующего фактора. Учитывая вышеизложенное, можно полагать, что не-
обходимой составляющей патогенетической терапии диабетической ангиопатии является применение антиоксидантов [4, 16]. В этом плане представляло научный интерес изучение влияния коэнзима Q10 и карнитина -эндогенных антиоксидантов и регуляторов тканевого дыхания, а также нового препарата - афобазола, синтезированного в ГУНИИ фармакологии им. В. В. За-кусова РАМН, обладающего способностью защищать ишемизированную клетку миокарда от свободнорадикального окисления [6, 2, 17].
Цель исследования - изучить влияние антиоксидантов коэнзима Q10, L-карнитина и афобазола на показатели эндотелиальной функции при экспериментальном СД у крыс путем оценки изменений в микроциркуляции и концентрации биохимических маркеров - регуляторов эндотелиальной функции.
Материалы и методы исследования
Исследование проведено на 105 крысах-самцах линии вистар одной возрастной группы (10-14 мес.) массой 220-250 г. Содержание крыс в виварии и проведение экспериментов соответствовали «Правилам проведения работ с использованием эксперименталь-
ных животных», разработанным и утвержденным МЗ СССР (1977 г.), а также принципам Хельсинкской декларации (2000 г.). Всех животных в течение эксперимента выдерживали на специальной безнитритно-нитратной диете. Безнитритные корма получали от производителя ООО «Лабораторкорм», они были сбалансированы по аминокислотному составу, минеральным веществам и витаминам. Лабораторные исследования показали отсутствие нитратных примесей. Контрольную группу № 1 составили интактные животные (n=20, по возрасту и массе сопоставимые с основной группой). Аллок-сановый диабет у крыс опытных групп, № 2, № 3, № 4, № 5 (по 7 крыс в группе) моделировали введением 5%-ного водного раствора аллоксана в дозе 15-18 мг/100 г массы животного на фоне 24-48-часового голодания. Развитие диабета контролировали по уровню глюкозы крови, которую определяли глюкозо-оксидазным методом, а концентрацию гликированно-го гемоглобина - колориметрически, используя тест-наборы фирмы «Лахема». Подопытные крысы были разбиты на следующие группы: 1) контрольная группа (№ 1); 2) крысы с экспериментальным СД без лечения (№ 2); 3) крысы с экспериментальным СД + коэнзим Q10 в дозе 0,11 мкл/100 г веса животного в течение 30 дней (№ 3); 4) крысы с экспериментальным СД, получавшие в течение 30 дней афобазол в дозе 10 мг/кг (№ 4); 5) крысы с экспериментальным СД, получавшие в течение 30 дней L-карнитин в дозе 25 мг/100 г веса (№ 5). По окончании эксперимента под тиопенталовым наркозом у крыс проводили допплерографию для определения макро- и микрогемодинамики. У наркотизированных животных использовали 5 основных точек локации. В каждой точке локации определяли среднюю, систолическую и диастолическую скорости кровотока, пульсовой индекс, градиент давления и рассчитывали реографиче-ский индекс. В лизате эритроцитов определяли концентрацию вторичного продукта ПОЛ - малоновый диальдегид (МДА) [13], а также активность ферментов каталазы [11], СОД [7] и концентрацию церулоплазмина [3]. Содержание в плазме крови стабильных суммарных конечных метаболитов оксида азота (NO2- и NO3-, или NOX) определяли с помощью реактива Г рисса [8]. Уровень экспрессии eNOS в эндотелии аорты определяли методом Вестерн блота, как описано в работе [9]. Результаты представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы X к интенсивности полосы, принятой за контроль, на каждой пленке. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы «Microsoft Excel 2003». Статистическую достоверность различий между двумя группами животных проверяли с помощью t-критерия Стьюдента, подтвердив нормальность распределения. Уровнем статистической значимости считали р<0,05.
Результаты и обсуждение
Согласно результатам, представленным в таблице, при экспериментальном СД у крыс второй группы на фоне развивающейся гипергликемии и повышения содержания гликированного гемоглобина (HbAlc) с 5,3±0,81% до 8,6±0,71% (р<0,001) имели место достоверное возрастание концентрации МДА в мембранах эритроцитов, снижение активности СОД, увеличение активности каталазы и концентрации церулоплазмина в сыворотке крови. В совокупности эти данные свидетельствовали о развитии у животных с экспериментальным СД окислительного стресса. У этой же группы животных (№ 2) концентрация суммарных метаболитов NO в сыворотке крови статисти-
чески достоверно снижалась по сравнению со значениями в контрольной группе. Эти изменения сопровождались повышением сосудистого тонуса и нарушениями микроциркуляции, о чем говорят реографические показатели, а именно более высокие значения индекса Гослинга (Р1), свидетельствующего о повышении упруго-эластических свойств, т. е. плотности сосудистой стенки и снижении градиента давления в сосудах микроциркуляторного русла. Индекс Пурсело ^1) - реографический индекс, который отражает общее периферическое сосудистое сопротивление (ОПСС), у животных с экспериментальным СД был достоверно выше, чем в контроле. В соответствии с нашими данными, повышение Р1 и RI сопровождается снижением продукции N0, о чем свидетельствует падение концентрации суммарных метаболитов N0 в крови при экспериментальном СД (таблица). Анализ перфузии тканей при экспериментальном СД показал во всех точках локации снижение средней скорости кровотока (М) преимущественно за счет снижения систолической скорости кровотока ^), при повышении диастолической скорости кровотока Р), что отражает уменьшение скорости тканевого обмена (перфузии) [10].
Для коррекции избыточного процесса ПОЛ, нарушений системы антиоксидантной защиты, эндотелиальной дисфункции и гемодинамических изменений экспериментальным животным вводили соответственно коэнзим Q10 (группа № 3), афобазол (группа № 4) и L-карнитин (группа № 5). Анализ результатов свидетельствует о существенном снижении концентрации МДА в крови под влиянием коэнзима Q, афобазола и L-карни-тина. Анализ активности ферментов антиоксидантной системы показал достоверное возрастание активности СОД в плазме крови и эритроцитах, а исходно повышенная активность каталазы и концентрация церулоплазмина достоверно снизились, хотя активность каталазы по сравнению с контролем осталась повышенной как возможное проявление клеточной компенсаторной реакции. Повышение активности СОД сопровождается ингибированием накопления супероксид-иона и тем самым способствует образованию Н2О2, разрушающейся каталазой [14]. С другой стороны, это препятствует образованию перок-синитрита, который повреждает эндотелий сосудов [1]. На фоне лечения в 3 группах экспериментальных крыс с СД статистически достоверно повысилась концентрация суммарных метаболитов оксида азота в сыворотке крови. При сравнении результатов, полученных под влиянием Q10, афобазола и L-карнитина, обнаружилось, что наиболее высокая концентрация метаболитов N0, достигшая исходных контрольных значений, выявлена на фоне Q10 и афобазола. Для выяснения эффективности действия антиоксидантов на процессы ПОЛ и ферменты АОЗ был проведен корреляционный анализ. Представленные данные во всех 3 группах животных, получавших лечение, показали наличие прямой значимой корреляционной зависимости между концентрацией МДА и активностью ка-талазы: на фоне коэнзима Q, афобазола и L-карнитина соответственно (г= +0,57, г= +0,60, г= +0,62, р<0,001) и концентрацией церулоплазмина (г= -0,52, г=+0,58, г=-0,59, р<0,001) и обратной связи между уровнем снижения концентрации МДА и повышением активности СОД в плазме (г= -0,54, г= -0,61, г= -0,59, р<0,001). Одновременно происходило повышение концентрации метаболитов N0, и корреляционный анализ показал наличие отрицательной сильной связи с МДА на фоне 3 вариантов лечения соответственно (г= -0,59; г= -0,57; г= -0,60; р<0,001). Таким образом, изучаемые препараты положительно влияли
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
Изменение концентрации МДА, метаболитов оксида азота ([МОх), экспрессии еГМОЗ, активности ферментов антиоксидантной защиты и микрогемодинамики у крыс при экспериментальном
сахарном диабете и на фоне корригирующей терапии
Показатели Контроль эсд эсд + коэнзим О10 эсд + афобазол эсд + 1_-карнитин
МДА (нмоль/мл) (в эритроцитах) 6,87±0,45 8,65±0,47111) 4,192±0,0721»2222) 4,235±0,0821111»2222) 4,28±0,281111»2222)
Активность СОД, ед. (в сыворотке) 2,55±0,46 1,45±0,0411) 2,092±0,07942222) 1,78±0,1482) 1,942±0,0312222)
Активность каталазы, мкат/л (в сыворотке) 225,6±29,1 345,3±3,31111) 329,5±4,8111»222) 337,6±6,528111) 302,63±1,237111»2222)
Церулоплазмин (мг/мл) 338,667±10,428 376,6±7,291111) 285,791 ±4,31 11111) 2222) 341,5±1,9 82222) 274,744±3,5601111»2222)
ЫОх, мкМ 51,069±0,531 32,54±1,4251111) 51,594±1,81262222) 49,041 ±0,8781) 2222) 39,72±1,2681111»222)
еЫОЭ, у. ед. 0 не определяется 0 не определяется 5,8±2,1 4,6±2,8 1,4±2,08
Средняя скорость кровотока (М), см/с 2,518±0,076 2,137±0,0641111) 2,49±0,0492222) 2,43±0,072222) 2,25±0,15
Систолическая скорость (Э), см/с 11,338±0,264 10,48±0,1651111) 11,24±0,14222) 11,22±0,137222) 10,78±0,17
Диастолическая скорость (0), см/с 6,335±0,168 6,25±0,220 6,31 ±0,18 6,29±0,16 5,84±0,23
Индекс Гослинга (Р1), см/с 7,668±0,250 9,504±0,2311111) 7,89±0,292222) 8,04±0,282222) 9,85±0,121111)
Градиент давления (СО), мм рт. ст. 0,042±0,001 0,04±0,0011) 0,041 ±0,002 0,042±0,001 0,04±0,001
Реографический индекс (Р1), у. ед. 1,490±0,036 1,572±0,030 1,50±0,022) 1,51 ±0,012) 0,45±0,021111»2222)
N 25 25 25 25 25
Примечание: 1111) - р<0,001;111) - р<0,01; 11) - р<0,02; 1) - р<0,05, достоверность относительно контроля;2222) - р<0,001;222) - р<0,01;22) - р<0,02;2) - р<0,05, достоверность относительно экспериментального сахарного диабета.
на функциональную активность сосудистого эндотелия, о чем свидетельствует повышение концентрации метаболитов N0 до уровня в контрольной группе в сыворотке крови животных с экспериментальным СД, получавших лечение коэнзимом Q10 и афобазолом в течение месяца. Коррекция дисфункции эндотелия на фоне лечения в 3 группах исследованных животных сопровождалась улучшением микроциркуляторной гемодинамики, что проявлялось повышением средней и систолической скоростей кровотока, снижением упруго-эластических свойств сосудов микроциркуляции (плотности сосудистой стенки) и периферического сосудистого сопротивления. Эти гемодинамические
тивы: Межвузовский сборник научных трудов. Вып. II. - Саранск: СВМО, 2001. - С. 122-125.
5. Королюк М. А. Метод определения активности каталазы / М. А. Королюк, Л. И. Иванова, И. Г. Майорова // Лабораторное дело. - 1988. - № 1. - С. 16-19.
6. Кравцова Л. А. Применение коэнзима 010 в кардиологической практике / Л. А. Кравцова, В. В. Березницкая, М. А. Школьникова // Российский вестник перинатологии и педиатрии. -2007. - № 6. - С. 51-58.
7. Макаревич О. П., Голиков П. П. Активность супероксиддис-мутазы крови в острый период различных заболеваний // Лабораторное дело. - 1983. - № 6. - С. 24-27.
Иммуноблот. Экспрессия эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) (140 кйД) в крысиных аортах на фоне экспериментального сахарного диабета (ЭСД) при терапии коэнзимом Q. Интенсивность полосы после сканирования выражена в пикселях. Результаты нормализовали: представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы Х к интенсивности и контрольной полосы ЭСД № 8 - контроль -
ЭСД № 1-7 - ЭСД+коэнзим Q
изменения свидетельствуют о повышении процессов перфузии, обусловленном снижением сосудистого сопротивления - реографического индекса и повышением средней и систолической скоростей кровотока (таблица).
Для выяснения эффективности лечения нами проведен корреляционный анализ между концентрацией стабильных метаболитов N0 и скоростью кровотока, на фоне коэнзима Q10, афобазола и L-карнитина, соответственно средней (г= +0,57; г= +0,51; г= +0,48 р<0,001 для всех случаев), систолической (г= +0,61; г= +0,56; г= +0,46 р<0,001 для всех случаев). Сниженная продукция N0 может быть связана с низким уровнем экспрессии фермента еN0S и с нарушением его биодоступности. Результаты исследования уровня экспрессии еN0S у крыс с экспериментальным СД на фоне лечения (таблица, рисунок) свидетельствуют о повышении этого показателя во всех вариантах опытов. Более значимая экспрессия энзима выявлена на фоне лечения коэнзимом Q10, менее значимая - под влиянием афобазола и L-карнитина.
Таким образом, коррекция сосудистых осложнений СД и метаболизма оксида азота (N0) на фоне лечения антиоксидантами: коэнзимом Q10, афобазолом и L-карнитином приводит к снижению интенсивности свободно-радикального окисления, повышению концентрации стабильных метаболитов оксида азота, экспрессии eN0S, а также возрастанию средней и систолической скоростей кровотока, снижению плотности сосудистой стенки, что сопровождается улучшением жидкостного обмена - перфузии.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ванин А. Ф. Оксид азота в биомедицинских исследованиях // Вестник РАМН. - 2000. - № 4. - С. 3-10.
2. Дурнев А. Д. Влияние афобазола на генотоксические эффекты табачного дыма в плаценте и в тканях эмбрионов крыс / А. Д. Дурнев, А. С. Соломина, А. К. Жанатаев, В. Н. Жуков, С. Б. Середин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149. № 3. - С. 286-289.
3. Камышников В. С. Определение содержания (активности) церулоплазмина // Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике. - Минск, 2003. - Т. 2. - С. 71-79.
4. Кокорева Е. В., Инчина В. И., Макарова М. Ю. Современные методы диагностики и лечения в медицине: проблемы, перспек-
8. МетельскаяВ. А., Гуманова Н. Г. Оксид азота: роль в регуляции биологических функций, методы определения в крови человека II Лабораторная медицина. - 2005. - № 7. - С.19-24.
9. Метельская В. А., Гуманова Н. Г., Литинская О. А. и др. Характеристика биохимических маркеров функции сосудистого эндотелия с применением клеточных культур II Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 2004. - № 2. - С. Э4-Э9.
10. Петряйкина Е. Е., Мартынова М. И. Исследование состояния кожи при сахарном диабете 1-го типа у детей неинвазивными методами (обзор литературы) II Mедицинский научный и учебнометодический журнал. - 2002. - № 11. - С. 64-69.
11. Флеров М. А., Смирнова Н. Н., Светлова З. В. Перекисное окисление белков плазмы крови больных СД типа 1 II Проблемы эндокринологии. - 200Э. - Т. 49. № 4. - С. 3-8.
12. Arulselvan P., Subramanian S. P. Beneficial effects of Murraya koenigii leaves on antioxidant defense system and ultra structural changes of pancreatic beta-cells in experimental diabetes in rats II Chem. biol. interact. - 2007 Jan. Э0. - № 165 (2). - Р. 155-164.
13. Asakawa T., Matsushita S. Coloring conditions of thiobarbituricacid test, for detecting lipid hydroperoxides II Lipids. -1980. - Vol. 15. - P. 1Э7-140.
14. Chang J. M., Kuo M. C., Kuo H. T., Chiu Y. W., Chen H. C. Increased glomerular and extracellular malondialdehyde levels in patients and rats with diabetic nephropathy II J. lab. clin. med. -2005. - № 146 (4). - Р. 210- 215.
15. Davila-Esqueda M. E., Vertiz-Hernandez A. A., Martinez-Morales F. Comparative analysis of the reno protective effects of pentoxifylline and vitamin E on streptozotocin-induced diabetes mellitus II Ren. fail. - 2005. - № 27 (1). - Р. 115-122.
16. Kobayashi S., Satoh M., Namikoshi T. et al. Blockade of serotonin 2A receptor improves glomerular endothelial function in rats with streptozotocin-induced diabetic nephropathy II Clin. exp. nephrol. - 2008. Apr. - № 12 (2). - Epub 2008. Jan. 5. - Р. 119-125.
17. Tchedre K. T., Huang R. Q., Dibas A., Krishnamoorthy R. R., Dillon G. H., Yorio T. Sigma-1 receptor regulation of voltage-gated calcium channels involves a direct interaction II Invest ophthalmol vis sci. - 2008. Nov. - № 49 (11). - Р. 4993-5002.
18. Zhang J. W., Xie D., Chen J. X. et al. Protective effect of Gui Qi mixture on progression of diabetic nephropathy in rats II Exp. clin endocrinol. diabetis. - 2006. Nov. - № 114 (10). - Р. 563-568.
Поступила 14.06.2012
Кубанский научный медицинский вестник № 3 (132) 2012
