ВЛИЯНИЕ ИЗОНИАЗИДА НА МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ СТАТУС ЛИМФОЦИТОВ И НА ИХ СКЛОННОСТЬ К АПОПТОЗУ, ИНДУЦИРОВАННОМУ ГИПЕРТЕРМИЕЙ Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Токсикологический вестник №5 (116)

Filatov B.N., Charova T.A.

Neuroendocrine mechanisms of the pathology development in patients who endured an acute intoxication by

organophosphorous agents

Research Institute of Hygiene, Toxicology and Occupational Pathology, Federal Medico-Biological Agency of Russia, Volgograd

To identify a role of neurohormonal disorders in the development of psychoneurological effects from acute intoxications by organophosphorous agents in 125 workers who had worked at a former facility of neural paralytic weapons (Volgograd Open-Joint-Stock Company-VOAO Khimprom), the functional status of adrenal cortex , thyroid gland and sympathoadrenal system was studied. Detected same-type hormonal disorders in patients both with organic and functional lesions of the nervous system give reasons to believe that they are based on a common mechanism of forming responses of the regulating system to changes in the internal medium.

Материал поступил в редакцию 21.09.2011 r.

УДК: 615.21/26: 612.117

Влияние изониазида

на метаболический статус лимфоцитов и на их склонность к апоптозу, индуцированному гипертермией

Долгушин М.В.1 , Гущин А.С.2, Юшков Г.Г.1

'НИИ биофизики ГУВПО Ангарской государственной технической академии Федерального агентства по образованию РФ

2 ОАО «Фармасинтез», г Иркутск

роническое пероральное введение изониазида или ком- Ключевые слова: изониазид, лимфоциты, ферменты, ци-

плекса изониазида с пиридоксином вызывало дозозави- тохимия, апоптоз.

симые изменения в активности дегидрогеназ и гидролаз в лимфоцитах периферической крови. Кроме того, введение токсической дозы изониазида приводило к снижению процентного числа клеток с морфологическими признаками апоп-тоза, индуцированного гипертермией.

Введение. Согласно результатам клинических и экспериментальных исследований, метаболические изменения, выявляемые в лимфоцитах крови при воздействии химических факторов, показывают зависимость от характера патологических и реактивных состояний организма, а также от тяжести интоксикации [1 - 4, 7].

Выраженная лабильность внутриклеточных ферментативных процессов наряду с относительной простотой взятия образцов крови для анализа позволяет использовать метаболическую оценку циркулирующих лимфоцитов в токсикологии лекарственных средств, в частности в ходе тестирования осложнений, индуцированных повышенной чувствительностью к противотуберкулёзным препаратам (ПТП) [1, 4, 7]. Кроме того, обнаруженные в модельных условиях особенности имму-нотоксического действия ПТП усиливают интерес к обменным процессам в лимфоидных клетках. В проведенных ранее экспериментах по изучению иммуноторопных влияний изониазида, одного из основных и наиболее эффективных лекарственных средств, используемых в комплексной химиотерапии туберкулёза, были отмечены существенные сдвиги в физиологической активности лимфоцитов крови, включая параметры, отражающие уровень пролиферации и выживаемости [13 - 15]. В таком случае рассмотрение реакции лимфоцитарных ферментов на изониазид представляется весьма актуальным, учитывая возможность выявления внутриклеточных изменений, имеющих отношение к механизмам иммунной и неспецифической защиты.

Цель настоящей работы состояла в том, чтобы изучить

состояние метаболических процессов в лимфоцитах периферической крови после продолжительного воздействия изони-азида в различных дозах. Помимо цитохимического анализа активности ферментов нами была поставлена задача оценить жизнеспособность клеток, определяя уровень индуцированного апоптоза. Планировалось исследовать реакцию лимфоцитов на изолированное введение изониазида, а также на воздействие последнего в сочетании с пиридоксином. Совместное применение этих двух препаратов продиктовано необходимостью профилактики побочных эффектов изониазида, способного нарушать метаболизм данного витамина и обострять его недостаточность, связанную с развитием туберкулёза.

Материалы и методы исследования. В опыт были взяты неинбредные белые крысы-самцы, массой 170 - 230 г. Содержание крыс в виварии и все манипуляции с ними соответствовали «Правилам лабораторной практики» (Приказ Минздрав-соцразвития России от 23 августа 2010 г. №708н). Всего было использовано 38 животных, в группу 1 (контрольную) входило 10 особей, в опытные группы - по 7 особей. Животных, составляющих опытные группы, подвергали воздействию препаратов, синтезированных в ОАО «Фармасинтез» (г. Иркутск), при этом вводили либо изониазид, либо изовит (комплекс изониазида и пиридоксина), перорально, ежедневно, в течение трёх месяцев в терапевтической дозе (5 мг/кг) или в токсической (100 мг/кг) по изониазиду. Контрольные животные вместо ПТП получали порцию дистиллированной воды. Доза в 5 мг/кг принималась в качестве терапевтической согласно инструкции, утверждённой Фармкомитетом Минздрава РФ

[7]. Токсическая доза была выбрана нами как превышающая терапевтическую дозу в 20 раз, исходя из рекомендованного ранее способа пересчёта в зависимости от уровня LD50 [9]. После прекращения введения препаратов проводили забор крови, которую использовали для цитохимического анализа ферментов, а также для оценки возможных изменений в жизнеспособности лимфоцитов, учитывая процентное число клеток, вступивших в апоптоз. Цитохимическими методами на мазках крови выявляли активность сукцинатдегидрогена-зы (СДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) по Р.П. Нарциссову [7], кислой фосфатазы (КФ) по Берстону [10] и неспецифической (нафтол-AS-ацетат) эстеразы (НЭ) по Лёффлеру [6]. Результаты определения уровня СДГ, ЛДГ и НЭ выражали в среднем числе гранул продукта реакции на клетку, а показатель активности КФ - в условных единицах среднего цитохимического коэффициента по L. Kaplow [6]. Для постановки теста на апоптоз образцы гепаринизированной крови инкубировали в течение 4 ч в условиях гипертермии (41 °С), после инкубации готовили мазки с последующим окрашиванием по Романовскому и подсчётом количества лимфоцитов с фраг-ментированным ядром [11]. Полученные данные обрабатывали статистически при помощи U-критерия (Манна - Уитни).

Результаты и их обсуждение. Лимфоциты периферической крови крыс, подвергавшихся воздействию ПТП, демонстрировали дозозависимую реакцию, затрагивающую значения всех определяемых параметров (табл.). Внутриклеточные сдвиги, индуцированные токсической дозой ПТП, были статистически значимыми относительно контроля и относительно группы животных, подвергавшихся терапевтическому влиянию лекарств. При этом хронический эффект терапевтической дозы был весьма незначителен и проявлялся лишь в активации КФ после воздействия изониазида. Реакция лимфоцитов на дополнительное введение пиридоксина также ограничивалась лишь особенностями в изменении активности КФ. Терапевтическая доза изовита не влияла на активность КФ, а его токсическая доза приводила к активации фермента. Параллельно интоксикация препаратами оказывала стимулирующее действие на СДГ и ЛДГ, тогда как активность НЭ и процентное число лимфоцитов, вступивших в апоптоз, достоверно снижалось.

В настоящее время эффекты изониазида на лимфоциты изучаются, как правило, в экспериментах in vitro, позволяющих охарактеризовать специфику цитотоксического действия препарата [1, 13, 14]. Однако аналогичные исследования in vivo представляются нам не менее актуальными, поскольку дают возможность зафиксировать внутриклеточные обменные преобразования, опосредованные перестройками на уровне системной (общеорганизменной) регуляции, в том числе обусловленные потенциальными модификациями гормонального звена. Установлено, что продолжительное лечение изониази-дом может приводить к усилению влияния глюкокортикоидов (ГК) на метаболический статус клеток крови, что следует из свойственной данному препарату способности индуцировать гиперфункцию коры надпочечников [7]. По существу, именно этот регуляторный сдвиг обосновано рассматривать в качестве опосредующего механизма обнаруженных нами внутриклеточных изменений. В частности, активация СДГ наблюдается при воздействии ГК на лимфоциты, выделенные из периферической крови пациентов после длительной ГК-терапии, что сопровождается пониженным пролиферативным ответом клеток на фитогемагглютинин (ФГА), тогда как в случае ин-гибирующего влияния ГК на СДГ нарушения пролиферации не происходит [5]. В данном отношении представляет интерес свойство изониазида ингибировать ФГА-индуцированную бласттрансформацию мононуклеарных клеток крови, что прослеживается при многократном пероральном введении препарата, но не после его добавления in vitro [15]. Вместе с тем, в динамике пролиферативного ответа лимфоцитов на ФГА активация дегидрогеназ (СДГ и ЛДГ) характерна для завершающего этапа, связанного с повышением численности молодых клеток [10], очевидно, ещё не имеющих полноценного рецепторного аппарата, и поэтому не способных реагировать на внешние стимулы, включая митогены. Действие ГК на лимфоциты крови может быть выражено аналогичным способом, то есть, в неспецифическом уменьшении чувствительности к митогенам и другим экзогенным воздействиям (включая понижение уровня апоптоза, индуцированного гипертермией), что, по всей видимости, имеет значение в реализации антиок-сидантной защиты [11].

Отмеченное нами снижение активности гидролаз наиболее

приемлемо объяснить мембраностабилизирующей функцией, закономерной для ГК [8]. При этом ферментативная реакция противоположной направленности (активация КФ и других лизосомальных ферментов в лимфоцитах крови) может иметь отношение к менее выраженному (физиологическому) усилению влияния ГК [16], вероятно, отражая способность последних к стимуляции катаболических процессов в лимфоид-ной ткани. В свою очередь несколько ослабленный ответ КФ на изовит по сравнению с ответом на изониазид, по-видимому, обусловлен свойством пиридоксина модулировать эффекты стероидных гормонов, ингибируя генную экспрессию, опосредованную через рецепторы к ГК [12]. В то же время, анализируя обнаруженное нами весьма незначительное влияние пиридоксина, необходимо учитывать, что целый ряд функций ГК (включая связывание с митохондриями), может быть реализован и без предварительного образования комплекса с внутриклеточными рецепторами, то есть, не опосредуется изменениями на уровне белкового синтеза [5].

Таким образом, внутриклеточные метаболические изменения, выявленные в настоящей работе, можно трактовать как неспецифические, связанные с общей (системной) реакцией на токсическое воздействие. В исследовании in vitro показано, что прямое (специфическое) влияние изониазида на лимфоциты проявляется в угнетении СДГ [1]. В условиях клиники снижение активности дегидрогеназ в лимфоцитах крови при развитии токсических побочных эффектов наблюдается в режиме комплексной химиотерапии туберкулёза, только в случае использования изониазида в сочетании с другими ПТП [7]. При этом в отличие от выявленного нами неспецифического ответа, токсические проявления, индуцированные введением комбинированных ПТП в ходе химиотерапии или контактом с изониазидом in vitro, могут приводить к уменьшению жизнеспособности лимфоцитов [7, 14]. Очевидно, что ферментативные сдвиги неспецифического характера, не позволяя определить вклад конкретного препарата в реализацию механизмов токсического действия, тем не менее, имеют значение в оценке состояния компенсаторных процессов, зависящих от особенностей экспозиции.

Выводы. Анализ метаболического статуса лимфоцитов крови при введении изониазида даёт возможность обнаружить комплекс дозозависимых эффектов, связанных с различиями в характере ферментативных изменений. Введение изониазида в терапевтической дозе приводит лишь к активации КФ, а в токсической дозе - к активации СДГ и ЛДГ, ингибированию КФ и НЭ, снижению числа клеток с морфологическими признаками апоптоза. Пиридоксин незначительно модифицирует реакцию лимфоцитов на изониазид, оказывая влияние только на уровень КФ, который не изменяется после введения терапевтической дозы препарата и возрастает в результате интоксикации.

Токсикологический вестник №5 (116)

Таблица

Влияние изониазида на активность ферментов и уровень ароптоза, индуцированного гипертермиеи, в лимфоцитах периферическом крови крыс

Изониазид Изониазид + пиридоксин (изовит)

Показатель Контроль терапевтическая доза токсическая доза терапевтическая доза токсическая доза

СДГ ЛДГ КФ НЭ Апоптоз 12,9 ± 0,5 18,1 ± 1,1 0,51 ± 0,03 7,2 ± 0,3 15,4 ± 1,2 13,2 ± 0,7 19,7 ± 0,7**## 17,9 ± 1,4 24,7 ± 2,0**# 0,61 ± 0,03* 0,36 ± 0,05*## 7,5 ± 0,4 4,6 ± 0,2**## 14,7 ± 1,1 9,3 ± 1,2**## 12,8 ± 1,2 17,5 ± 0,8**## 19,3 ± 0,8 24,9 ± 0,9**## 0,52 ± 0,03 0,69 ± 0,02**## 7,2 ± 0,4 4,5 ± 0,6**## 15,3 ± 1,3 10,7 ± 1,8*#

Примечания: Показана достоверность различий по отношению к контролю ( * - р < 0,05; ** - р < 0,01) и по отношению к группе животных, подвергавшихся воздействию препаратов в терапевтической дозе (# - р < 0,05; ## - р < 0,01).

СДГ - сукцинатдегидрогеназа; ЛДГ - лактатдегидрогеназа; КФ - кислая фосфатаза; НЭ - неспецифическая (нафтол-AS-ацетат) эстераза.

Результаты оценки активности СДГ, ЛДГ и НЭ представлены в среднем числе гранул продукта реакции на клетку; показатели активности КФ - в единицах среднего цитохимического коэффициента, уровень индуцированного апоптоза - в процентном числе лимфоцитов с фрагментированным ядром.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Васильева О.А., Уразова О.И., Серебрякова В.А. и др. Оценка влияния противотуберкулёзных препаратов на цитохимический статус лимфоцитов in vitro // Пробл. туберкулёза, 2008. - № 3. - С. 27-30.

2. Долгушин М.В., Потрохов О.И. Цитохимия лимфоцитов периферической крови в оценке тяжести острой интоксикации продуктами горения // Клин. лаб. диагност., 2010. - № 10. - С. 18.

3. Долгушин М.В., Соболев В.Г. Изменение активности дегидрогеназ и кислой фосфатазы в лимфоцитах периферической крови в динамике заживления ожоговой раны // Известия Самарск. научн. центра РАН, 2009. - Т. 11. - № 1 (Вып. 5). - С. 947-949.

4. Долгушин М.В., Юшков Г.Г., Гущин А.С. Особенности метаболических изменений в лейкоцитах крови при интоксикации противотуберкулёзными препаратами // 3-й съезд токсикологов России: Тезисы докладов. - М., 2008. - С. 95-96.

5. Иващенко Ж.А., Кузнецова О.П., Комиссарова И.А., Калашникова Е.А. Изучение гормоночувстви-тельности у больных гломерулонефритом // Терап. архив, 1996. - Т. 68. - № 6. - С. 13-16.

6. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В.В. Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. -368 с.

7. Мишин В.Ю. Медикаментозные осложнения комбинированной химиотерапии туберкулёза лёгких. - М.: ООО "Мед. информ. агентство", 2007. - 248 с.

8. Панин Л.Е., Маянская Н.Н. Лизосомы. Роль в адаптации и восстановлении. - Новосибирск: Наука, 1987. - 200 с.

9. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М.: Ремедиум, 2005. - 405 с.

10. Хейхоу Ф.Г.Дж., Кваглино Д. Гематологическая цитохимия. - М.: Медицина, 1983. - 320 с.

11. Черных Е.И., Языков К.Г., Семке В.Я. Апоптоз лейкоцитов периферической крови, индуцированный действием гипертермии и преднизолона, у лиц с расстройством адаптации // Бюл. экспер. биол.,

2002. - T. 134. - № 12. - C. 617-619.

12. Allgood V.E., Cidlowski J.A. Vitamin B6 modulates transcripdonal activation by multiple members of the steroid hormone receptor superfamily // Biol. Chem., 1992. - V. 267. - № 6. - P. 3819-3824.

13. Kucharz E.J. Studies on immunomodulatory properties of isoniazid. Influence of isoniazid on responsiveness of peripheral blood mononuclear cells to interleukm-2 // Cent. Eur. J. Public Health, 1995. - V. 3. - № 2. - P. 65-66.

14. Kucharz E.J., Sierakowski S.J. Studies on immunomodulatory properties of isoniazid. Effect of isoniazid on mitogen and anti-CD3 antibody - induced proliferation of human peripheral blood mononuclear cells and T-cells // J. Hyg. Epidemiol. Microbiol. Immunol., 1990. - V. 54. - № 1. - P. 99-105.

15. Ravn P., Linnet J., Klokker M., Pedersen B.K. Effects of isoniazid treatment on human lymphocyte proliferative response, lymphocyte subsets and natural killer cell activity // Immunopharmacology, 1995. - V. 30. - № 3. - P. 247- 253.

16. Stojek W., Borman A., Glac W. et al. Stress-induced enhancement of activity of lymphocyte lysosomal enzymes in pigs of different stress-susceptibility // J. Physiol. Pharmacol., 2006. - V. 57. (Suppl. № 8). - P. 61-72.

Dolgushin M.V.1 , Gushchin A.S.2 , Yushkov G.G.1 Influence of izoniazid on the metabolic status of lymphocytes and their predisposition to hyperthermia-induced apoptosis

1 Institute of Biophysics, Angarsk State Technical Academy, Angarsk 2Open Joint-Stock Company «Pharmasynthez», Irkutsk

A chronic peroral administration of isoniazid or an isoniazid complex with pyrodoxin caused dose-dependent changes in the dehydrogenases and hydrolases activity in peripheral blood lymphocytes. In addition, the administration of isoniazid toxic doses led to the decrease of a percent number of cells with apoptosis morphologic signs induced by hyperthermia.

Материал поступил в редакцию 24.11.2011 г.

УДК 615.28:615.06:616.12

Влияние изониазида на сократимость

и адренореактивность сердца крысы

Гриценко Н.С., Долгих В.Т.

Омская государственная медицинская академия

В

эксперименте на модели изолированного изоволюми- Ключевые слова: изониазид, миокард, сократимость,

чески сокращающегося сердца крысы изучено влияние адренореактивность.

изониазида на миокард. Установлено, что сам препарат не оказывает прямого токсического влияния на изолированные сердца крыс, что позволяет предполагать, что кардиоток-сическое воздействие оказывают его метаболиты, но изониазид повышает чувствительность адренорецепторов миокарда к адреналину.

Введение. Изониазид является основным препаратом в большинстве схем лечения больных туберкулезом, как наиболее эффективный противотуберкулезный препарат [7]. Только изониазид используется в качестве монотерапии при первичной и вторичной химиопрофилактике контактных по туберкулезу и инфицированных лиц [4,5,9]. Продолжитель-

ность приема препарата составляет не менее полугода, что обусловливает высокий риск развития токсических осложнений, обусловленных как самим препаратом, так и продуктами его метаболизма [5,7,11]. Существующее в настоящее время представление о токсичности препарата основано в большей мере на клинических проявлениях его побочных