CC BY
185
Медицинская иммунология 2000, Т. 2, № 4, стр 409-414 © 2000, СПб РО РААКИ
Оригинальные статьи
ВЛИЯНИЕ ИНТЕРФЕРОНА-а НА ЦИТОКИНОВЫЙ ПРОФИЛЬ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С
Маммаев C.H., Лукина Е.А.*, Луговская С.А.**, Шульпекова Ю.О., Левина A.A.*, Почтарь М.Е.**, Ивашкин В.Т.
Московская медицинская академия им. И. М. Сеченова,
Гематологический научный центр РАМН*,
Российская медицинская академия последипломного образования М3 РФ**
Резюме. В настоящем исследовании авторами изучено содержание провоспалительных цитокинов (TL-lß, IL-
6, TNFa) и ростовых факторов (GM-CSF, TGF-lß) в сыворотке крови, а также экспрессия антигенов CD 14 и CD95 на моноцитах периферической крови у 25 больных хроническим вирусным гепатитом С (ХВГ С) до и после 12-недельного курса терапии альфа-интерфероном (IFNa). У нелеченых больных ХВГ С выявили достоверное повышение концентрации TNFa, GM-CSF и TGF-lß, а также коэкспрессию антигенов CD 14 и CD95 на 61% моноцитов крови. Через 3 месяца после начала лечения IFNa наблюдали достоверное снижение концентрации TNFa, GM-CSF и экспрессии CD95 на моноцитах, а также значительное, но недостоверное уменьшение уровня TGF-lß в сыворотке крови, что ассоциировалось с положительной динамикой клинико-лабораторных и вирусологических показателей у исследованных больных. Динамика сывороточных показателей провоспалительных цитокинов и факторов роста, а также экспрессии CD95 на моноцитах крови больных ХВГ С на фоне эффективного лечения IFNa свидетельствует о важной роли механизмов активации цитокиновой сети и программированной гибели клеток в патогенезе хронической HCV-инфекции. Модуляция функций иммунокомпетентных клеток и изменение цитокинового профиля сыворотки крови может явиться одним из механизмов противовирусного действия IFNa у больных с хронической HCV-инфекцией.
Ключевые слова: хронический вирусный гепатит, цитокины, апоптоз, иптерферонотерапия.
Mammaev S.N., Lukina Е.А., Lugovskaja С.A., Shulpekova Yu.О., Levina А.А., Pochtar М.Е., Ivashkin V.T.
THE INFLUENCE OF INTERFERON-a ON CYTOKINE PROFILE IN CHRONIC VIRAL HEPATITIS С
(CVH C)
Abstract. The present study was undertaken to estimate the serum levels of proinflammatory cytokines (IL-ip, IL-6, TNFa), growth factors (GM-CSF, TGF-1(3) and expression of superficial molecules CD14, CD95 on peripheral blood monocytes in patients with CVH С before and after 12-week IFN-a treatment. 25 patients were studied.
Seum concentrations of TNFa, GM-CSF, TGF-ip were increased before the beginning of therapy (p<0.05) At the same time coexpression of CD14, CD95 was observed in 61% of peripheral blood monocytes.
After 12-week IFN-a treatment the positive clinical, biochemical results and HCV-RNA elimination were observed in all patients. Significant reductions in serum concentrations of TNFa, GM-CSF and CD14-, CD95-expression (p<0.05) were observed. The level of TGF-1 j3 was also markedly decreased (p<0.05).
During IFN-a treatment alterations in proinflammatory cytokines’ and growth factors’ serum levels and changes in CD 14, CD95 superficial molecules’ expression were determined. This finding proves the important role of increased
_____________________________________________________ cytokine production and programmed cellular death in
Адрес для переписки: Лукина Елена Алексеевна - pathogenesis of CVH С.
д.м.н., ведущий научный сотрудник Modulation of immunocompetent cells’ function and
Гематологического научного центра РАМН; cytokine network seems to be one of the various mecha-
Москва, Новозыковский ігроезд, 4a. nisms of IFN-a activity in CVH C. (MedJmmunol., 2000,
Тел./факс: (095) 212-09-23. vol.2, N4, pp 409-414)
Вирус гепатита С (HCV) представляет собой один из ведущих факторов патологии печени у человека, являясь причиной 20% случаев острых гепатитов, 70% хронических гепатитов (ХВГ), 40% циррозов печени в терминальной стадии и 60% случаев гепатоцеллюляр-ной карциномы в индустриально развитых странах [3].
Характер иммунного ответа на вирусную инфекцию зависит от доминирующего участия клонов Т-лимфо-цитов-хелперов (Th) 1 и 2 типов, которые различаются по спектру продуцируемых ими цитокинов. Активация Thl, продуцирующих интерферон (IFNy), интерлейкин (IL-2), туморнекротизирующий фактор (TNFa) и ß, ведет к стимуляции функций Т-лимфоцитов и макрофагов и развитию иммунного ответа по клеточному типу, который играет решающую роль в защите от внутриклеточных микроорганизмов, включая вирусы. Th2 сек-ретируют IL-4, IL-5,TL-6, IL-9, IL-10 и IL-13, стимулирующие преимущественно гуморальное звено иммунитета. Нарушение баланса продукции цитокинов ТЪ1ЯЪ2 клетками играет важную роль в иммунопатогенезе хро-низации и прогрессирования HCV-инфекции.
В настоящее время единственным способом эти-отропного лечения ХВГ С с доказанной эффективностью является применение IFN-a. Противовирусный эффект IFN-a осуществляется опосредованно через синтезированные под его влиянием ферменты и ингибирующие пептиды, которые блокируют процессы транскрипции и трансляции вирусного генома и индуцируют каскад реакций, ведущий к элиминации вирусной РНК (HCV RNA).
IFNa обладает широким спектром иммунологической активности: стимулирует фагоцитоз, повышает активность естественных киллеров (NK-кле-ток) и других эффекторных клеток иммунной системы, индуцирует выработку цитокинов, усиливает экспрессию продуктов главного комплекса гистосовместимости 1 класса и т.д.
Влияние на продукцию межклеточных медиаторов рассматривается как один из возможных путей позитивного терапевтического эффекта IFNa при HCV-инфекции. Так, перед началом курса интерфе-ронотерапии уровень IL-10 в сыворотке крови (но не HCV RNA) был значительно выше у лиц, не ответивших на лечение, чем у больных с устойчивым положительным ответом [11].
К сожалению, приходится констатировать, что стабильных положительных результатов лечения при ХВГ С удается достичь не более чем у 20-25% больных [10, 12]. В связи с этим продолжается изучение механизмов противовирусного действия IFNa при HCV-инфекции, что позволит найти новые пути усиления эффективности препарата.
Цель исследования
Цель исследования - изучение динамики сывороточных показателей IL- lß, IL-6, TNFa, гранулоцитар-
но-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и трансформирующего фактора роста (TGF)-lß, а также экспрессии поверхностных антигенов CD 14, CD95 на моноцитах периферической крови у больных ХВГ С на фоне лечения IFNa.
Материалы и методы
Исследования проведены у 25 больных (15 мужчин, 10 женщин) ХВГ С в возрасте от 17 до 48 лет (средний возраст 32,5±4,8). Контрольную группу составили 25 здоровых добровольцев из числа студентов и ординаторов (средний возраст 25,5±2,3) ММА им. И.М. Сеченова.
Диагноз ХВГ С устанавливали на основании клинического обследования и результатов лабораторных и инструментальных методов исследований (ультразвуковое исследование, эзофагогастродуоде-носкопия, морфологическое исследование биоптатов печени). Маркеры HCV в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом. У всех больных методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) исследовали в крови HCV RNA.
Морфологическое исследование биоптатов печени проведено у 21 (84%) больных с определением индекса гистологической активности по Knodell и степени фиброза по Desmet. Иммуноферментным (ELISA) методом с использованием тест-систем фирмы “R&D systems” (США) определяли в сыворотке крови концентрацию цитокинов: IL-lß, IL-6, TNFa, GM-CSF и TGF-lß. Исследование антигенов CD 14 и CD95 на моноцитах проводили на проточном цитоф-луориметре (Partes, США) с помощью моноклональных антител CD14-FITC и CD95-R-PRE (Caltag.CIIIA). После установления клинического диагноза всем больным ХВГ С была назначена терапия IFNa-2b (Интроном А) в дозе 3 ME 3 раза в неделю. Изучение концентрации цитокинов в сыворотке крови и экспрессии CD 14 и CD95 на моноцитах проводили до начала и после 12-недельного курса интерферо-нотерапии.
Полученные результаты обработаны статистически по стандартной программе с вычислением достоверности различия по критерию t Стыодента.
Результаты
Клиническая картина у большей части больных ХВГ была скудная. В основном больные предъявляли жалобы на вялость, слабость, быструю утомляемость, снижение трудоспособности. При объективном осмотре выявлялась нерезко выраженная гепа-томегалия, как правило, без сочетанного увеличения селезенки. Активность сывороточных трансаминаз была незначительно повышенной (1,5-3 нормы) у 18 (72%) больных, умеренно повышенной (3,5-5 норм) у 7 (28%) больных.
У всех обследованных больных ХВГ С в крови обнаружены анти-HCV антитела и HCV RNA , что в совокупности с результатами биохимического исследования крови явилось показанием для назначения IFNcc.
При гистологическом исследовании диагностических биоптатов печени выявлена картина гепатита с минимальной и слабовыраженной активностью воспалительного процесса (3-8 баллов по Knodell) у 67% больных, с умеренной активностью (9-12 баллов) - у 33%.
По степени фиброза печени больные ХВГ разделились следующим образом: слабый и умеренный фиброз (1-2 балла) обнаружен у 81% больных, тяжелый фиброз (3 балла) -у 19% больных.
Концентрация IL-lß, IL-6, TNFa, GM-CSF и TGF-lß была повышенной, соответственно, у 13 (52%), 15 (60%), 18 (72%), 20 (80%) и у 19 (76%) больных ХВГ С. Содержание IL-lß и IL-6 достоверно не отличалось (р>0,05) от аналогичных показателей у лиц контрольной группы. Средние значения TNFa, GM-CSF и TGF-lß достоверно превышали соответствующие показатели контроля (табл.1). Уровень TNFa положительно коррелировал с активностью АЛТ (г=0,14). Концентрация TGF-lß положительно коррелировала с индексом гистологической активности (г=0,16), т.е. максимальные уровни данного цитокина были у больных с наивысшим индексом гистологической активности.
При изучении экспрессии антигенов CD 14 и CD95 обнаружена коэкспрессия CD14 и CD95 на 61% моноцитов у 19 (76%) больных ХВГ С.
В процессе лечения 5 больных были исключены из исследования вследствие: 2 - нарушения режима, 1 - возникновения рецидива заболевания на фоне лечения, 1 - обострения скрыто протекающего аутоиммунного тироидита, 1 - выраженного депрессивного синдрома.
У всех оставшихся под наблюдением больных наблюдалась положительная клинико-лабораторная динамика, что проявлялось нормализацией ферментов цитолиза и элиминацией НСУ РНК.
После 12-недельного курса лечения у всех больных отмечалось достоверное (р<0,05) снижение концентрации Т№а, СМ-С8Р и у 70% больных значительное уменьшение уровня ТСР-1(3 по сравнению с исходными данными. Показатель П^-б у 60% больных имел тенденцию к повышению и достоверно (р<0,05) отличался от контрольного показателя (табл.1).
Через 3 месяца терапии экспрессия поверхностного антигена СОЭ5 у 75% больных достоверно (р<0,05) снизилась по сравнению с исходными данными и выявлялась на 26% моноцитов крови (см.рис.1).
Обсуждение
Основными клиническими проявлениями у обследованных больных ХВГ С были астеноневроти-ческий синдром и умеренная гепатомегалия (как
% моноцитов
"У р<0,05
~Г р<0,05 1 -у
-± . _ L —,
1 2 3
Рис.1. Коэкспрессия С014 и С095 на моноцитах крови больных хроническим вирусным гепатитом С до лечения (1), после лечения (2) и лиц контрольной группы (3). р<0,01 по отношению к контролю, р<0,05 между группами.
Табл.1. СОДЕРЖАНИЕ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ И ФАКТОРОВ РОСТА В СЫВОРОТКЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ ХРОНИЧЕСКИМ ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С ДО И ПОСЛЕ 12-НЕДЕЛЬНОГО КУРСА ТЕРАПИИ ИНТЕРФЕРОНОМ-а, х+т
Группа IL-1 ß, пкг/мл IL-6, пкг/мл TNFa, пкг/мл GM-CSF, пкг/мл TGF-1ß, пкг/мл
Больные ХГС, п=25 4,76 ± 1,2 17,2 ± 5,3 62,4 ± 3,6** 18,7 ± 3,3** 3096 ± 412*
Больные ХГС после лечен., п=20 4,42 ± 0,9 25,8 ± 3,7* 36,1 ± 3,4*** 8,9 ± 1,3*** 2284 ± 240
Контроль, п=25 3,52 ± 0,4 5,5 ± 2,6 19,2 ± 2,8 3,12 ± 1,4 767 ± 153
Примечание: * R<0,05, **р<0,01 по сравнению с контролем, ***р<0,05 между группами больных.
правило, без сопутствующего увеличения селезенки). Учитывая, что у данного контингента больных выявлены повышенные концентрации провоспали-тельных цитокинов и ростовых факторов по сравнению с контролем, можно предположить, что цито-кины играют определенную роль в развитии таких проявлений заболевания, как слабость, утомляемость, похудание, субфебрильная лихорадка и др. Подобные предположения высказываются и другими авторами [8].
На поверхности моноцитов/макрофагов идентифицировано большое количество антигенов, из них наиболее характерным считается CD14, который функционирует как рецептор для липополисахари-дов клеточной стенки грамотрицательных бактерий и кодируется на 5-й хромосоме непосредственно вблизи генов, кодирующих факторы роста кроветворных клеток: GM-CSF, IL-3, IL-4 и IL-9 [2].
Мембранная молекула Fas (CD95) является специализированным рецептором сигналов к индукции апоптоза и принадлежит к семейству рецепторов для TNFa и фактора роста нервов. Естественным лигандом для Fas-рецептора служит молекула FasL (гомолог TNFa), который экспрессируется на части клеток под влиянием активации. Связывание CD95 с Fas-лигандом индуцирует апоптоз клеток, экспрессирующих CD95.
Изучение коэкспрессии CD14 и CD95 позволило выявить активацию циркулирующих моноцитов крови у обследованных больных ХВГ С. Необходимо отметить, что цитокины, исследованные нами в данной работе, относятся, преимущественно, к монокинам, т.е продуктам моноцитов и макрофагов.
Известно, что факторами, способствующими пер-систенции HCV, являются генетическая неоднородность, высокая мутационная изменчивость вирусного генома (одновременное существование “квазиштаммов”), презентация антигенов, распознавание которых Т-лимфоцитами затруднено, иммунологическая толерантность к HCV, “мимикрия” иммунных медиаторов и др. [1].
Повышенная экспрессия CD95 на моноцитах крови больных ХВГ С, коррелирует с высокой концентрацией TNFa в сыворотке и, возможно, указывает на использование HCV механизма апоптоза моноцитов для своего выживания в организме хозяина. Моноциты и макрофаги выполняют функции профессиональных антигенпрезентирующих клеток и представляют антиген Т-лимфоцитам. Можно предположить, что опосредованный HCV апоптоз моноцитов приводит к нарушению процессинга и презентации вирусных антигенов, что, в свою очередь, является важным механизмом персистенции HCV-инфекции и требует дальнейших исследований.
Снижение экспрессии поверхностного антигена CD95 на фоне лечения IFNa может свидетельство-
вать о наличии дополнительного механизма противовирусного действия данного препарата: снижение интенсивности апоптоза моноцитов, повышение ан-тигенпрезентирующей функции клеток, что способствует элиминации вируса.
Низкие показатели 1Ь-1(3 у больных ХВГ С, вероятно, обусловлены чрезвычайной лабильностью и быстрым распадом данного цитокина в сыворотке крови.
Основным вкладом 1Ь-6 в развитие воспалительных реакций является участие в синтезе острофазовых белков гепатоцитами. По-видимому, у исследованных нами больных ХВГ С с низкой активностью воспалительного процесса, определяемого по уровню АЛТ и данным гистологического исследования печени, выработка 1Ь-6 клетками иммунной системы невелика.
Т№а является ключевым медиатором воспалительных процессов и клеточных иммунных реакций. Установленный нами, достоверно повышенный уровень ТОТа у больных ХВГ С свидетельствует о важной роли данного цитокина в реализации механизмов противовирусной защиты, что согласуются с данными литературы [14]. Однако следует учитывать, что противовирусная активность Т№а в условиях персистенции НСУ, по-видимому, недостаточна, что может быть обусловлено, например, повышенной секрецией растворимых рецепторов, связывающих Т№а [17].
ОМ-СБР привлекает внимание исследователей не только как ростовой фактор, но и как плейотроп-ный компонент цитокиновой сети, способный индуцировать продукцию макрофагами других цитокинов: ТОТа, М-СБР, С-СБР, 1Ь-1. Повышенные концентрации СМ-СБР у исследованных нами больных ХВГ С могут свидетельствовать о его способности повышать фагоцитарную, микробицидную и тумо-рицидную активность макрофагов, что приближает данный цитокин по спектру эффектов к провос-палительным [4]. вМ-СБР совместно с ТОТа вызывает синдром повышенной проницаемости сосудов [16] и, вероятно, имеет значение в формировании гепатомегалии.
Достоверно более высокие по сравнению с контролем показатели концентрации ТОР1(3 - одного из важнейших противовоспалительных цитокинов - у больных ХВГ С могут отражать слабую противовирусную активность основных медиаторов воспаления. В качестве гипотетического механизма можно предложить как непосредственное подавление ТвР-1(3 экспрессии генов провоспалительных цитокинов (1Ь-1, Т№а), так и индукцию синтеза растворимых рецепторов к ним [5]. ТОР1Р блокирует индуцированное ШМу усиление синтеза Т№а, который необходим для стимуляции продукции нитроксидных радикалов, осуществляющих внутриклеточное уничтожение микроорганизмов [13].
Помимо противовоспалительной активности, ТСБ1 (3 является мощным профиброгеиным фактором. Установленная нами корреляционная связь уровня ТСИ-ф с индексом гистологической активности ХВГ С указывает на широту регуляторного действия данного цитокина. ТСР1 (3 может блокировать воспалительную реакцию, одновременно растормаживая синтез коллагена и обеспечивая ремоделировапие внеклеточного матрикса [6, 9].
Изменение баланса цитокинов на фоне лечения №N06 может отражать некоторые механизмы ингибирующего воздействия данного препарата на НСУ-инфекцию. Снижение концентраций Т№ос, вМ-СБР и ТОР-1Р на фойе лечения ШИа свидетельствуют о важной роли активации цитокиновой системы в патогенезе хронической НСУ-инфекции.
Один из механизмов контроля процессов фибро-генеза в печени определяется продукцией макрофагами антифиброгенных цитокинов, к числу которых относится и ШЫа [7]. Результаты нашей работы показали, что эффективное лечение 1РКа сопровождается снижением уровня ТОР-1(3 в сыворотке крови, что, возможно, отражает подавление печеночного фиброгенеза.
Повышение концентрации 1Ь-6 на фоне лечения №N(2 по результатам наших исследований остается не вполне понятным. Возможно, этот факт отражает двойственную роль 1Ь-6 в развитии воспаления: являясь по своей природе провоспалительным цито-кином, 11.-6 может оказывать противовоспалительное действие, ограничивая выработку других провос-палительных цитокинов, что отражает реципрокные взаимоотношения между различными цитокинами. Другим возможным объяснением может служить способность №N-0; индуцировать синтез мРНК 1Ъ-6 в мононуклеарных клетках крови [15].
Выводы
1. У 25 нелеченых больных хроническим гепатитом С выявили достоверное по сравнению с контролем увеличение концентрации туморнекротизирую-щего фактора-а, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и трансформирующего фактора роста-1(3 в сыворотке крови, а также повышенную экспрессию поверхностного антигена СЭ95 на моноцитах крови.
2. После 12-недельного курса лечения интерфе-роном-а уровни туморнекротизирующего факто-ра-а, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и экспрессия СБ95 на моноцитах достоверно снизились, а концентрация трансформирующего фактора роста-1(3 - снизилась, но недостоверно, по сравнению с исходными уровнями, что ассоциировалось с положительной динамикой биохимических и вирусологических
показателей у исследованных больных хроническим гепатитом С.
3. Динамика сывороточных показателей провос-палительных цитокинов, факторов роста и экспрессии CD95 на моноцитах крови больных хроническим гепатитом С на фоне эффективного лечения интер-фероном-а свидетельствует о важной роли активации цитокиновой сети и механизмов программированной гибели клеток в патогенезе хронической HCV-инфекции.
Список литературы
1. Ивашкин В.Т., Маммаев С.Н., Буеверов А.О., Шульпетсова Ю.О., Маевская М.В., Галимова С.Ф. Механизмы иммунного ускользания при вирусных гепатитах // Рос.журн.гастроэнтерол.,гепатол.,ко-лопроктол. - 2000. - №5. - С. 14-19.
2. Лукина Е.А. Система мононуклеарных фагоцитов п биологические эффекты провоспалительных цитокинов. // Рос.журн.гастроэнтерол.,гепатол.,ко-лопроктол.-1998. - №5. - С.7-13.
3. Consensus Statement. EASL International Consensus Conferense on hepatitis C. // J.Hepatol. -1999. - Vol.30 -P.956-961
4. de Villers W., Fraser I., Hughes DA., Doyle AG., Gordon S. Macrophage-colony-stimulating factor selectively enchances macrofage scavenger receptor expression and function. //J. Exp. Med. - 1994. - Vol. 180.
- P.705-709.
5. Dinarello C. Inflammatory Cytokine Antagonist. -Philadelphia. - 1994. - P. 1-20.
6. Friedman S. The cellular basis hepatic fibrosis mechanisms and treatment strategies // New Eng.J. - 1993.
- Vol.328. - P.1828-1835.
7. Jimenez S., Freundlich B., Rosenbloom J. Selective inhibition of human diploid fibroblast collagen synthesis by interferons // J.Clin. Invest. - 1984. - Vol.74. - P. 1112-1116.
8. Kenneth J.S., Nicholas W.L., Lisa C., Robert М., Steven L. Cytokines and the liver//J.Hepatology. - 1997. -Vol.27. - P.l 120-1132.
9. Knittel Т., JanneckT., Muller L. Transforming growth factor -1 beta-regulated gene expression of Ito cells // Hepatology. - 1996. - Vol.24, №2. - P.352-360.
10. Knolle P, Kremp S, Hohler T et al. Viral and host factors in the prediction of response to interferon-alpha therapy in chronic hepatitis С after long-term follow-up. // J.Viral Hepat- 1998.-Vol.5. - P.399-406.
11. Kurushita N, Nhayashi N, Katayama K. High levels of serum interleukin-10 are associated with a poor response to interferon treatment in patients with chronic hepatitis C. // Scand.J.Gastroenterol. - 1997. - Vol.2 - P.169-174.
12. McHutchison J, Gordon S, Schiff E et al. Interferon alpha-2b alone or in combination with ribavirin as initial treatment for chronic hepatitis C. Hepatitis Interventional Therapy Group. // N.Engl.J.Med. - 1998. - Vol.339. -P.1485-1492
13. Nathan C. Workshop on Molecular Mechanisms of Macrofage Activation. - Madrid. - 1993,- P.53-52.
14. Nelson DR, Lau JY. Host immune response in hepatitis C virus infection. // Viral Hepat.- 1996,- Vol.2. -P.37-48.
15. Nobuyuki I., Sumio K., Shinji T., Shinichi K., Hirofumi T., Yuichi M.,Yuchi M. Induction of Interleukin-6 by Interferon alfa and its abrogation by a serin protease inhibitor in patients with chronic hepatitis C //
Hepatology. - Vol.23, №.4 - 1996. -P.669-675.
16. Schawager I., Jungi T.W. Effect of human recombinant cytokines on the production of macrophage procoagulant activity // Blood. - 1994. - Vol.83, №1 -P.152-160.
17. Zylberberg H, Rimaniol AC, Pol S , Soluble tumor necrosis factor receptors in chronic hepatitis C: a correlation with histological fibrosis and activity.//J.HepatoI.- 1999.
- Vol.30. - P.185-191.
поступила в редакцию 24.10.2000 принята к печати 17.11.2000
