CC BY
66
УДК 577.151:663.531
Влияние гидролитических ферментов на состав концентрированного зернового сусла
Л.В. Римарева, д-р техн. наук, профессор, академик РАН; М.Б. Оверченко, канд. техн. наук; Н.И. Игнатова; Е.М. Серба, д-р биол. наук, профессор; Н.Н. Мартыненко, д-р биол. наук ВНИИ пищевой биотехнологии - филиал ФИЦ питания и биотехнологии, г. Москва
Одной из важнейших задач перерабатывающей промышленности сегодня является реализация современных биотехнологических методов рационального использования высокомолекулярных полимеров сельскохозяйственного сырья с целью снижения его технологических потерь, сокращения образования отходов производства и повышения выхода целевого продукта.
Развитие ресурсосберегающих технологий производства спирта предусматривает повышение концентрации зернового сусла [1]. Существующее в России промышленное производство спирта основано на сбраживании зернового сусла с концентрацией растворимых сухих веществ 16-22 %. Повышение его концентрации до 30-35% позволит сократить объем образования барды почти в 2 раза. Для приготовления высококонцентрированного сусла необходим рациональный подбор состава гидролитических ферментов, учитывающий их субстратную специфичность и механизм действия. Процессы биокаталитической конверсии должны обеспечивать эффективный гидролиз: ксиланов зернового сырья - для снижения вязкости сусла,
глюканов - для повышения уровня концентрации глюкозы и белковых веществ - для обогащения сусла легкоусвояемым аминным азотом [2-4].
Перспективным способом, способствующим повышению эффективности спиртового производства и снижению образования отходов, является приготовление зерновых сред с концентрацией растворимых сухих веществ (РСВ) свыше 25 % и подбор комплексной ферментативной системы, катализирующей глубокий гидролиз белка и полисахаридов сырья, с получением высококачественного зернового сусла, обогащенного ассимилируемыми дрожжами моно-и дисахаридами и свободными аминокислотами.
Цель работы - исследование влияния ферментов амилолитическо-го, глюкоамилазного, ксиланазного и протеолитического действия на качество концентрированного зернового сусла, приготовленного на основе пшеницы, кукурузы и ржи.
объектами исследований служили пшеничное, ржаное и кукурузное сусло, приготовление которых осуществляли по «мягкой» механико-ферментативной схеме разваривания при температуре до 90...95 °С и
25
III
15
10
о -v-=
Пшеница Кукуруза
АС+ГлС+КС
= АС+ГлС+КС+ПС
Пшеница Кукуруза Рожь АС+ГлС+КС АС+ГлС+КС+ПС
а б
Рис. 1. Концентрация общих (а) и свободных (б) аминокислот в зерновом сусле (РСВ 30%) в зависимости от состава ферментного комплекса
гидромодуле 1:1,8, создавая концентрацию растворимых сухих веществ (РСВ) 24-30 % [5]. В зависимости от поставленных задач применены различные ферментные системы: для разжижения крахмала зернового сусла использовали ферментный препарат - источник термостабильной а-амилазы (АС); осахаривание крахмала и некрахмальных полисахаридов сусла осуществляли источниками глюкоамилазы (ГлС) в дозировке 6,0 - 12,0 ед. ГлС/г крахмала и ксиланазы (КС) -0,3 - 0,4 ед. КС/г; для протеолиза белковых веществ вводили источник кислой протеазы из расчета 0,2-0,3 ед ПС/г.
Определение амилолитической активности (АС) проводили по ГОСТ Р 54330 - 2011 [6], общей протеоли-тической активности (ПС) - по ГОСТ Р 53974 - 2010 [7], ксиланазной -по ГОСТ Р 55302 - 2012 [8].
Концентрацию и аминокислотный состав зернового сусла определяли на аминокислотном анализаторе Knauer; концентрацию свободных углеводов определяли в лаборатории технохимконтроля с использованием рефрактометрического детектора RID-10A на колонке Rezex RHM-Monosaccharide H+, 300x7,80 (температура в колонке 800С, элюент H2O); исследования ионного состава зернового сусла выполняли в лаборатории газовой хроматографии с использованием системы капиллярного электрофореза PrinCE 560, оснащенного кондуктометрическим детектором [9, 10].
Исследовано влияние ферментов различной субстратной специфичности и механизма действия, источников комплекса карбогидраз (а-амилазы, глюкоамилазы и ксиланазы - АС+ГлС+КС) и комплекса, включающего дополнительно протеазы (АС+ГлС+КС+ПС), на содержание в зерновом сусле общих и свободных аминокислот (рис. 1).
Установлено, что использование полного комплекса ферментов, включающего протеазы, обеспечивает повышение концентрации свободных аминокислот в 2,8-3,3 раза в зависимости от вида перерабатываемого зернового сырья.
Исследовано влияние ферментных комплексов на содержание сбраживаемых углеводов (РВ), в т. ч. мальтозы и глюкозы, в зерновом сусле концентрации 24 % РСВ и 30% РСВ. Показано, что воздействие комплекса ферментов карбогидразного и протеолитического действия на биополимеры зернового сырья повышает не только концентрацию ассимилируемых дрожжами аминокислот, но и концентрацию углеводов (рис. 2-4).
Я
= ID 41
CP
I '
J
i S "
Мальтоза Глюкоза Редуцирующие углеводы (РВ) АС+ГлС+КС АС+ГлС+КС+ПС
Мальтоза Глюкоза Редуцирующие углеводы (РВ) -АС+ГлС+КС АС+ГлС+КС+ПС
а б
Рис. 2. Влияние ферментных комплексов на содержание сбраживаемых углеводов в пшеничном сусле с концентрацией сухих веществ 24% (а) и 30% (б)
5
ч1
ш
ЕЕ >
! ' = I :
л
(I
Мальтоза Глюкоза Редуцирующие углеводы (РВ) АС+ГлС+КС АС+ГлС+КС+ПС
Мальтоза
АС+ГлС+КС
Глюкоза Редуцирующие углеводы (РВ) АС+ГлС+КС+ПС
б
Рис. 3. Влияние ферментных комплексов на содержание сбраживаемых углеводов в ржаном сусле с концентрацией сухих веществ 24% (а) и 30% (б)
о ■'■''■ ч
о
К
Редуцирующие углеводы (РВ)
АС+ГлС+КС АС+ГлС+КС+ПС
Мальтоза Глюкоза
углеводы (
'АС+ГлС+КС АС+ГлС+КС+ПС
а б
Рис. 4. Влияние ферментных комплексов на содержание сбраживаемых углеводов в кукурузном сусле с концентрацией сухих веществ 24% (а) и 30% (б)
Содержание ионов в концентрированном зерновом сусле в зависимости от используемого ферментного комплекса
Таблица 1
Используемый Концентрация катионов и анионов, мг/дм3
ферментный комплекс Катионы Анионы неорганических кислот Анионы органических кислот
Кукуруза
АС+ГлС+КС 1505 1307 949
АС+ГлС+КС+ПС 1179 1270 927
Рожь
АС+Гл+КС 1614 1846 791
АС+ГлС+КС+ПС 1567 1812 778
Пшеница
АС+ГлС+КС 1783 2347 969
АС+ГлС+КС+ПС 1700 2255 857
а
Установлено, что в зависимости от используемого комплекса ферментов повышалась степень конверсии полисахаридов, увеличивалось содержание сбраживаемых углеводов, в т. ч. глюкозы и мальтозы, несмотря на то, что состав карбогидраз и их дозировка во всех вариантах обработки для приготовления зернового сусла с концентрацией 24% РСВ были одинаковы (рис. 2-4). Подобная закономерность отмечена при исследовании углеводного состава сусла, приготовленного из различных видов зерна, и при анализе сусла с концентрацией 30 % РСВ. По-видимому, это связано с тем, что в результате использования комплекса ферментов амилолитическо-го, гемицеллюлазного и протеоли-тического действия деструктируется белково-полисахаридный матрикс и повышается доступ амилолитиче-ских ферментов к крахмалу, что способствует увеличению степени деструкции крахмальных полимеров.
Исследовано влияние ферментных систем с различной субстратной специфичностью на изменение ионного состава зернового сусла. Установлено, что содержание катионов и анионов в зерновом сусле зависело от субстратной специфичности ферментов, входящих в комплекс (табл. 1). При использовании полного комплекса ферментов амилолитического, ксиланазного и протеолитического действия (АС+ГлС+КС+ПС) концентрация ионов в сусле была несколько ниже, чем в случае использования комплекса, содержащего только кар-богидразы (АС+ГлС+КС). При этом в пшеничном сусле отмечено наиболее высокое содержание катионов (на 10-40%) и анионов (на 25-77%) по сравнению с ржаным и кукурузным суслом соответственно (табл. 1).
В результате исследований установлено, что содержание анионов органической природы в исходном пшеничном сусле (30 % РСВ) существенно зависит от субстратной специфичности ферментов. Так, наиболее высокий уровень концентрации оксалатов, малатов, цитратов отмечен при использовании ферментов амилолитического и гемицеллюлазного действия, осуществляющих деструкцию полисахаридов (крахмала, Р-глюканов и ксиланов) зернового сусла (табл. 2).
Протеолиз белковых веществ зернового сусла до низкомолекулярных пептидов и свободных аминокислот ферментным комплексом, включающим протеиназы и пептидазы,сопровождался снижением концентрации некоторых анионов в среде. Особенно это сказалось на содержании
в сусле оксалатов, малатов и ацетатов (рис. 5).
Результаты исследований состава ионов металлов и анионов неорганических кислот в зерновом сусле,
приготовленном с использованием различных ферментных комплексов, показали, что субстратная специфичность ферментов также оказывает некоторое влияние на их содержание (табл. 2).
450
Рис. 5. Содержание анионов органических кислот в зерновом сусле, полученном с использованием различных ферментных систем (1 - АС+ГлС+КС; 2 -АС+ГлС+ПС+КС)
Таблица 2
Концентрация катионов и анионов неорганической природы в зерновом сусле
Состав ионов, мг/дм3 Ферментные комплексы*
АС+ГлС+КС АС+ГлС+КС+ПС
Хлориды 221,7 195,6
Нитраты 6,7 5,6
Сульфаты 82,1 44,0
Фосфаты 2015,1 2283,1
Аммоний 17,8 17,1
Калий 1280,5 1428,1
Кальций 17,1 20,7
Натрий 73,4 58,2
Магний 194,0 221,0
Представленные в табл. 2 данные показывают, что содержание фосфатов в исходном сусле, обработанном только карбогидразами (АС+ГлС+КС), было более низким и составило 2015,1 мг/дм3. Введение в состав используемого комплекса протеаз (ПС) привело к повышению концентрации фосфатов до 2283,1 мг/дм3. Наличие фосфатов в сусле имеет определенное значение для осуществления биохимических реакций в процессе спиртового брожения, особенно при сбраживании концентрированного зернового сусла [3, 11, 12].
Для активизации действия практически всех внутриклеточных метал-лоферментов, в т. ч. и фосфофрукто-киназы, участвующих в метаболизме глюкозы, требуются ионы магния [13]. Наиболее высокая их концентрация (221,0 мг/дм3) отмечена в сусле, также обработанном полным комплексом ферментов (табл. 2). Кроме того, ионы калия, натрия, кальция также оказывают важную роль в метаболизме дрожжей. Как известно, калий играет существенную роль в окислительном фосфорилирова-нии и процессах гликолиза [14]. Он
специфически активирует дрожжевую альдолазу и вместе с ионом магния необходим для действия пи-руваткарбоксилазы. Калий так же, как азот и сера, может влиять на ли-пидный обмен дрожжей.
Как показали исследования, содержание ионов калия в подготовленных для сбраживания питательных средах составило 1280,5 - 1428,1 мг / дм3; при этом наибольшая его концентрация отмечена в результате использования полного комплекса ферментов (АС+ГлС+ПС+КС). Концентрация ионов натрия, являющегося регулятором поступления воды в клетку и поддержания постоянного осмотического давления, составила 58,273,4 мг/дм3 зернового сусла.
Концентрация нитратов, которые не усваиваются дрожжами, но восстанавливаются в нитриты, являющиеся клеточным ядом, во всех вариантах зернового сусла была невысокой и составила 5,6-6,7 мг/дм3, что не превышает опасной концентрации (20 мг/дм3).
Результаты исследований влияния ферментов с различной субстратной специфичностью на степень деструкции биополимеров зерна подтверждают их важную роль в формировании биохимического состава зернового сусла. Эффективность биокаталитического воздействия ферментного комплекса, включающего амилазы, гемицеллюлазы и протеазы, выразилась в повышении концентрации ассимилируемых дрожжами аминокислот в свободной форме, редуцирующих углеводов, в т. ч. глюкозы и мальтозы, и отразилась на катионном и анионном составе зернового сусла, приготовленного из зерновых культур, наиболее широко используемых в спиртовом производстве.
Исследования проведены за счет средств субсидии на выполнение государственного задания в рамках Программы Фундаментальных научных исследований государственных академий наук на 2013-2020 гг. (тема № 0529-2018-0112).
ЛИТЕРАТУРА
1. Серба, Е. М. Биотехнологические основы комплексной переработки зернового сырья и вторичных биоресурсов в этанол и белково-аминокислотные добавки / Е.М. Серба, В.А. Поляков // Монография (ISBN 978-5-906592-49-1). -М.: ВНИИПБТ, 2015. - 133 с.
2. Римарева, Л. В. Теоретические и практические основы ферментативного катализа полимеров зернового сырья в спиртовом производстве/Л.В. Рима-рева [и др.] // Производство спирта и ликероводочных изделий. - 2008. -№ 3. - С. 4-9.
3. Серба, Е.М. Биотехнологические основы микробной конверсии концентрированного зернового сусла в этанол /Е.М. Серба, М.Б. Оверченко, Л.В. Римарева // Монография (ISBN 978-5-9500501-6-9. DOI 10.18334/9785950050169)/- М.: БИБЛИОГЛОБУС. 2017. - 120 с.
4. Римарева, Л.В. Влияние ферментных комплексов на метаболизм спиртовых дрожжей и накопление ионов неорганической природы в концентрированном зерновом сусле /Л.В. Ри-марева [и др.] // Вестник Российской сельскохозяйственной науки. - 2016. № 3. - С. 28-31.
5. Поляков, В.А. Инструкция по тех-нохимическому и микробиологическому контролю спиртового производства / В.А. Поляков [и др.] - М.: ДеЛи принт. -2007. - 480 с.
6. ГОСТ Р 54330 - 2011. Ферментные препараты. Методы определения амило-литической активности.
7. ГОСТ Р 53974 - 2010. Ферментные препараты. Методы определения про-теолитической активности.
8. ГОСТ Р 55302 - 2012. Ферментные препараты. Методы определения ксила-назной активности
9. Поляков, В.А. Применение жидкостной хроматографии для исследования органических кислот и углеводов в сусле и бражке/В. А. Поляковх [и др.] // Хранение и переработка с-х. сырья. -2017. - № 9. - С. 20-23.
10. Шелехова, Н.В. Исследование ионного состава полупродуктов и отходов спиртового производства с применением метода капиллярного электрофо-реза/Н.В. Шелехова, Л.В. Римарева // Хранение и переработка с-х. сырья. -2015. - № 8. - С. 12-15.
11. Римарева, Л.В. Теоретические и практические основы биотехнологии дрожжей /Л.В. Римарева // Учебное пособие. - М.: ДеЛи принт, 2010. - 256 с.
12. Авилова, И. А. Водный обмен в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiaeрас Y-3137 и Y-3327 поданным ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля /И.А. Авилова [и др.] // Биофизическая химия. - 2015. - Т. 89. -№ 4. - С. 148-152.
13. Nweke, C.O. Effects of metals on dehydrogenase activity and glucose utilization by Saccharomyces cerevisiae/C.O. Nweke // Nigerian Journal of Biochemistry and Molecular Biology. -2010. - V. 25. - № 2. - P. 28 - 35.
14. Perez Valle, J. Key role for intracellular K+ and protein kinases Sat4/ Hal4 and Hal5 in the plasma membrane stabilization of yeast nutrient transporters/ J. Perez Valle, H. Jenkins, S. Merchan [et al.] // Microbiol. Biotechnol. - 2007. - V. 27. -№ 16. - P. 5725 - 5736.
REFERENCES
Serba, E.M. Biotehnologicheskie osnovy kompleksnoj pererabotki zernovogo syr'ja i vtorichnyh bioresursov v jetanol i belk-ovo-aminokislotnye dobavki/ E.M. Serba, V.A. Poljakov // Monografija (ISBN 978-5-906592-49-1) - M.: VNIIPBT, 2015. -133 p.
2. Rimareva, L.V. Teoreticheskie i prak-ticheskie osnovy fermentativnogo katali-za polimerov zernovogo syr'ja v spirtovom proizvodstve / L.V. Rimareva [i dr.] // Proizvodstvo spirta i likerovodochnyh izdelij. - 2008. - № 3. - P. 4-9.
3. Serba, E.M. Biotehnologicheskie os-novy mikrobnoj konversii koncentrirovan-nogo zernovogo susla v jetanol/E.M. Ser-
ba, M. B. Overchenko, L. V. Rimareva // Monografija (ISBN 978-5-9500501-6-9. DOI 10.18334/9785950050169) M.: «BIBLIOGLBUS». - 2017. - 120 p.
4. Rimareva, L.V. Vlijanie fermentnyh kompleksov na metabolizm spirtovyh drozhzhej i nakoplenie ionov neorgan-icheskoj prirody v koncentrirovannom zernovom susle/L.V. Rimareva [et all] // Vestnik Rossijskoj sel'skohozjajstvennoj nauki. - 2016. - № 3. - P. 28-31.
5. Poljakov, V. A. Instrukcija po teh-nohimicheskomu i mikrobiologichesko-mu kontrolju spirtovogo proizvodst-va/ V. A. Poljakov [i dr.] // - M.: DeLi print. - 2007. - 480 p.
6. GOST R 54330 - 2011. Fermentnye preparaty. Metody opredelenija amilolit-icheskoj aktivnosti.
7. GOST R 53974 - 2010. Fermentnye preparaty. Metody opredelenija proteolit-icheskoj aktivnosti.
8. GOST R 55302 - 2012. Fermentnye preparaty. Metody opredelenija ksi-lanaznoj aktivnosti
9. Poljakov, V. A. Primenenie zhidko-stnoj hromatografii dlja issledovanija organicheskih kislot i uglevodov v susle i brazhke/V.A. Poljakovh [i dr.] // Hrane-nie i pererabotka s-h. syr'ja. - 2017. -№ 9. - P. 20-23.
10. Shelehova, N.V. Issledovanie ion-nogo sostava poluproduktov i othodov spirtovogo proizvodstva s primeneni-em metoda kapilijarnogo jelektrofor-eza/ N.V. Shelehova, L. V. Rimareva // Hranenie i pererabotka s-h. syr'ja. -2015. - № 8. - P. 12-15.
11. Rimareva, L.V. Teoreticheskie i prakticheskie osnovy biotehnologii dro-zhzhej/L.V. Rimareva // Uchebnoe poso-bie. - M.: DeLi print, 2010. - 256 p.
12. Avilova, I.A. Vodnyj obmen v klet-kah drozhzhej Saccharomyces cerevisi-aeras Y-3137 i Y-3327 podannym JaMR s impul'snym gradientom magnitnogo polja/I.A. Avilova [i dr.] // Biofizicheska-ja himija. - 2015. - T. 89. - № 4. -P. 148-152.
13. Nweke, C. 0. Effects of metals on dehydrogenase activity and glucose utilization by Saccharomyces cerevi-siae/C.0. Nweke // Nigerian Journal of Biochemistry and Molecular Biology. -2010. - V. 25. - № 2. - P. 28 - 35.
14. Perez Valle, J. Key role for intracel-lular K+ and protein kinases Sat4/Hal4 and Hal5 in the plasma membrane stabilization of yeast nutrient transport-ers/J. Perez Valle, H. Jenkins, S. Merchan [et al.] // Microbiol. Biotechnol. - 2007. -V. 27. - № 16. - P. 5725 - 5736.
Влияние гидролитических ферментов на состав концентрированного зернового сусла
Ключевые слова
аминокислоты; анионы; дрожжи; катионы; концентрированное зерновое сусло; сбраживаемые углеводы; субстратная специфичность; ферментативный комплекс
Реферат
Перспективным способом, способствующим повышению эффективности спиртового производства и снижению образования отходов почти в 2 раза, является приготовление зернового сусла с концентрацией растворимых сухих веществ (РСВ) свыше 25% и подбор комплексной ферментативной системы, катализирующей глубокий гидролиз белка и полисахаридов сырья, с получением высококачественного зернового сусла, обогащенного ассимилируемыми дрожжами моно- и ди-сахаридами и свободными аминокислотами. Цель настоящей работы состояла в исследовании влияния ферментов различной субстратной специфичности на качество концентрированного зернового сусла, приготовленного на основе пшеницы, кукурузы и ржи. Работа выполнялась во ВНИИ пищевой биотехнологии - филиале ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии». Установлено, что использование при подготовке концентрированного зернового сусла полного комплекса ферментов, включающего ферменты карбогидразного и протеоли-тического действия, обеспечивало повышение в среде концентрации свободных аминокислот, ассимилируемых дрожжами, в 2,8-3,3 раза в зависимости от вида перерабатываемого зернового сырья. При этом повышалась также и концентрация сбраживаемых углеводов, в т. ч. мальтозы и глюкозы. Показано влияние гидролаз на катионный и анионный состав зернового сусла, приготовленного из зерновых культур, наиболее широко используемых в спиртовом производстве. Протео-лиз белковых веществ сопровождался некоторым снижением общей концентрации анионов. Особенно это сказалось на содержании в сусле оксалатов, малатов и ацетатов. Установлена тенденция повышения содержания в сусле, обработанном полным комплексом ферментов, фосфатов, ионов магния и калия. Результаты исследований влияния ферментов с различной субстратной специфичностью на степень деструкции биополимеров зерна подтверждают их важную роль в формировании биохимического состава концентрированного зернового сусла, что обеспечит его сбраживание с высокими качественными показателями.
Авторы
Римарева Любовь Вячеславовна, д-р техн. наук, профессор, академик РАН,
Оверченко Марина Борисовна, канд. техн. наук, Игнатова Надежда Иосифовна,
Серба Елена Михайловна, д-р биол. наук, профессор, Мартыненко Николай Николаевич, д-р биол. наук ВНИИПБТ - филиал «ФИЦ питания и биотехнологии» 111033, г. Москва, ул. Самокатная, д. 4-Б, [email protected]
The influence of hydrolytic enzymes on the composition of the concentrated grain wort
Key words
amino acids; anions; cations; concentrated grain wort; fermented carbohydrates enzymatic complex; substrate specificity; yeast
Abstracts
A promising way to improve the efficiency of alcohol production and reduce waste generation by almost 2 times, is the preparation of a grain wort with a concentration of soluble solids over 25% and the selection of a comprehensive enzymatic system that catalyzes the deep hydrolysis of protein and polysaccharides of raw materials, with the production of high -quality grain wort, enriched with assimilated yeast mono - and di-saccharides and free amino acids. The purpose of this work was to study the effect of enzymes of different substrate specificity on the quality of concentrated grain wort prepared on the basis of wheat, maize and rye. The work was carried out in the All-Russian Research Institute of Food Biotechnology. It was found that the use of the concentrated grain wort in the preparation of a full complex of enzymes, including enzymes of carbohydrate and proteolytic action, provided an increase in the concentration of free amino acids assimilated by yeast in 2,8 - 3,3 times depending on the type of processed grain raw materials. At the same time, the concentration of fermented carbohydrates, including maltose and glucose, also increased. Shows the effect of hydrolases on the cationic and anionic composition of the grain wort made from grain crops, the most widely used in alcohol production. Proteolysis of proteins was accompanied by some reduction in the total concentration of anions. This particularly affected the content of oxalates, malates and acetates in the wort. The tendency of increase of the content in a wort processed by a full complex of enzymes, phosphates, ions of magnesium and potassium is established. The results of studies of the effect of enzymes with different substrate specificity on the degree of degradation of grain biopolymers confirm their essential role in the formation of the biochemical composition of concentrated grain wort, which will ensure its fermentation with high quality factors.
Authors
Rimareva Lyubov Vyacheslavovna, Doctor of technical Sciences, Professor, Academician of RAS,
Overchenko Marina Borisovna, Candidate of technical Sciences, Ignatova Nadezhda losifovna,
Serba Elena Mikhailovna, Doctor of biological Sciences, Professor, Martynenko Nikolay Nikolaevich, Doctor of biological Sciences All-Russian Scientific Research Institute of Food Biotechnology - branch of FGBUN «FIC of nutrition and biotechnology», 4-B, Samokatnaya str., Moscow, 11033, [email protected]
