CC BY
44
Исследования антропогенноизмененных экосистем и урбоэкология
И.С. Жебрак, И.А. Ерема, Ю.А. Бахар
Влияние фунгицидов, фосфорной муки, кислотности почвы на интенсивность микоризации клематиса тангутского
Изучены эндофитные грибы в корнях Clematis tangutica. Внесение в почву фунгицида «Ордан», фосфорной муки, мела, щавелевой кислоты достоверно повышало интенсивность микоризации Clematis tangutica арбускулярными микоризными грибами. Фунгицид «Азофос» снижал прирост побегов Clematis tangutica, а мел стимулировал их рост. Внесение в почву инокулюма Glomus intraradices повышало устойчивость растений к угнетающему действию фунгицида «Азофос».
Ключевые слова: эндофитные грибы, арбускулярные микоризные грибы, темноокрашенные септированные эндофитные грибы, фунгициды, инокулюм Glomus intraradices, интенсивность микоризации, прирост побегов Clematis tangutica.
Clematis tangutica Korsh., как и многие другие виды и сорта Clematis L., является перспективным видом для зеленого градостроительства, т.к. обладают высокой скоростью роста, большой зеленой массой и декоративностью [1; 5]. Достоинством С. tangutica является декоративность во время всего периода вегетации: ажурная листва, редкая среди клематисов ярко-желтая окраска цветов, обильное (30-130 цветков на одном побеге) продолжительное цветение (40-50 дней), соплодия
Ф s го
покрывающие лиану в период плодоношения. Clematis tangutica развива- 1Е
ет мощную корневую систему в сравнительно небольшом объеме почвы ^ § ^
Ею
(стержневая корневая система обычно достигает длины 50-65 см и состо- о >< ™ ит из 30-45 корней в кусте), при этом его наземная часть может дости- § гать в высоту 2,5-3 м, что особенно ценно в условиях плотной городской g
_о
застройки. Этот вид естественно произрастает на каменистых склонах ^ Средней Азии, Монголии, Западного Китая. В Беларуси С. tangutica куль- J тивируется с 1959 г. и до сих пор не получил широкого распространения u и должной популярности в городском градостроительстве [5].
Все виды и сорта клематисов подвержены заболеваниям, вызываемым фитопатогенными грибами. Наиболее опасным заболеванием клематисов является увядание. Болезнь проявляется во время бутонизации и цветения во внезапном увядании одного или нескольких побегов внешне совершенно здорового растения. Поврежденный побег чернеет и усыхает. Возникает заболевание неожиданно, протекает быстро (в течение 1-2 дней). Экстренно принять какие-либо меры невозможно. Вызывают болезнь почвенные грибы родов Phomopsis, Fusarium, Verticillium [1].
Грибы, как правило, поражают основание стебля. Гифы гриба проникают в ткань растения, и, разрастаясь, мицелий закупоривает сосудисто-волокнистые пучки. Доступ влаги прекращается, что ведет к быстрому усыханию листьев и цветков. Заболевание возникает неожиданно и протекает стремительно, поэтому единственно надежным способом защиты являются профилактические методы уничтожения возбудителей. На самых ранних стадиях развития растений используют различные фунгициды [5].
В корнях C. tangutica присутствуют необходимые растению симбио-тические микоризные эндофитные грибы, повышающие стрессоустой-чивость растений к различным факторам среды. Эндофитные грибы живут внутри растения и никогда не вызывают видимых симптомов заболевания. Микориза - симбиотическое обитание грибов на корнях и в тканях корней высших растений. В микоризе грибы получают от растений углеводы, снабжают их водой и минеральными элементами питания [2; 6].
В этой связи важным является изучение влияния различных фунгицидов и других химических веществ, используемых для профилактики заболеваний клематисов, на микоризные грибы. Возможно, что широко используемые фунгициды могут убивать не только патогенные, но и микоризные грибы. Растение, потерявшее своего грибного симбионта, снижает стрессоустойчивость к различным факторам окружающей среды.
л л ь-
ГО I и
m ф s
О х у
Ч Ш О
^ 2 *
^ m m
и S
и О
О
Цель нашей работы - изучение влияния фунгицидов («Ордан», «Азофос», «Раек»), кислотности почвы, фосфорной муки на рост Clematis tangutica Korsh. и на развитие их корневых эндофитных грибов.
Материалы и методы исследований
Семена С. tangutica высевали без стратификации в феврале. Через месяц растения по три штуки распикировали в горшки емкостью 200 мл (для каждого варианта опыта использовали шесть горшков). В половину горшков перед посадкой добавляли чайную ложку инокулюма Glomus intraradices на глубине 1 см. Инокулюм представлял собой смесь стерильной почвы с корнями, инфицированными чистой культурой арбу-скулярных микоризных грибов (АМГ) G. intraradices. Через две недели в горшки с клематисами вносили 0,5 г фосфорной муки, 30 мл щавелевой кислоты, 2,4 г мела и обрабатывали растворами фунгицидов «Азо-фос», «Ордан», «Раек». Растворы фунгицидов готовили согласно рекомендациям производителя.
Эксперимент проводили по следующей схеме:
1) С. tangutica + «Азофос»;
2) С. tangutica + «Ордан»;
3) С. tangutica + «Раек»;
4) С. tangutica + фосфорная мука;
5) С. tangutica + мел;
6) С. tangutica + щавелевая кислота;
7) С. tangutica без обработки химическими веществами (контроль 1);
8) С. tangutica + инокулюм G. intraradices + «Азофос»;
9) С. tangutica + инокулюм G. intraradices + «Раек»;
10) С. tangutica + инокулюм G. intraradices + фосфорная мука;
11) С. tangutica + инокулюм G. intraradices + мел;
12) С. tangutica + инокулюм G. intraradices + щавелевая кислота;
13) С. tangutica + инокулюм G. intraradices + «Ордан»;
14) С. tangutica + инокулюм G. intraradices без обработки химическими веществами (контроль 2).
Через месяц после обработки измеряли прирост побегов и интенсивность микоризации корней методом Травло [7]. Большинство методов количественного учета развития АМГ основывается на определении соотношения участков корня без гриба и участков с микоризой. После тщательного промывания проводили мацерацию корней в 10-процентном растворе гидроксида калия в течение 24 ч. при комнатной температуре. Затем корни тщательно полоскали под проточной водой. С целью
снижения рН материал помещали в 5-процентный раствор молочной 1Е Л кислоты в течение 24 ч. После чего корни промокали на фильтро- | § ^ вальной бумаге и на сутки помещали в раствор анилинового синего ° g ^
о i—
(0,05-процентный раствор красителя в 80-процентном растворе молоч- * ной кислоты). После промокания корней от красителя материал хранили S в 80-процентном растворе молочной кислоте. Препараты готовили под Ц лупой. На одно предметное стекло раскладывали 15 фрагментов корней о по 1 см. и покрывали покровным стеклом (24 х 60 мм). Для каждого варианта опыта рассматривали три препарата, т.е. 45 см корней [3; 4].
На каждом фрагменте корня длиной 1 см определяли степень микори-зации по шестибальной шкале (0-5). Результаты для каждого фрагмента корня заносили в протоколы. При помощи компьютерной программы Mikoryza 1.1 beta рассчитывали интенсивность микоризации (М% -усредненная интенсивность микоризации, обсчитанная для всей пробы) корней арбускулярными микоризными грибами [7].
Результаты и их обсуждение
На первом этапе наших исследований изучали морфологические особенности развития микоризных грибов в корнях Clematis tangutica, рассматривали, какие типы грибов развиваются в микоризе и какими структурами представлены. Во всех вариантах опыта в корнях клемати-са были обнаружены микоризные грибы.
На некоторых участках корней хорошо были видны окрашенные в синий цвет арбускулы - структуры, характерные для арбускуляр-ных микоризных грибов, которые являются контактной зоной между грибом и растением (рис. 1). Изучаемая нами арбускулярная микориза клематисов относится к Arum-типу. Эту группу часто определяют как «типичную арбускулярную микоризу» и описывают в быстро растущих корневых системах культивируемых растений. Микоризы Arum -типа представлены быстро распространяющимися межклеточными гифами. Их короткие боковые ветви проникают в клетки коры через клеточную стенку и дихотомически ветвятся в апопласте, образуя характерные сильно разветвленные арбускулы [6]. В корне клема-тиса наблюдали арбускулы: «молодые» (развивающиеся), заполняющие часть клетки растения хозяина, электронно неплотные; «зрелые» (развитые, активные), электронно более плотные, заполняющие клетку целиком, а также «старые» разрушающиеся арбускулы, электронно более плотные, но заполняющие клетку с одной стороны в месте проникновения.
Рис. 1. Эндофитные грибы в корнях Clematis tangutica:
ГАМГ - гифы арбускулярных микоризных грибов; А - арбускулы; В - везикулы; КВ - корневой волосок; ГТСЭГ - гифы темноокрашенных септированных эндофитных грибов; ОСТСЭГ - округлые структуры темноокрашенных септированных эндофитных грибов; ПСО - покоящиеся споры Olpidium
Значительно реже встречались участки микоризы, содержащие везикулы, структуры АМГ, запасающие питательные вещества (см. рис. 1). Везикулы представляли собой структуры округлой и овальной формы. Некоторые авторы приравнивают понятия внутрикорневые споры и везикулы АМГ. Ряд авторов предполагает, что везикулы АМ являются начальной стадией развития спор. В то же время до сих пор в литературе нет единого мнения в этом определении. Отсутствие специфичности для формы исследуемых структур АМ в зависимости от вида растения свидетельствует о том, что морфология везикул главным образом определяется видовой принадлежностью АМГ [6].
Ф s го
Некоторые фрагменты корней имели очень хорошо развитый несепти- 1Е Л
рованный мицелий арбускулярных микоризных грибов (АМГ), который ^ о ^
Ею
не только развивался внутри корня, но и выходил на его поверхность, о >< ™ образуя поисковые гифы (см. рис. 1). Большинство исследователей при- § держивается мнения, что развитие мицелия происходит путем роста g
_о
и ветвления гиф, уже имеющихся за пределами корня. Однако есть дан- ^ ные, что гифы из коры корня растут наружу, проникая сквозь раститель- J ные клеточные стенки [6]. В корне клематиса наблюдали гифу гриба, u проникающую через волосок наружу корня.
Выявленные нами гифы на поверхности корня, как и корневые волоски, выполняют всасывающую функцию. Эти гифы начинают ветвиться и представляют собой важный источник инокулюма для той же корневой системы или корней других растений. Кроме АМГ, корни клема-тисов содержали темноокрашенные септированные эндофитные грибы (ТСЭГ), которые были представлены в корнях клематисов в виде септи-рованного темноокрашенного мицелия и округлых структур внутри клеток (см. рис. 1). В некоторых корнях клематисов наблюдали межклеточные гифы ТСЭГ, слегка извилистые, которые четко повторяли контуры клеток (см. рис. 1). Эти гифы не проникали внутрь клеток и имели меньший диаметр по сравнению с внутриклеточными и наружными гифами. В клетках Clematis tangutica обнаружены округлые структуры ТСЭГ, которые чаще всего встречались в клетке группами, и некоторые из них проникали в корневые волоски.
В корнях клематисов выявлены выемчатые покоящиеся споры патогенного гриба рода Olpidium (см. рис. 1). Также были обнаружены грибы рода Alternaria, представленные гифами и конидиями округлой формы с вытянутыми носиками.
В контрольном варианте опыта с внесением инокулюма Glomus intraradices выявили достоверное увеличение интенсивности микори-зации C. tangutica по сравнению с контролем без внесения. Установили, что из всех исследуемых химических веществ только в образцах без внесения инокулюма G. intraradices фунгицид «Азофос» достоверно снижал, а мел повышал прирост побегов C. tangutica по сравнению с контролем. Во всех остальных вариантах опыта с внесением и без внесения инокулюма прирост растений достоверно не отличался от контроля (рис. 2).
В варианте 1 опыта без внесения инокулюма (+ «Азофос») отмечали не только снижение прироста побегов, но также изменение в фиолетовый цвет листьев, что свидетельствует об увеличении в клетках флава-ноидов и о снижении устойчивости растений к стрессу. Интенсивность
26
Л Л Ь-
т I и
m ф s
О х у
ч: Ф о
q m rn
и s
и о
о а.
микоризации АМГ корней Clematis tangutica, обработанных фунгицидом «Азофос», в вариантах опыта с внесением и без внесения инокулю-ма Glomus intraradices была примерно одинаковой (рис. 3).
¡о 4 01 ю о
о
§-2 о.
FR
ifi
s +
-е-
о
5
s +
I о
2 4
S
+
S +
S
+
2
+
а
о
Вариант опыта
Рис. 2. Прирост побега клематиса после обработки химическими веществами. Здесь и далее (рис. 3, 4): +М - варианты опыта с внесением микоризы; ЩК - щавелевая кислота; ФМ - фосфорная мука
100 Г
80
я 60
40
20
ifl
FFi
ЯР
.0 5 л 5 Ордан 5 Раек г Мел г щк s 2 2
0 а. н 1 + л с о о -е-о m < + XI с; о + X ш СЕ £ 0J + 5 г + 3 © + г о
а. -©- О. о.
X m О
£ < Вариант опыта
Рис. 3. Интенсивность микоризации корней клематиса после обработки их химическими веществами
Уменьшение интенсивности микоризации у клематисов в варианте опыта с инокулюмом мы объясняем отрицательным действием фунгицида «Азофос» на внесенные микоризные грибы. Так как Glomus intraradices вносили под растения, корни которых уже изначально содержали арбу-скулярные микоризные грибы, инокулированные грибы могли образовать дополнительные молодые арбускулы и гифы, которые более чувствительными к действию фунгицида «Азофос» по сравнению с аборигенными. Поэтому по сравнению с контролем 2 интенсивность микоризации снижалась. В то же время в варианте опыта без внесения G. intraradices интенсивность микоризации сравнима с контролем 1, но микоризный симбиоз оказался менее эффективным, чем с внесением инокулюма, что подтверждают показатели соотношения длины корня и побега.
Из литературы известно, что низкое соотношение корень/побег указывает на высокую скорость роста микоризных грибов, развитие на корнях большого количества свободного мицелия, большую площадь контакта между грибом и растением [6]. Наши результаты показали, что в варианте опыта с внесением инокулюма соотношение корень/побег было меньше, чем в варианте без внесения (рис. 4). Мы можем говорить о высоком вкладе АМГ в поглощение питательных веществ, что связано, по-видимому, с интенсивным развитием свободного мицелия и контактной зоны. Это могло способствовать повышению устойчивости кле-матисов к воздействию фунгицида «Азофос».
и о'
п 1 ^
ф
5 '••о
Ею
О X CN ё Ф
5 ^
m
О
и
Вариант опыта
Рис. 4. Соотношение длины корня к длине побега через месяц после обработки клематиса химическими веществами
Известно, что АМ грибы имеют два возможных пути поглощения
ГО I и
о i 5 питательных веществ: напрямую (из почвы) или посредством микориз-
^ Р m ного грибного симбионта. Грибной мицелий в почве всасывает пита-
U S
ф о тельные вещества за пределами зоны истощения, поэтому повышает-ш ся задействованный объем почвы. Кроме того, гифы могут проходить g сквозь почвенные поры на порядок меньше диаметра, чем те, которые н доступны для корня [6]. Вероятно, в вариантах с внесением инокулюма фунгицид в большей степени впитывался растением через гифы гриба, а не через корневые волоски. Известно, что «Азофос» - фунгицид контактного действия. Фунгицид воздействует на патоген только при непосредственном контакте с грибами и не проникает в растение, распространяясь только по поверхности. В качестве действующего вещества используется аммоний-медь-фосфат (АМФ). Вероятно, именно внесенные арбускулярные микоризные грибы снижали угнетающее действие фунгицида, а медь могла убивать грибной компонент.
Механизмы, которыми объясняется влияние АМ грибов на снижение накопления токсичных элементов в побегах, включают изолирование металлов в гифах без дальнейшей передачи их растениям. В грибных структурах может накапливаться больше меди, чем в самих клетках корня. Изоляция металлов в грибных структурах может иметь большое значение для минимизации их транспорта к растению и повышению его стрессоустойчивости [Там же].
В вариантах опыта без инокуляции Glomus intraradices через месяц после внесения под растения мела отмечали достоверное увеличение прироста побегов и повышение интенсивности микоризации корней АМГ по сравнению с контролем (см. рис. 2, 3). Низкое соотношение корень/побег в этом варианте опыта, по-видимому, было связано с наличием эффективного грибного симбионта в корнях, образующего обильный свободный мицелий, который ведет к истощению элементов питания далеко за пределами ризосферы и дополнительно снабжает растение водой и минеральными веществами.
Мы предполагаем, что свободные гифы гриба способствовали большему проникновению кальция в растения. Кальций влияет на обмен углеводов и белковых веществ. Потребность в кальции проявляется в самые ранние сроки роста. Он необходим для построения растения. В свою очередь, растения синтезировали больше продуктов фотосинтеза и стимулировали развитие арбускулярных микоризных грибов. Из литературы известно, что АМ корни целого ряда древесных и травянистых растений получают на 4-20% больше от общего количества продуктов фотосинтеза, чем безмикоризные. Углерод задействован
Ф s го
в росте внутрикорневого и свободного мицелия, а также отмечено 1Е ^ значительное увеличение оттока углерода в почву. Расход растением | фиксированного углерода на поддержание грибного симбионта можно о >< ™ трактовать как «вложение», дающее в результате более эффективное §
поглощение элементов питания. Большое количество углерода, исполь- g
_0
зуемое АМ грибами, может отражать затраты растения на поддержание ^ симбиоза и может быть щедро вознаграждено множеством способов, J в том числе и путем повышения активности фотосинтеза, снижения u роста корня или изменений в соотношении корень/побег [6].
В варианте 11 опыта (внесение мела + инокулюм) прирост побегов был сравним с контрольным вариантом. Интенсивность микоризации этих растений не отличалась от контроля 2 (с внесением инокулюма), но достоверно была выше, чем на корнях растений с мелом без внесения инокулюма. Соотношение корень/побег показывало низкую эффективность грибного симбиоза, несмотря на высокую интенсивность микори-зации (см. рис. 3, 4).
Химические вещества «Ордан» и «Раек», фосфорная мука, щавелевая кислота не оказывали стимулирующего действия на прирост побегов Clematis tangutica во всех вариантах опыта, как с внесением Glomus intraradices, так и без внесения. Из литературных источников известно, что некоторые фунгициды способны подавлять развитие арбускуляр-ных микоризных грибов [6]. В наших исследованиях фунгицид «Ордан» стимулировал развитие арбускулярных микоризных грибов на корнях C. tangutica в вариантах опыта без внесения инокулюма, т.к. интенсивность микоризации у этих растений достоверно была больше, чем у клематисов в контроле без инокулюма. «Ордан» - двухкомпонентный фунгицид локально-системного действия. Действующие вещества -хлорокись меди и цимоксанин. Возможно, органический компонент оказывал стимулирующее действие на арбускулярные микоризные грибы. Третий исследуемый нами фунгицид «Раек» (фунгицид системного действия, действующее вещество - дифеноконазол) не оказывал существенного влияния на развитие арбускулярных микоризных грибов.
Выводы
Таким образом, при исследовании влияния различных факторов на микоризацию и рост декоративного вида растения C. tangutica нами выявлено следующее:
1. В условиях закрытого грунта C. tangutica имеет среднюю и высокую микотрофность. В корнях C. tangutica отмечены симбиотиче-ские арбускулярные микоризные грибы ^rum-типа (межклеточный,
о
Œ
внутриклеточный и поисковый мицелий; арбускулы и везикулы) и тем-ноокрашенные септированные эндофитные грибы (межклеточный, вну-
л л ь-
ГО I и m ф s О х у Ч Ш О
^ Р m триклеточный, поверхностный мицелий; внутриклеточные округлые и структуры) и обнаружили эндофитные фитопатогенные грибы Olpidium ф и Alternaria.
2. Внесенные в почву фунгицид «Ордан», фосфорная мука, мел, щавелевая кислота достоверно повышали интенсивность микоризации корней Clematis tangutica арбускулярными микоризными грибами.
3. Фунгицид «Азофос» достоверно снижал прирост побегов C. tangu-tica, а мел стимулировал их рост. Внесение в почву инокулюма Glomus intraradices повышало стрессоустойчивость растений к угнетающему действию фунгицида «Азофос».
Библиографический список
1. Бескаравайная М.А. Клематисы. М., 1991.
2. Воронина Е.Ю. Микоризы в наземных экосистемах: экологические, физиологические и молекулярно-генетические аспекты микоризных симбиозов // Микология сегодня / Под ред. Ю.Т. Дьякова и Ю.В. Сергеева. М., 2007. Т. 1. С. 142-234.
3. Лабутова Н.М. Методы исследования арбускулярных микоризных грибов. СПб., 2000.
4. Муромцев Г.С. Методы исследования грибов, образующих с растениями микоризу арбускулярно-визикулярного типа. СПб., 1992.
5. Свитковская О.И. Клематисы и княжики в Беларуси: ассортимент, агротехника, размножение, использование. Мн., 2014.
6. Смит С.Э. Микоризный симбиоз. М., 2012.
7. Trouvelot A., Kough J.L., Gianinazzi-Pearson V. Mesure du taux de myco-rhization VA d,un systeme radiculaire. Recherche de methods ^estimation ayant une signification fonctionnelle // Fhysiological and genetical aspects of mycorrhizae. Paris, 1986. P. 217-221.
