CC BY
24
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
4. MarkwellM. A. K. et al. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples // Anal. Biochem. 1978. Vol. 87. P. 207-210.
5. Nofer J.-R. et al. Suppression ofEndothelial Cell Apoptosis by High Density Lipoproteins (HDL) and HDL-associated Lysosphi-ngolipids // J. Biol. Chem. 2001. Vol. 276. Is. 37. P. 34480-34485.
6. Tabas I. Consequences and Therapeutic Implications of Macrophage Apoptosis in Atherosclerosis. The Importance of Lesion Stage and Phagocytic Efficiency // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2005. Vol. 25. P. 2255-2264.
7. Terasaka N. et al. High-density lipoprotein protects macrophages from oxidized low-density lipoprotein-induced apoptosis by promoting efflux of 7-ketocholesterol via ABCG1 // PNAS. 2007. Vol. 104. № 38. P. 15093-15098.
8. Zerrad-SaadiA.et al. HDL3-Mediated Inactivation of LDL-Associated Phospholipid Hydroperoxides Is Determined by the Redox Status of Apolipoprotein A-I and HDL Particle Sur-face Lipid Rigidity. Relevance to Inflammation and Atherogenesis // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2009. Vol. 29. P. 2169-2175.
9. Zhang C. et al. Studies on protective effects of human paraoxonases 1 and 3 on atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice // Gene Therapy. 2010. Vol. 17. P. 626-633.
РЕЗЮМЕ
Е. Е. Ларионова, А. Д. Денисенко
Влияние модифицированных липопротеинов низкой плотности и липопротеинов высокой плотности на апоптоз макрофагов
Перекисно-модифицированные ЛПНП вызывали цитопатоген-ный эффект in vitro на первичные макрофаги человека, вызывая как апоптоз, так и некроз клеток. Этот эффект окисленных ЛПНП был дозозависимым. ЛПВП уменьшали индуцированную окисленными ЛПНП гибель клеток, находящихся как в раннем, так и в позднем апоптозе.
Ключевые слова: липопротеины низкой плотности, апоптоз, макрофаги, липопротеины высокой плотности.
SUMMARY
E. E. Larionova, A. D. Denisenko
The influence of modified low density lipoproteins and of high density lipoproteins on macrophage apoptosis
Oxidized low density lipoproteins induced in vitro apoptosis and necrosis in human monocyte-derived macrophages in a dose dependent manner. High density lipoproteins decreased both the initial and advanced macrophage apoptosis induced by oxidized low density lipoproteins.
Key words: low density lipoprotein, apoptosis, macrophages, high density lipoprotein.
© Коллектив авторов, 2012 г. УДК 616-008-841.5-08
Т. Ф. Субботина, М. О. Новак, Ю. В. Картышкина, А. С. Щурева, М. А. Думпис
ВЛИЯНИЕ ФУЛЛЕРЕНОЛА С60(ОН)24 НА ПОКАЗАТЕЛИ СИСТЕМЫ ГЕМОСТАЗА IN VITRO
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова
Фуллерены - молекулярные соединения, принадлежащие классу аллотропных форм углерода и представляющие собой выпуклые замкнутые многогранники, составленные из четного числа трехкоординированных атомов углерода. Фуллерены, а особенно их водорастворимые формы, рассматриваются как перспективные агенты в наномедицине. Интенсивно разрабатываются подходы, позволяющие использовать их в качестве фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии, антиоксидантов, противовирусных и бактерицидных агентов, а также в качестве векторов для адресной доставки лекарственных веществ [3]. Тем не менее сведения об их взаимодействии с биологическими структурами пока не полны. В частности, в доступной литературе практически отсутствуют сведения о влиянии полигидроксилированных фуллеренов (фуллерено-
лов) на показатели свертывающей системы и фибри-нолиза in vitro.
Целью настоящей работы являлось изучение влияния модифицированного фуллерена С60(0Н)24 на показатели системы плазменного гемостаза здоровых доноров.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследование проведено на пулах бедной тромбоцитами цитратной плазмы лиц без нарушений системы гемостаза, предоставленных центром лабораторной диагностики СПбГМУ им. акад. И. П. Павлова. Фуллеренол С60(0Н)24 был предоставлен НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН. В работе использованы фибриноген и тромбин человека («Технология-Стандарт», г. Барнаул), наборы реактивов для определения тромбинового времени, протромбина («Техпластин-тест») и активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) («Технология-Стандарт», г. Барнаул), а также тканевой активатор плазминогена (т-АП) (Actilyse, Boehringer-Ingelheim, Германия).
В клоттинговых тестах раствор фуллеренола в 0,9 %-й NaCl добавляли в тестовые системы за 1 минуту до инициации свертывания в количестве 0,01-0,1 мл; контрольные образцы содержали такое же количество растворителя - 0,9 %-й NaCl. Исходная концентрация фуллеренола (маточный раствор) составляла 1 мг/мл, или 870 мкМ.
Динамику фибринообразования и фибринолиза оценивали турбидиметрическим методом [2] с небольшими модификациями. В стандартном эксперименте свертывание и последующий фибринолиз инициирова-
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XIX • №2 • 2012
Эффекты фуллеренола С60(ОН)24 в клоттинг-тестах
Тест Эффект Концентрация фуллеренола в инкубационной смеси, мкМ
Тромбиновое время с раствором фибриногена Пролонгирование 87
с плазмой Пролонгирование 10
Протромбиновое время инкубация фуллеренола с плазмой Эффекта не обнаружено 145
инкубация фуллеренола с техпластином Укорочение 79
АЧТВ Пролонгирование 28
ли добавлением 0,05 мл рабочего раствора т-АП (5 мкг/мл), а через 1 минуту после этого - 0,1 мл рабочего раствора тромбина (0,25 единиц №Нмл) к 0,1 мл плазмы, разведенной в 1,7 мл вероналового буфера. Предварительно проводили 1-минутную инкубацию при 37 °С разведенной плазмы с раствором фуллеренола (опытная проба) или буфера (контрольная проба), внесенным в икубационную смесь в объеме 0,1 мл. Прохождение тромбининдуцированного свертывания начинали регистрировать сразу после добавления тромбина (нулевой момент времени) по увеличению оптической плотности среды вследствие образования фибриновых волокон из растворимого фибриногена. Последующий лизис сгустка сопровождался снижением оптической плотности среды до исходного уровня. Регистрация изменений оптической плотности проводилась при длине волны 340 нм в кювете с толщиной оптического слоя 1 см, тер-мостатируемой при 37 оС на спектрофотометре СФ-46 (Россия). Расчет параметров турбидиметрической кривой проводили автоматически с помощью компьютерной программы [1].
Достоверность различий опытных и контрольных проб проводили с помощью критерия знаков на основе пяти-шести параллельных экспериментов.
Таблица 1 ванием синглетного кислорода. Представляется, что в нашем исследовании не менее, если не более вероятным механизмом увеличения времен свертывания может быть ингибирование агрегации фибриновых волокон. Косвенным подтверждением этому может быть то, что минимальная ингибирую-щая концентрация фуллеренола в системах, содержащих фибриноген и плазму, отличалась почти на порядок -87 и 10 мкМ соответственно, при том что количество и конечная концентрация вносимого в систему тромбина были одинаковыми. Известно, что плазма содержит многочисленные белковые и иные компоненты, модулирующие скорость агрегации волокон фибрина [4].
Весьма интересными оказались результаты изучения влияния фуллеренола на показатель протромбинового времени. В «классической» постановке этого теста инкубация плазмы с фуллеренолом с последующим добавлением в систему тромбопластин-кальциевой взвеси (техпластина) не выявила достоверных отличий от контрольных значений. Однако прединкубация фуллеренола с техпластином в течение 1 мин с последующим проведением протромбинового теста выявила существенное и дозо-зависимое укорочение времени свертывания. Минимальная эффективная концентрация составила 79 мкМ. Данный эффект может быть объяснен мембра-нотропностью фуллеренов, в том числе модифицированных. Вероятно, взаимодействие фуллеренола с мембраной, которой является тромбопластин, приводит к изменению ее асимметрии, в частности, ускоряет экспонирование остатков фосфатидилсерина, что приводит к более эффективному связыванию с ней факторов
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Выявленные эффекты фуллеренола в стандартных клоттинг-тестах суммированы в табл. 1. Данные, приведенные в таблице, показывают, что фуллеренол вызывал пролонгирование тромбино-вого времени при инкубации как с плазмой крови, так и с раствором очищенного фибриногена, а также АЧТВ. Все выявленные эффекты были дозозависи-мы. В литературе имеются единичные указания об ингибировании тромбина водорастворимыми производными фуллеренов [5]. Однако авторы упомянутой работы изучали воздействие по-ликарбоксилированного фуллерена в условиях фотоиндукции и связывали его ингибирующее действие с образо-
0,180
— Контроль —Фуллеренол 3,9 мкМ
Фуллеренол 7,8 мкМ
- Фуллеренол 19,3 мкМ Фуллеренол 38,6 мкМ
0,000
01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л01Л т-)т-)т-)т-)т-)т-)т-)ГМГМГМГМГМСМППППППП*}-*}-*}-*}-*}-*}-*}-1Л1Л
Время, с
Турбидиметрические кривые фибринообразования и фибринолиза в присутствии различных концентраций фуллеренола С60(0Н)24
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
свертывания. В «классической» же постановке теста мембранотропный эффект из-за кратковременности воздействия оказался слабовыраженным и в результате произошло только нивелирование ингибирующего действия фуллеренола на агрегацию фибрина. Сходные результаты были получены [6] при применении in vivo гидрокси-лированного фуллерена, содержащего гадолиний. Интраперитонеальное введение препарата мышам в дозе 31,4 мкг/кг в течение 7 дней приводило к пролонгации тромбинового времени и АЧТВ, но достоверно укорачивало протромбиновое время. Несмотря на то, что система гемостаза в условиях живого организма регулируется неизмеримо сложнее, чем при проведении тестов in vitro, такая разнонаправленная динамика АЧТВ и протромбинового времени, довольно редко встречающаяся в практике, кажется неслучайной.
Турбидиметрические кривые фибринообразования и фибринолиза в присутствии различных концентраций фуллеренола показаны на рисунке, а параметры кривых суммированы в табл. 2. Существенные изменения характера и параметров кривой отмечаются при минимальной концентрации фуллеренола 19,3 мкМ, что согласуется с данными, полученными в клоттинг-тес-тах. Анализ кривых показывает дозозависимое пролонгирование обеих фаз свертывания: происходит удлинение как лаг-периода, т. е. времени накопления критической массы и длины протофибрилл и зависящего в основном от концентрации активного тромбина, так и времени агрегации протофибрилл. Наоборот, время наблюдаемого фибринолиза достоверно не изменяется. Поэтому показатель соотношения активности процессов «свертывание/фибринолиз» дозозависимо смещается в сторону преобладания фибринолиза. Таким образом, мы не получили убедительных данных о непосредственном воздействии фуллеренола на протекание фибринолиза in vitro.
ВЫВОДЫ
1. Фуллеренол С60(ОН)24 в микромолярных концентрациях в тестовых системах in vitro оказывает антикоагулянт-ный эффект, предположительно являясь ингибитором агрегации фибрина.
2. Фуллеренол обладает мембранотропностью, которая проявляется в повышении протромбинактивирующих свойств тромбопластина.
3. Не обнаружено влияния фуллеренола на продолжительность фибринолиза в изученной тестовой системе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Батагов А. О., Дорофейков В. В., Субботина Т. Ф. Определение параметров фибринообразования и фибринолиза по кривой изменения оптической плотности: св-во о гос.
Таблица
Параметры турбидиметрической кривой свертывания и фибринолиза в присутствии фуллеренола
Показатель Контроль Фуллеренол, мкМ
3,9 7,7 19,3 38,6
Лаг-период свертывания, c 50 65 65 105 145
Время агрегации, c 120 120 115 145 160
Время свертывания, c 170 185 180 250 305
Лаг-период фибринолиза, c 135 135 130 195 250
Время наблюдаемого лизиса, с 140 130 140 140 130
Время фибринолиза, c 295 265 270 335 380
Общее время, c 345 330 330 440 515
Максимальная оптическая 0,162 0,151 0,151 0,091 0,040
плотность, o.e.
Соотношение "свертывание/ фибринолиз" 0,60 0,70 0,65 0,75 0,80
регистрации программы для ЭВМ № 2009611532; зарег. 19.03.09).
2. Субботина Т. Ф., Галебская Л. В., Щербак И. Г. Влияние двухвалентных катионов на образование и лизис фибринового сгустка // Биомедицинская химия. 2005. Т. 51. № 1. С. 60-65.
3. Фуллерены: фотодинамические процессы и новые подходы в медицине / Пиотровский Л. Б. и др. СПб.: Роза мира. 139 с.
4. Galanakis D. K., Lane B. P., Simon S. R. Albumin modulates lateral assembly of fibrin polymers: evidence of enhanced fine fibrin formation and of unique synergism with fibrinogen // Biochemistry. 1987. Vol. 26. P. 2389-2400.
5. Tokuyama H. et al. Photoinduced biochemical activity of fullerene carboxylic acid // J. Am. Chem. Soc. 1993. Vol. 115. P. 7918-7919.
6. Wang J. et al. Antioxidative function and biodistribution of [Gd@C82(OH)22]n nanoparticles in tumor-bearing mice // Biochem. Pharmacology. 2006. Vol. 71. P. 872-881.
РЕЗЮМЕ
Т. Ф. Субботина, М. О. Новак, Ю. В. Мартышкина, А. С. Щурева, М. А. Думпис
Влияние фуллеренола С60(ОН)24 на показатели системы гемостаза in vitro
Водорастворимые гидроксилированные формы фуллерена рассматриваются как перспективные агенты в наномедицине. Целью работы являлось изучение влияния модифицированного фуллерена С60(0Н)24 (фуллеренола) на показатели системы плазменного гемостаза здоровых доноров. Раствор фуллеренола в 0,9 % NaCl добавляли в стандартные тестовые системы для определения тром-бинового времени (ТВ), протромбина (ПВ) и активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ), а в контрольные образцы - такое же количество растворителя. Активность фибри-нолиза оценивалась турбидиметрическим методом. Фуллеренол дозо-зависимо пролонгировал ТВ и АЧТВ, но не оказывал влияния на ПВ. Минимальные достоверно эффективные конечные концентрации фуллеренола в тестовых системах составили в тромбино-вом тесте - 10 мкМ, АЧТВ - 28 мкМ. Прединкубация фуллеренола с тромбопластином в течение 1 мин с последующим проведением протромбинового теста выявила существенное и дозозависимое укорочение ПВ; минимальная эффективная концентрация составила 79 мкМ. Влияния на активность фибринолиза не обнаружено. Таким образом, установлено, что фуллеренол С60(0Н)24 в микромолярных концентрациях оказывает антикоагулянтный эффект, предположительно являясь ингибитором агрегации фибрина. Кроме того, фуллеренол обладает мембранотропностью, которая проявляется в повышении протромбинактивирующих свойств тром-бопластина.
Ключевые слова: фуллеренол, гемостаз, фибринолиз.
УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XIX • N02 • 2012
SUMMARY
T. F. Subbotina, M. O. Novak, Yu. V. Kartyshkina, A. S. Shchureva, M.A. Dumpis The influence of fullerenol C60(0H)24 on the in vitro haemostatic parameters
Water-soluble hydroxylated fullerenes are perspective agents in nanomedicine. The aim of this study was investigation of the influence of the modified fullerene C60(OH)24 (fullerenol) impact on the plasma haemostatic parameters in healthy donors. Fullerenol solution in 0.9 % NaCl was added to the standard testing systems to assay the thrombin time (TT), prothrombin time (PT), and activated partial thromboplastin time (APTT); the controls were the same amounts of the vehicle. The fibrinolysis activity was estimated by a
turbidimetric method. Fullerenol dose-dependently prolonged TT and APTT but had no effect on PT. The minimal effective final concentrations of fullerenol in the incubation mixtures were 10 mkM for TT and 28 mkM for APTT. The 1-min preincubation of fullerenol with thromboplastin with the subsequent prothrombin test led to a significant and dose-dependent PT shortening with the minimal effective concentration of 79 mkM. The effect of fullerenol on the fibrinolysis activity was not established. Thus, it was found that fullerenol C60(OH)24 in the micromolar concentrations had an anticoagulant effect presumably being the inhibitor of fibrin aggregation. Besides, fullerenol displayed membranotropic activity manifested by enhancement of prothrombin-activating properties of thromboplastin.
Key words: fullerenol, hemostasis, fibrinolysis.
© Д. А. Танянский, И. А. Мартынихин, А. Д. Денисенко, 2012 г. УДК 616-056.5:616.895.8
Д. А. Танянский, И. А. Мартынихин, А. Д. Денисенко
ТЕЧЕНИЕ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА И СВЯЗЬ ЕГО ПРОЯВЛЕНИЙ С СОДЕРЖАНИЕМ АДИПОКИНОВ У БОЛЬНЫХ ШИЗОФРЕНИЕЙ: РЕЗУЛЬТАТЫ СРАВНЕНИЯ С ГРУППОЙ ПСИХИЧЕСКИ ЗДОРОВЫХ ПАЦИЕНТОВ С ИБС
НИИ экспериментальной медицины СЗО РАМН, Санкт-Петербург; кафедра психиатрии и наркологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова
ВВЕДЕНИЕ
В различных исследованиях, в том числе и в проведенных нами, было показано, что у пациентов с шизофренией отмечается высокая частота метаболического синдрома (МС) - кластера взаимосвязанных факторов риска атеросклероза и ишемической болезни сердца [1, 9, 15]. Формированию МС у данных пациентов способствует целый ряд психопатологических факторов, в частности, склонность больных к стрессу и депрессии (часто на фоне бреда и галлюцинаций), а также эмоционально-волевые расстройства. Данные нарушения зачастую приводят к гипокинезии, изменению характера питания, снижению заботы о своем здоровье. С другой стороны, лечение больных шизофренией антипсихотическими препаратами, главным образом нейролептиками второго поколения (атипичными антипсихотиками), также способствует развитию обменных расстройств. Показано, что прием «ати-пиков», в особенности клозапина и оланзапина, приводит к увеличению массы тела [4], снижению инсулин-
чувствительности [10], нарушению липидного обмена [13], усиливает риск развития кетоацидоза и сахарного диабета [12]. Кроме того, «атипики» повышают уровень в крови лептина [10, 11] и, по данным некоторых авторов, снижают концентрацию адипонектина [18]. В свою очередь, изменение концентраций данных адипокинов может способствовать нарушениям углеводного и ли-пидного обмена [8, 19]. Указанные выше психопатологические и медикаментозные факторы могут накладывать свой отпечаток как на характер течения МС, так и на роль адипокинов в его патогенезе. С целью проверки данного предположения мы провели сравнительное исследование клинико-биохимических проявлений МС и взаимосвязей его характеристик с содержанием адипокинов в группах шизофрении и психически здоровых пациентов со стабильными формами ИБС, для которых также характерна высокая встречаемость данного синдрома.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В исследование включены 163 больных параноидной шизофренией (критерии МКБ-10, 81 мужчина и 82 женщины, средний возраст - 42,1±13,7 года), госпитализированных в один из психиатрических стационаров Санкт-Петербурга. Все больные принимали нейролептики, из них 49,7 % пациентов - препараты атипичного ряда (в основном клозапин, рисперидон, оланзапин). В качестве группы сравнения были обследованы 158 психически здоровых пациентов (90 женщин и 68 мужчин) в возрасте 57,5±9,2 года, находящихся на лечении по поводу ишемической болезни сердца (в основном стабильные формы стенокардии 23 ф. к.) и сопутствующей артериальной гипертензии в клинике НИИИЭМ СЗО РАМН. У35 (22%) пациентов данной группы был выявлен сахарный диабет 2 типа (критерии ВОЗ 1999 г. [22]). Данное заболевание у всех лиц проходило в стадиях компенсации и субкомпенсации, без выявленных осложнений. На момент обследования пациенты соблюдали гипогликемическую диету, сахароснижающие и гиполипидемические препараты не принимали. Метаболический синдром (критерии ATP III [6]) был выявлен
