CC BY
70
БИОТЕХНОЛОГИЯ
УДК 581.14
Р.А. Карначук, В.Ю. Дорофеев, Е.С. Гвоздева, И.Ф. Головацкая,
А.А. Чурин, Н.И. Суслов, Ю.В. Медведева
ВЛИЯНИЕ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА РОСТ И УРОВЕНЬ ТРИТЕРПЕНОВЫХ САПОНИНОВ И ФЛАВОНОИДОВ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ATRAGENE SPECIOSA WEINM.
Работа поддержана грантом ФЦНТП (Государственный контракт № 02.512.11.2220 от 4 июля 2008 г.)*
Аннотация. Получены клеточные культуры Atragene speciosa Weinm. (княжик сибирский) in vitro, обладающие стабильной скоростью роста для дальнейшего исследования фармакологической активности экстракта на их основе. Оптимизирован состав питательной среды для активного роста клеточных культур княжика сибирского in vitro, полученных на основе эксплантов боковых почек и стебля годичных побегов дикорастущих интактных растений Atragene speciosa Weinm.
С целью оптимизации продукционного процесса исследовано влияние жасмоновой кислоты, 24-эпибрассинолида. Показана эффективность 24-эпибрассинолида гу-миновых кислот, препарата «Силк» на накопление тритерпеновых сапонинов и флавоноидов. Содержание тритерпеновых сапонинов в культуре клеток сопоставимо с уровнем этих веществ в интактном дикорастущем растении.
Ключевые слова: Atragene speciosa, клеточная культура, in vitro, тритерпе-новые гликозиды.
Княжик сибирский (Atragene speciosa Weinm.) - многолетняя лиана флоры Сибири. Необходимость введения этого вида в асептическую культуру in vitro обусловлена возможностью получения физиологически активных веществ (тритерпеновых гликозидов - сапонинов, фенолоспиртов и их гликозидов, флавоноидов) для создания в дальнейшем ноотропного и адаптогенного фитопрепарата. Atragene speciosa Weinm. - вид с азиатским ареалом, природные заросли которого разрежены и занимают небольшие площади, а интродукция, в связи с морфологическими особенностями стебля, затруднена.
Важным моментом при культивировании клеточных культур является оптимизация продукционного процесса добавлением в питательную среду физиологически активных соединений, в том числе гормонов. При этом особое внимание уделяется регуляторам роста (жасмоновая кислота, 24-эпибрас-синнолид, гуминовые кислоты и др.).
* Статья В.Ю. Дорофеева, Р.А. Карначук, И.В. Шиловой «Элементный состав клеток кал-лусной культуры княжика сибирского (Atragene speciosa Weinm.) in vitro», опубликованная в Вестнике Томского государственного университета. Биология. 2008. № 2 (3) (С. 1217), написана по материалам исследований, поддержанных грантом ФЦНТП (Государственный контракт № 02.512.11.2220 от 4 июля 2008 г.).
Авторы данной работы исследовали регуляторное действие жасмоновой кислоты (ЖК), 24-эпибрассинолида (ЭБ), гуминовых кислот (ГК) и препарата «Силк» (в настоящее время препарат зарегистрирован под торговым названием «Новосил»), полученного на основе отходов производства пихтовой древесины (опил, кора и хвоя). Эффект жасмонатов проявляется специфически в каждой конкретной культуре клеток в зависимости от вида растения, линии или штамма клеток, питательной среды и других условий культивирования [1, 2].
Объект и методики исследования
Объектами исследования служила изолированная культура каллусных клеток княжика сибирского in vitro, полученная на кафедре физиологии растений и биотехнологии Томского госуниверситета из эксплантов молодых листьев дикорастущего растения (Республика Хакасия, Ширинский район). Вторая линия получена на основе эксплантов боковых почек и стебля годичных побегов дикорастущих интактных растений A. speciosa (г. Томск, окрестности поселка Степановка). Линии каллусной культуры использовали для получения суспензионных культур клеток A. speciosa с целью дальнейшего масштабирования технологии в биореакторе.
Индукция каллусогенеза проводилась на среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением гормонов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и 6-бензиламинопурина (БАП) в темноте. Каллусную культуру выращивали на агаризованной среде МС с добавлением витаминов (тиамин-НС1, пиридок-син-НС1 0,5, никотиновая кислота-НС1 0,5); мезоинозита; пантотената Са; гидролизата казеина; глицина; глюкозы; рН среды 5,8. Для оптимизации роста добавляли фитогормоны в разных концентрациях (2,4-Д, НУК и БАП).
Культуру клеток, выращенную на среде с 2,4-Д, имеющую рыхлую структуру и достаточно высокую интенсивность роста по сухой биомассе, использовали для получения суспензии клеток путём переноса рыхлого каллуса в жидкую среду того же состава. Колбы с культурами размещали на орбитальном шейкере UNIMAX 2010 (Heidolph Instruments Gmb& Co. KG, Германия; период колебаний 100 об/мин). При переносе каллуса на жидкую питательную среду без СаС12 в колбы первоначально образовывались крупноагреги-рованные комплексы в суспензии, а диаметр некоторых глобул достигал 23 мм и более. При последующем субкультивировании в колбах суспензия отбиралась по типу мелкой агрегированности.
С целью дальнейшей оптимизации условий выращивания и получения наибольшего выхода биологически активных веществ клеточной культуры А. speciosa в питательную среду добавляли ЖК в концентрациях 10-6-10-9 М; ЭБ в концентрациях 10^-10-12 М; ГК в концентрациях 103-105%; препарат «Силк» в концентрациях 0,04 и 0,08 мл/л.
Прирост сырой биомассы оценивали в % по общепринятому показателю -ростовому индексу. Определяли среднюю конечную и среднюю начальную массу клеток культуры in vitro, а после высушивания клеток при температуре 50-55°С до воздушно-сухого состояния - сухую массу.
Жизнеспособность культуры устанавливали по стандартной методике путём окрашивания клеток метиленовым синим [3]. Количество клеток считали в камере Фукса-Розенталя [4].
Микроскопический анализ крупноагрегированной суспензии проводили после мацерации в смеси 0,2% целлюлазы и 0,2% пектиназы (1:1) в течение 1 ч при 26°С. Для получения изотонического раствора добавляли маннит (90 г/л) и СаС12 (1,480 г/л). Измеряли размеры клеток для определения их объёма [5].
Результаты и их обсуждение
Переход к суспензионным культурам вызван тем, что при таком режиме культивирования, как правило, происходит интенсификация ростовых процессов, а в ряде случаев увеличивается биосинтетический потенциал культур. Суспензионные культуры сохраняют ряд свойств, характерных для исходного организма. Одним из таких свойств является способность к синтезу вторичных метаболитов [6, 7].
Поскольку суспензионная культура клеток этого вида получена впервые, начальным этапом работы была оптимизация условий выращивания, изучение её цитологических и физиологических характеристик, в частности размера клеток, агрегированности, скорости роста суспензии, оптимального времени субкультивирования. По мере увеличения количества пассажей улучшались ростовые характеристики суспензионной культуры, сокращалось время максимального накопления массы клеток, увеличивалась концентрация и повышалась жизнеспособность культуры (табл. 1).
Т а б л и ц а 1
Ростовые характеристики суспензионной культуры Atragene speciosa Weinm.
(среднее значение ± m)
Характеристики Среда MC (2,4-Д; БАП) Среда MC (НУК; БАП)
3-й пассаж 5-й пассаж 3-й пассаж 5-й пассаж
Жизнеспособность клеток, % 63±3 76±2* 58±2 б1±4*
Плотность клеток, кол-во клеток/мл 3,5^ 104 4,810б* 2,3^ 104 2,7-105*
Содержание сухой массы в клетках, % 4,5±0,3 5,2±0,2* 3,8±0,2 4,5±0,2
Время максимального накопления массы, сут 20±3 1б±3* 30±2 27±3*
Примечание. МС - среда Мурасиге-Скуга; 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; НУК - а-нафтилуксусная кислота; БАП - 6-бензиламинопурин; * р < 0,05.
Клеточная культура княжика сибирского способна как в каллусе, так и суспензии синтезировать тритерпеновые гликозиды и флавоноиды в условиях in vitro. В каллусной культуре клеток обнаружено содержание тритерпеновых сапонинов (1,19±0,02 г на 100 г сухой массы; для сравнения: в надземной части дикорастущего интактного растения - 1,00±0,01 г).
Количество флавоноидов дикорастущего княжика сибирского: в листьях -6,09; в стеблях - 1,64%; в корнях - 0,83%; в надземной части растения в период цветения и плодоношения - 0,26% [8]. Максимальное содержание флавоноидов (5,15%) в каллусной культуре со 2-го по 6-е субкультивирование сопоставимо с их количеством в листьях интактного растения (6,09%), что позволяет говорить о сохранении способности к накоплению данных соединений в культуре in vitro.
Проведены исследования по влиянию ЖК на рост клеток в условиях твёрдой и жидкой питательных сред. Установлено, что ее концентрация 10-9 М приводит к снижению ростовых показателей каллусной культуры (табл. 2). Начиная с 17-х суток проявлялся ингибирующий эффект во всех диапазонах концентраций, что приводило к снижению прироста биомассы каллуса в конце субкультивирования (рис. 1). Жасмоновая кислота (при концентрации 10-6 и 10-9 М) оказывала ингибирующий эффект на клеточную суспензию 5-го и 6-го субкультивирований княжика сибирского (табл. 3).
Т а б л и ц а 2
Ростовые характеристики каллусной культуры Atragene speciosa Weinm. на среде с жасмоновой кислотой 5-го субкультивирования (среднее значение ± m)
Параметры роста Варианты выращивания
в колбах в пробирках
Контроль ЖК, 10-9 M Контроль ЖК, 10-9 M
Индекс роста 2,44±0,02 1,50±0,02* 2,65±0,37 1,73±0,12*
Сухая масса, мг 3,67±0,21 2,57±0,11* 3,76±0,21 2,54±0,08*
* Различия достоверны с контролем при р < 0,05.
§
ю
20
15 -
X
О
m*i*i
to
-э-п * Т
Г*1
til
□ контроль
□ ЖК 10-7M
□ ЖК 10-8M
□ ЖК 10-9M
1 8 17 27
Возраст культуры, сут
Рис. 1. Динамика роста клеточной культуры Atragene зрееіоза Шеіпш. 70-го субкультивирования с жасмоновой кислотой.
* Различия достоверны с контролем при р < 0,05
30
25
*
*
*
*
5
Т а б л и ц а 3
Ростовые характеристики суспензионной культуры Atragene speciosa Weinm. на среде с жасмоновой кислотой (среднее значение ± т)
Параметры роста № пассажа Концентрация
Контроль ЖК, М
10-6 10-9
Индекс роста 5 1,58±0,07 0,86±0,03* 1,34±0,04*
6 2,04±0,03 0,95±0,07* 1,27±0,07*
Сухая масса, мг 5 5,22±0,05 1,53±0,12* 2,63±0,13*
6 5,71 ±0,02 1,58±0,07* 2,74±0,07*
* Различия достоверны с контролем при р < 0,05.
В последние годы внимание исследователей привлекает такой регулятор роста, как эпибрассинолид (ЭБ) - класс фитогормонов с широким спектром биологической активности [9]. Существует сравнительно немного данных по исследованию действия ЭБ на культуры тканей растений, причем эффекты, как правило, противоречивы [10-12]. В экспериментах на культуре А. speci-osa было исследовано действие ЭБ в широком диапазоне концентраций. Только в концентрации 10-9 М ЭБ существенно влиял на рост каллуса и суспензионной культуры (табл. 4, 5). Добавление в среду ЖК и ЭБ в концентрации 10-8 М также стимулировало образование высокополярных тритерпеновых сапонинов. В суспензионной культуре княжика сибирского десятого субкультивирования обнаружено восемь высокополярных сапонинов.
Т а б л и ц а 4
Ростовые характеристики каллусной культуры Atragene speciosa Weinm. 5-го субкультивирования на среде с 24-эпибрассинолидом (среднее значение ± т)
Параметры роста Варианты выращивания
в колбах в пробирках
Контроль ЭБ, 10-9 М Контроль ЭБ, 10-9 М
Индекс роста 2,44±0,02 3,65±0,03* 2,65±0,37 4,76±0,07*
Сухая масса, мг 3,67±0,21 5,31±0,23* 3,76±0,21 7,53±0,24*
* Различия достоверны с контролем при р < 0,05.
Т а б л и ц а 5
Ростовые характеристики суспензионной культуры Atragene speciosa Weinm. на среде с 24-эпибрассинолидом (среднее значение ± т)
Параметры роста № пассажа Концентрация
Контроль ЭБ, М
10-6 10-9
Индекс роста 5 1,58±0,07 1,57±0,05 2,56±0,12*
6 2,04±0,03 1,63±0,02* 2,44±0,09*
Сухая масса, мг 5 5,22±0,05 3,87±0,11* 5,84±0,13*
6 5,71±0,02 4,35±0,09* 6,17±0,11*
* Различия достоверны с контролем при р < 0,05.
Использование новых стимуляторов роста растений находит применение при выращивании клеточных культур in vitro. ГК применяют для стимуляции каллусообразования рапса (Brassica napus L.) и регенерации побегов и корней люцерны (Medicago varia Mart.) [13]. Показано, что «Силк» повышает иммунитет растений, снижая заболеваемость в 2-5 раз. Системное действие «Силка» приводит к существенному увеличению урожайности растений [14]. В наших опытах наибольший прирост сырой биомассы каллуса княжика сибирского отмечен на среде с ГК в концентрациях 10-3 и 10-4%. Клеточная культура 15-го субкультивирования на среде с добавлением препарата «Силк» также имела существенный прирост по сравнению с контролем (табл. 6). Под влиянием препарата «Силк» происходило накопление малополярных сапонинов.
Т а б л и ц а 6
Ростовой индекс Аtragene speciosa Weinm. 15-го субкультивирования на среде с гуминовыми кислотами и препаратом «Силк», % (среднее значение ± m)
Компонент питательной среды
Контроль ГК (10-3%) ГК (10-4%) ГК (10-5%) «Силк» (0,04 мл/л) «Силк» (0,08 мл/л)
145±0,4 333±0,2* 332±0,5* 161±0,3 278±0,4* 247±0,2*
Примечание. Контроль - отсутствие гуминовых кислот (ГК) и препарата «Силк» в питательной среде; БАП - 6-бензиламинопурин. * Различия достоверны с контролем при р < 0,05.
Таким образом, впервые получена каллусная и суспензионная культуры A. speciosa, обладающие стабильной скоростью роста, для которых была подобрана среда и оптимизирован режим культивирования. Время максимального накопления биомассы суспензионной культуры составляло 16-20 сут, а плотность суспензии - 4,8-106 клеток/мл.
Полученные результаты позволяют говорить о необходимости дальнейшего изучения перспективного продуцента - клеточной культуры княжика сибирского in vitro - физиологически активных веществ для создания фитопрепарата ноотропного и адаптогенного действия.
Литература
1. Debeljak N., Regvar M., Dixon K.W., Sivasithamparam K. Induction of tuberisation in vitro with jasmonic acid and sucrose in an Australian terrestrial orchid, Pterostylis sanguinea // Plant Growth Regulation 36. 2002. Р. 253-260.
2. Parthier B. Jasmonates, new regulators of plant growth and development: many facts and few hypotheses on their actions // Bot. Acta. 1991. Vol. 104. P. 446-454.
3. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. М.: Агропромиздат, 1988. 271 с.
4. Головацкая И.Ф. Карначук Р.А. Регуляторная роль света в процессах фотосинтеза и роста лекарственных растений // Теоретические и практические аспекты изучения лекарственных растений. Томск: Сибирский госмедуниверситет, 1996. С. 49-51.
5. Мокроносов А.Т. Березенкова Р.А. Методика количественной оценки структуры и функциональной активности фотосинтезирующих тканей и органов // Практикум по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1978. Т. 61, вып. 3. С. 119-133.
6. Simmonds D., Setterfield G., Brown D.L. Organization of microtubules in dividing and elongating cells of Vicia hajastana Grossh. in suspension culture // Eur. J. Cell Biol. 1983. Vol. 32, № 1. P. 54-66.
7. Svatos A., Macek T. The rate production in suspension cultured cells of the fern Pteridium aquilinum // Phytochem. 1994. Vol. 35, № 3. P. 651-564.
8. Шилова И.В., Краснов Е.А., Суслов Н.И. Химико-фармакологическое изучение активной фракции Atragene speciosa Weinm. // Бюллетень СО РАМН. Новосибирск. 2001. № 3 (101). С. 44-49.
9. Khripach V.A., Zhabiunskii V.N. Groot Ae de Brassinosteroids: a new class of Plant Hormones. San Diego: Academic Press, 1999. 456 p.
10. Ikekawa N., Zhao Y.I. Application of 24-Epibrassinolide in Agriculture // J. Am. Chem. Soc. Meeting Abstracts. 1991. Vol. 474. P. 292.
11. Verpoorte R., Cosmo F. Di, Misava M. Plant Cell Culture Secondary Metabolism / Eds. Boca Raton. New York; London; Tokio: The CRS Press, 1996. Chapter 9. 660 p.
12. RoddickI.G., Rintrberg A.L., Ikekawa N. Developmental Effects of 24-Epibrassinolide in Excised Roots of Tomato Grown in vitro // Physiol. Plant. 1993. Vol. 87. P. 453-458.
13. Комисарова И.Д., Грехова И.В. Применение гуминового препарата «Росток» // Материалы конференции «Высокие технологии добычи, глубокой переработки и использования озерно-болотных отложений» (12-15 марта 2003 г.). 2003. С. 131-135.
14. Ларионов Г.И. Влияние препарата «Силк» на урожайность пшеницы и ячменя // Сельскохозяйственные вести. 2002. № 1. С. 55-59.
