CC BY
47УДК: 664.162.81
Влияние ферментативного трансгликозилирования гликозидов стевии на их
вкусовые характеристики
Чхан Кристина Викторовна
ФГБОУВО «Московский государственный университет пищевых производств» Адрес: 125080, город Москва, Волоколамское шоссе, д. 11 Научно-исследовательская лаборатория компании PureCircle Limited
Адрес: 50250, город Куала Лумпур, Малайзия E-mail: ch.kristina84@gmail.com
Мойсеяк Марина Борисовна
ФГБОУ ВО «Московский государственный университет пищевых производств» Адрес: 125080, город Москва, Волоколамское шоссе, д. 11
E-mail: marma-mgupp@maiLru
Ферментативное трансгликозилирование эффективно для структурной модификации биологически активных соединений, включая высокоинтенсивные подсластители.
Проведена ферментативная модификация гликозидов стевии. В качестве продуцентов цикломальтодекстрин глюканотрансферазы (ЦГТаза) был использован Bacillus stearothermophilus St-88. ЦГТазa может быть эффективным биокатализатором в реакции трансглюкозилирования Ребаудиозида А, Ребаудиозида D и Ребаудиозида М в присутствии циклодекстринов и крахмала в качестве доноров. Показана возможность получения глюкозилированных гликозидов стевии с различной длиной боковых цепочек. Выделение и очистку индивидуальных производных РебD-G1/G2 осуществляли на 10-ти колонках, соединённых друг с другом. Использовали макропористую смолу Diaion HP-20 (аналогично РебD-G1/G2, проводили выделение и очистку РебM-G1/G2, РебA-G1/G2). Показано, что глюкозилированные гликозиды стевии могут быть превосходными высокоинтенсивными подсластителями, а также подходящими высокоактивными ингредиентами для модуляции вкусовых качеств немодифицированных гликозидов.
Ключевые слова: высокоинтенсивные подсластители, цикломальтодекстрин глюканотрансфераза, Ребаудиозид D, Ребаудиозид M, Ребаудиозид A, стевиол гликозиды стевии, ферментативная модификация, модуляция вкусовых качеств
Стевия - род многолетних растений семейства Астровые, или Сложноцветные, включающий в себя около 260 видов трав и кустарников, произрастающих в Южной и Центральной Америке. Стевиол гликозиды представляют собой класс соединений, найденных в листьях Stevia rebaudiana Bertoni, многолетнем кустарнике семейства Asteraceae (Compositae) (ОМат & Yamasaki, 2002). Стевиол гликозиды характеризуются структурно одним основанием, стевиолом, отличающимся наличием карбогидратных остатков в положениях С13 и С19. Они накапливаются в листьях стевии, составляя примерно 10-20% от сухого веса. В составе листа можно выделить четыре основных гликозида найденные в листьях Стевии ребаудиана, это
стевиозид (Stevioside) (9,1%), ребаудиозид А (RebA) (3,8%), ребаудиозид С (RebC)(0,6-1.0%) и дулкозид A (DulA) (0,3%) (Kinghorn & Soejarto, 1985). Другие известные стевиоловые гликозиды включают ребаудиозид B, C, D, E, F и M, стевиолбиозид и рубозозид, а также минорные гликозида стевии, содержащиеся в листе стевии в следовых количествах (Abelyan & Abelyan, 2012).
Среди природных высокоинтенсивных подсластителей, сладкие гликозиды Stevia rebaudiana Bertoni (Стевия) занимают особое место (Kohda, Kasai, Yamasaki, Murakami, & Tanaka, 1976). Они в среднем от 30 до 450 раз слаще, чем обычный сахар.
Они по существу некалорийные и в основном используются в диетических продуктах и продукты с пониженной калорийностью, включая продукты питания и напитки (Morita, Fujita, Matsuura, & Ota, 2010). Высокоинтенсивные подсластители не вызывают гликемического ответа, что делает их пригодными для использования в продуктах, предназначенных для диабетиков и других, заинтересованных в контроле за потреблением углеводов (Kitahata, 2001).
Однако сладкие стевиол гликозиды стевии обладают остаточными горечью и послевкусием, которые влияют на вкусовые качества конечных продуктов и делают несколько сложным их применение (Lipinski,Hanger, & Acesulfame, 2001). Эти недостатки можно устранить модификацией исходных соединений с помощью реакции межмолекулярного трансгликозилирования под действием различных ферментов. При этом происходит присоединение других углеводов в соответствующих положениях стевиола.
Цель работы - изучение влияния ферментативного трансгликозилирования гликозидов Стевии на их вкусовые характеристики. Для этого, были проделаны исследования по идентификации, очистки и характеристике новых гликозидов Стевии, присутствующих в следовых количествах, но обладающих более приемлемыми вкусовыми качествами.
Методика
В присутствии циклических или линейных мальтоолигосахаридов или крахмала в качестве доноров глюкозных единиц, ЦГТаза катализирует межмолекулярную реакцию трансгликозилирования, в результате которой происходит перенос а-глюкозильных единиц от углевода и присоединение в положениях С13 и С19 гликозидов стевии (а-1,4-трансглюкозилирование). Именно количество углеводных единиц в указанных позициях определяет качество и степень сладости соединения (Soejarto, Compadre, Medon, Kamath, & Kinghorn, 1983).
ЦГТазы, продуцируемые термофильными микроорганизмами является наиболее эффективной для трансглюкозилирования гликозидов Стевии. В качестве продуцентов
цикломальтодекстрин глюканотрансферазы
(ЦГТаза) был использован Bacillus stearothermophilus St-88 из коллекции культур микроорганизмов компании PureCircle Limited (Малайзия) (Abelyan, Ghochikyan, Markosyan, Adamyan, Abelyan, 2010).
Выбранная нами ЦГТаза из Bacillus stearothermophilus является очень эффективной не только для трансглюкозилирования стевиозида, но также РебА, РебD и РебМ, которые обычно очень трудно поддается модифицированию. В присутствии циклодекстринов степень трансгликозилирования является более глубокой с образованием производных с более длинными боковыми цепочками. Применение циклодекстринов более целесообразно с целью получения низкомолекулярных производных, обладающих отменными вкусовыми качествами. Остаточный циклодекстрин дополнительно может замаскировать горечь и сделать сладость более мягкой и нежной (Prakash, DuBois, Clos, Wilkens, & Fosdick, 2008).
Для трансгликозилирования РебА с помощью ЦГТазы, в качестве донора глюкозных единиц использовали крахмал или гамма-циклодекстрин (Y-ЦД).
Для выявления оптимального значения рН процесса с использованием крахмала, 10 г крахмала суспендировали в 30 мл буферного раствора с соответствующим рН и разжижение осуществляли при 80-85°С в течение 20 мин после добавления 1 мл концентрированного ультрафильтрата культуральной жидкости B. stearothermophilus (около 2.0 единиц на 1 г крахмала). В полученном растворе растворяли 10 г высокочистого РебА, добавляли 7 мл раствора фермента и инкубировали при 55°С в течение 12 ч. Эффективность процесса оценивали по остаточному содержанию гликозидов (Abelyan & Abelyan, 2012).
Для выявления оптимальных значений рН процесса с использованием ЦД, по 5.8 г у-ЦД и высокочистого РебА растворяли в 85 мл буферного раствора с соответствующим рН, добавляли раствор фермента с активностью 8.5 ед./г RebA и инкубировали при 55oC течение 12 ч. (Akimaru, Yagi, & Yamamoto, 1991).
Выявлено, что оптимальный рН для обоих процессов находится в пределах 5.5-7.0 (рисунок 1).
120
d
100
ЕС 80
< 60
40
20
0
9
PH
Крахмал
ЦД
Рисунок 1. Влияние рН на трансферазную активность ЦГТазы В.stearothermophilus (А, % от максимальной) при трансгликозилировании РебА. рН 3.0-3.5 - ацетатный буфер; рН 4.0-6.5 -фосфатно-цитратный буфер; рН 7.0-9.0 -натрий-фосфатный буфер.
Для определения оптимальной температуры, трансгликозилирование осуществляли
аналогично описанному для оптимального рН при различных температурах. рН реакционной среды устанавливали 6.5 ^аЫ, Тапака, & Kamiya, 1984; Yamamoto, Yoshikawa, & Okada, 1994). Оптимальная температура процесса находилась в пределах 70-75°С, однако, чтобы обеспечить высокую стабильность ЦГТазы, 65°С было выбрана в качестве оптимальной (рисунок 2).
120
d
100
ЕС 80
< 60
40
20
0
37 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90
ТЕМПЕРАТУРА, ОС
■ Крахмал * ЦД
Рисунок 2. Влияние температуры на степень трансгликозилирования РебА ЦГТазой ВМеатЛегторЫ1ш (А, % от максимальной).
Реакцию трансгликозилирования в присутствии у-ЦД в соотношении 1:1 (вес/вес) осуществляли следующим образом.
50г у-ЦД растворили в 300 мл воды, затем добавили 50 г РебА (^ 97%) и нагрели для полного растворения. Охлаждали до 65°С и добавили 25
мл концентрированного фильтрат культуральной жидкости с ЦГТазной активностью. Реакцию осуществляли при 65°С в течении 24-48 часов при постоянном перемешивании (Yamamoto, 1998). Реакцию останавливали термообработкой при 100°С в течение 10 мин.
Для осуществления реакции при весовом соотношении РебА : у-ЦД=1:2 и 1:3, использовали 23-24% смесь 20 г у-ЦД и 10 г РебА и 30 г у-ЦД и 10 г РебА, соответственно.
Обработанный активированным углем раствор реакционной смеси пропускали через колонку с Diaion HP-20 или Amberlite XAD-4 (отношение гликозидов к гелю составляет 10% (вес/объем). Элюцию трансглюкозилированных продуктов проводили 50% этиловым спиртом, растворы выпаривали и остаток высушивали досуха при 45-50°С под вакуумом (Абелян, 2001).
Полученный продукт обрабатывали р-амилазой, а- амилазой или глюкоамилазой. Такая обработка приводит к гидролизу длинных боковых цепочек производных до моно- и ди-глюкозилированных компонентов.
Обработку р-амилазой может производится либо до очистки трансглюкозилированной смеси на крупнопористой адсорбционных смолах, либо после хроматографического удаления остаточных мальтоолигосахаридов и присутствующих в реакционной смеси других примесей.
К 50 г исходного продукта добавляли 5.7 мл р-амилазы (Nagase, Япония) разбавленную в 10 раз и инкубировали при 40°C и в течении нескольких часов. Количество фермента и время обработки можно менять в соответствии с преследуемой цели, что будет влиять на соотношение отдельных производных в конечной смеси. Продукт очищали на специфической крупнопористой хроматографической смоле Diaion HP-20 (Dobberstein & Ahmed, 1982).
Для осуществления трансгликозилирования РебА в присутствии крахмала, крахмал суспендировали в трех объемах (вес/об) воды с рН 6.0-6.5, добавляли ЦГТазу в количестве 2.0 ед/г крахмала, нагревали до 75-80°С, декстрозный эквивалент (ДЭ) в пределах 0,15-0,3. Раствор охлаждают до 60-65°С, добавляли РебА в количестве 1:1 (вес/вес), ЦГТазу в количестве 8.0 ед/г крахмала и реакцию осуществляли при 65°С в течение 48 часов при постоянном перемешивании. Затем реакционную смесь обрабатывали активированным углем,
5
2
3
4
6
7
8
фильтровали и фильтрат высушивали на распылительной сушке.
Для гидролиза высокомолекулярных производных 30% раствор трансгликозилированного продукта обрабатывали 25 ед/г глюкоамилазы (Novozymes, Дания) при 50°С. Реакционную смесь очищали на крупнопористых смолах, как это описано в случае с ЦД в качестве донора глюкозных остатков. Элюцию осуществляли 50%-ным этанолом .
Определение гликозидов Стевии и их производных проводилось методом ВЭЖХ на приборе «Agilent 1100 series» (США) в следующих условиях: колонка - «Zorbax NH2» (5 мкм, 4.6 x 250 мм); подвижная фаза - ацетонитрил-вода (70:30, об/об); скорость протока 1 мл/мин; детектор - УФ-детектор при 210 нм (Purkayashta, Martin, Petit, & Chkhan, 2017; Purkayashta, Martin, Petit, & Chkhan, 2018).
Для анализа трансгликозилированных производных гликозидов Стевии ЦГТазой использовали колонку Zorbax-NH2 (5 мкм, 4.6 x 250 мм) с подвижной фазой ацетонитрил-вода метод градиента от 80:20 об/об (2 мин) до 50:50 об/об в течение 90 мин с использованием УФ-детектор при 210 нм.
Идентификация гликозидов методом
высокоэффективной жидкостной хромато-масс спектрометрии (ВЭЖХ/МС). Для осуществления ВЭЖХ-МС использовали настройки аппарата:
• Колонка: Agilent Poroshell 120 SB-C18 (2.7 мкм; 4.6мм x 150мм);
• Температура колонки: 40°C
• Мобильная фаза: Раствора заранее отфильтровывали и смешивали непосредственно перед анализом:
• Раствор А: 25% ацетонитрил - 75% раствор муравьиной кислоты (0.1%)
• Раствор Б: 32% ацетонитрил - 68% раствор муравьиной кислоты (0.1%)
• Время проведения полного анализа на ВЭЖХ-МС: 60 мин;
• Интервал после окончания анализа одной пробы и началом анализа следующей: 10 мин;
• Температура автоматического пробоотборника: 23-24°C.
Выделение и очистку индивидуальных производных осуществляли на 10-ти колонках со смолой Diaion HP-20, соединенных между собой параллельно. Принцип разделения основан на разнице в сродствах к носителю раличных производных (Dobberstein & Ahmed, 1982; Morita,
Могйа, & КашаМ, 2011).
Через колонки пропускали 20% раствор модифицированного РебА в 5% этиловом спирте после двукратной обработки глюкоамилазой и очистки на крупнопористой смоле. Количество вносимого гликозида составляло около 60-70% от общей адсорбционной емкость носителя.
Колонки последовательно промывали водой и 10% этанолом и элюцию гликозидов осуществляли 50% этанолом.
Из суммарного продукта, полученного из седьмой колонки, приготавливали 20% раствор и снова пропускали через систему из 10-ти колонок и процесс осуществляли аналогично вышеописанному. Полученны продукты с 80%-ным содержанием моно- и ди-гликозилированных производных из четвертой и седьмой колонок.
Для трансгликозилирования РебD с помощью ЦГТазы проводили с использованием крахмала или у-ЦД в качестве донора глюкозных единиц.
10г 96% чистоты РебD и 12 г у-ЦД (мол/мол к РебD) нагрели в 100 мл воды (рН 6.5-7.0) до полного растворения. Раствор охлаждали, суспензировали крахмал в соотношении 1:1 (вес/вес) к у-ЦДи добавляли около 2ед/г крахмала ЦГТазу ВМеагоЛегторЫи и разжижение осуществляли при постепенном увеличении температуры до 80-85°С и выдерживали 20 мин при постоянном интенсивном перемешивании, затем добавляли вторую порцию ЦГТазы в количестве 10ед/г крахмала и реакцию трансгликозилирования осуществляли при 65°С в течение 48 часов при постоянном перемешивании. Фермент инактивировали нагреванием, реакционную смесь фильтровали, очищали на крупнопористой адсорбционной смоле Diaion НР-20, концентрировали и высушивали.
Трансгликозилирование RebD успешно осуществляли также с использованием только у-ЦД в качестве донора глюкозных остатков в различных весовых соотношениях: 1:1; 1:2 и 1:3 (вес/вес).
Выделение и очистку индивидуальных производных осуществляли на 10-ти колонках с смолой Diaion НР-20 (100 мл смолы), соединенных между собой параллельно. Процесс осуществляли аналогично вышеописанному для РебА.
Результаты и их обсуждение
Соотношениеиконцентрация субстратов оказывает определенное влияние на трансглюкозилирование РебА.Длявыявлениянаилучшеговарианта,реакции осуществляли в течение 12 ч при 65°С с 24%-ым раствором РебА и у-ЦД или крахмала в различных соотношениях при рН 6.5 с использованием 9 ед/г РебА ЦГТазы. С увеличением количества у-ЦД или крахмал существенно увеличивается степень трансформации. Однако, при этом падает степень сладости получаемого продукта, если ее измерить до его тонкой очистки. Вероятно, с коммерческой точки зрения соотношение компонентов 1:1 (вес/ вес), приводящее к сладости продукта в пределах 120-130 в условиях газированных напитков и 170180 в кисломолочных и кондитерских продуктах является наиболее приемлемой. Варьируя соотношение можно получить необходимый тип сладости и в некоторых случаях решить проблему с наполнителями (рисунок 3).
100
d
« 90
80
Е-
С 70
à? 60
<
50
40
30
20
10
0
Рисунок 4. ВЭЖХ-грамма исходной реакционной смеси при 1:1 (а); 1:2 (Ь) и 1:3 (с) весовом соотношении РебА и у-ЦД через 48 часов реакции.
Таблица 1
Соотношение гликозилированных производных РебА с ЦГТазой с использованием у-ЦД в качестве донора глюкозных единиц
Количество производных, %
0.5/1.0 1.0/1.0 1.0/2.0 1.0/3.0 1.0/4.0 □ РебА/Крахмал ■ РебА/ЦД
Рисунок 3. Степень трансгликозилирования (А,%) в зависимости от соотношения РебА и доноров глюкозных единиц.
Продуктом реакции трансгликозилирования является смесь немодифицированного РебА и его моно- (РебА-G^, ди- (РебА^2), три- (РебА-GS) и более глюкозилированных производных (Prakash, DuBois, Miguel, & Clos, 2010) (рисунок 4).
Выявлено, что при повышенных концентрациях ЦД увеличивается степень трансгликозилирования и снижается количество нетрансформированного РебА.
В таблице 1 представлены результаты изучения трансгликозилирования РебА с помощью ЦГТазы, в качестве донора глюкозных единиц использовали гамма-циклодекстрин (у-ЦД).
Продукты РебА: у-ЦД (1:1,2/2) РебА: у-ЦД (1:2) (в/в) РебА: у-ЦД (1:3 (в/в)
48 часов 24 часа 48 часов 24 часа 48 часов
РебА 17.14 12.28 8.15 7.84 6.50
РебА-01 21.57 14.96 14.02 18.22 14.60
РебА-02 19.38 14.52 13.90 16.03 12.00
РебА-03 14.61 13.62 13.38 12.25 10.67
РебА-04 9.68 11.30 13.40 10.43 10.73
РебА-05 6.13 9.25 11.71 9.33 9.50
РебА-06 4.29 6.77 7.85 6.80 6.73
РебА-07 2.42 5.13 5.86 5.85 6.31
РебА-08 1.79 3.90 3.43 4.38 4.75
РебА-09 1.11 3.30 2.82 3.65 4.24
РебА-010 0.80 2.14 2.04 2.52 2.96
РебА-011 0.43 1.72 1.81 1.70 2.54
РебА-012 0.65 1.11 1.63 1.00 1.86
РебА-013 1.76
РебА-014 1.27
РебА-G15-G19 3.58
На рисунке 5 показано, что эффективность трансглюкозилирования повышается
пропорционально увеличению общей
концентрации субстратов.
С целью повышения количества моно-, ди- и три-глюкозилированных производных, полученный продукт обрабатывали р-амилазой, а-амилазой
80
70 60 50 40 30 20 10 0
15
20
25
30
35
В, %
А
5
0
Рисунок 5. Влияние общей концентрации субстратов (В, %) на степень трансгликозилирования (А, % от максимальной) при соотношении РебА к у-ЦД 1:1(в/в), 65°С через 24 часов реакции.
и ' и ' " ад" ' аз ' ' ' " д ' ' и ' 'ни- -к-я-в-ш-ав-я-в-я.
(а) (б)
Рисунок 6. ВЭЖХ-граммы трансглюкозилированного РебА в присутствии ЦД до (а) и после обработки р-амилазой (б).
Таблица 2 Таблица 3
Соотношение гликозилированных производных РебА Соотношение гликозилированных производных РебА до и после обработки Ь-0<8;07>9 до и после обработки глюкоамилазой
Количество производных, % Количество производных, %
Продукты РебА: у-ЦД (1:3) (в/в); 24 часа. До р-амилазы РебА: у-ЦД (1:3) (в/в); 24 часа. После в-амилазы Продукты РебА:крахмал (1:1) (в/в); 48 ч. До глюкоамилазы РебА:крахмал (1:1) (в/в); 48 ч. После глюкоамилазы
РебА 7.84 17.08 РебА 15.8 18.7
РебЛ^1 18.22 30.51 РебЛ^1 20.6 33.0
РебД^2 16.03 31.26 РебЛ^2 19.3 26.8
РебЛ^Э 12.25 15.53 РебЛ-G3 15.1 15.6
РебЛ^4 10.43 4.57 РебЛ^4 9.9 5.9
РебЛ^5 9.33 1.04 РебЛ-G5 6.8
РебЛ^б 6.80 РебЛ-G6 6.0
РебЛ^7 5.85 РебЛ-G7 2.7
РебЛ^8 4.38 РебЛ-G8 1.7
РебЛ^9 3.65 РебЛ^9 2.1
РебЛ-G10 2.52 РебЛ-G10
РебЛ-G11 РебЛ^12 1.70 1.00 РебЛ-G11 РебЛ-G12 Малые количества
или глюкоамилазой. |Это приводит к гидролизу длинных боковых цепочек производных до моно-и ди-глюкозилированных компонентов (рисунок 6).
Обработку р-амилазой может производится либо до очистки трансглюкозилированной смеси на крупнопористой адсорбционных смолах, либо после хроматографического удаления остаточных мальтоолигосахаридов и присутствующих в реакционной смеси других примесей.
Соотношение гликозилированных производных РебА до и после обработки р-амилазой, а также соотношение производных РебА до и после обработки глюкоамилазой приведены в Таблицах 2 и 3.
Выделение и очистка гликозилированных производных РебА проводилась по принципу разделения на адсорбционной смоле, основанном на разнице в сродствах к носителю раличных
Таблица 4
Соотношение гликозидов в различных секциях
производных. В первых колонках преобладающим является непрореагировавший РебА, количество которого постепенно снижается от колонки к колонке. В то же время, распределение производных имеет обратную зависимость. Причем, сродство производных к носителю уменьшается с молекулярной массой (Таблица 4).
Для выделения производных РебА, продукт, полученный из седьмой колонки, пропускали через систему из 10-ти колонок и процесс осуществляли аналогично вышеописанному. Как результат, получены продукты с 80%-ным содержанием моно- и ди-гликозилированных производных (Таблица 5).
Трансглюкозилирование РебD и РебМ ЦГТазой
Высокоочищенный РебD представляет собой белый порошок без запаха с молекулярной массой в 1129.15 и молекулярной формулой С50Н80 0 28. В 180200 раз слаще сахара по сравнению с 10% раствором
Гликозид Количество гликозидов в разных колонках, %
Исходный #-1 #-2 #-3 #-4 #-5 #-6 #-7
РебА 25.1 33.0 31.9 28.4 21.5 11.0 - 0
РебА-Gl 40.5 35.7 40.0 41.3 42.8 41.7 29.4 0
Pe6A-G2 26.6 27.2 24.1 25.5 28.7 35.7 48.1 51.3
Pe6A-G3 7.8 4.1 4.0 4.8 6.9 11.6 22.5 48.7
Таблица 5 Разделение моно и ди-гликозилированных РебА на колонке с Diaion HP-20
Количество гликозидов в разных колонках, %
#-1 #-2 #-3 #-4 #-5 #-6 #-7
РебА-Gl 65.7 69.3 73.6 80.3 56.0 30.1 20.2
Pe6A-G2 34.3 30.7 26.4 19.7 44.0 69.9 79.8
Таблица 6
Соотношение РебD и производных в различных колонках
Количество гликозидов в разных колонках, %
Гликозид Исходный #-1 #-2 #-3 #-4 #-5
Pe6D 22.6 36.1 31.2 10.2 1.5 1.0
Pe6D-G1 32.1 28.9 26.5 25.3 10.2 8.1
Pe6D-G2 24.9 21.8 21.6 29.3 20.0 17.8
Pe6D-G3 12.4 9.8 17.0 22.4 29.6 14.1
Pe6D-G4 4.2 3.4 3.7 4.1 15.4 14.7
Pe6D-G5 2.1 8.7 11.7 25.1
Pe6D-G6 1.3 7.0 11.9
Pe6D-G7 1.1 4.6 7.3
5_10_15_20_И_М_К_40_45 тп
Исходная реакционная смесь
_5_я_и_зе_а_я_»_«_
Фракция содержащая минимальное количество непрореагировавшего РебD
Т—.---I---(—■-■—----1------ . 1 ----- . |
1_19_1!_в_
Продукт после обработки р-амилазой
Рисунок 6. ВЭЖХ-граммы накопления РебD и его производных в различных колонках с Diaion НР-20.
Таблица 7
Соотношение гликозидов после трансгликозилирования РебD в присутствии различных количеств у-ЦД
Гликозиды Количество гликозидов, %
РебD/ у-ЦД=1:1 (2/2) РебD/ у-ЦД=1:2 (2/2) РебD/ у-ЦД=1:3 (2/2)
РебD 36.8 28.4 23.8
РебD- 31.2 27.6 24.1
РебD- 16.7 15.8 16.4
РебD- 9.5 11.8 12.7
РебD- 5.8 12.7 17.2
РебD- ^5 3.7 5.8
ХИПС №1 - 2019 -
93
Рисунок 7. ВЭЖХ-грамма трансгликозилированного РебМ ЦГТазой и в присутствии у-ЦД.
сахарозы, растворимость в воде около 0.2%, которая увеличивается при нагревании. Растворим в разбавленных растворах метанола, этанола, 1-пропанола и изопропанола. Не растворим в ацетоне, хлороформе, бензоле и эфирах. РебD стабилен при различных pH и нагревании (Abelyan & Abelyan, 2012). Он может служить в качестве натурального высокоинтенсивного подсластителя в продуктах питания, напитках, фармацевтических композициях, косметике, жевательные резинки, зубных пастах и т.д (Chaturvedula & Prakash, 2011; Kitahata, 2001).
Аналогично с РебА, в первых колонках преобладающим является непрореагировавший РебD, количество которого постепенно снижается от колонки к колонке. В то же время, распределение производных имеет обратную зависимость. Причем, сродство производных к носителю уменьшается с молекулярной массой. В колонках 6-10 гликозидов не обнаружили (Таблица 6, Рисунок 6) (Abelyan & Abelyan, 2012).
Для обогащения его моно- и ди-гликозилированными производными, смесь обрабатывали глюкоамилазой, и повторно очищали колонках с Diaion HP-20. |Элюаты из колонок дополнительного гидролиза глюкоамилазой и очистки на крупнопористом адсорбенте содержали более 70% РебD-G1 и РебD-G2, соответственно.
Трансгликозилирование РебD успешно осуществляли также с использованием только у-ЦД в качестве донора глюкозных остатков в различных весовых соотношениях: 1:1; 1:2 и 1:3 (вес/вес) (Purkayashta, Martin, Petit, & Chkhan, 2017; Purkayashta, Martin, Petit, & Chkhan, 2018) (Таблица 7).
Аналогичным с РебD способом реализовывали
трансгликозилирование РебМ (Chaturvedula & Prakash, 2011; Prakash, Markosyan, & Bunders, 2014) с помощью ЦГТазы B.stearothermophilus и с использованием у-ЦД. Через 48 часов реакции реакционная смесь содержал РебМ, РебМ-Gl, РебМ^2 и РебМ-GS в соотношении 3.8/2.9/1.6/1.0 (Рисунок 7).
ЦГТаза термофильного штамма Bacillus stearothermophilus St-88 является эффективным биокатализатором для гликозилирования различных гликозидов стевии. Показана возможность трансликозилирования РебD и РебМ и очищены их различные фракции, улучшены их вкусовые характеристики, позволяющие использовать их в качестве высокоинтенсивных подсластителей и модификаторов вкуса. Ферментативное трансгликозилирование
эффективно для структурной модификации биологически активных соединений. При этом, в результате модификации можно изменять структуру, характеристики и биологическую доступность, можно создавать новые функции, и открыть новые области и возможности их применения.
Литература
Абелян, В.А. Циклодекстрины: получение и применение // Ереван: Изд. "Ван Арьян". - 2001. - 519 с.
Кочикян В.Т., А.А.Маркосян, Л.А.Абелян, А.М.Балаян, В.А.Абелян. (2006) Совместная ферментативная модификация стевиозида и ребаудиозида А. Прикл. Биохим и Микробиол. 42(1). 31-37.
Abelyan V.H., Abelyan L.A. (2012) The Art of Stevia. PureCircle. Kuala Lumpur. 876 стр.
Abelyan V.H., Ghochikyan V.T., Markosyan A.A., Adamyan M.O., Abelyan L.A. (2010) Extraction, separation and modification of sweet glycosides from the stevia rebaudiana plant. US Pat 7,838,044.
Akimaru e K, Yagi T, Yamamoto S. Purification and properties of Bacillus coagulans cyclomaltodextrin glucanotransferase. J Ferment Bioeng. 1991; 71:322-328.
Bakal A. and O'Brien Nabors, L. (1986) Stevioside. In: Alternative Sweeteners, L. O'Brien Nabors and R.C. Gelardi (Eds), Marcel Dekker, New York, pp. 295307
Chaturvedula V.S.P. and Prakash I. (2011c) Journal of Carbohydrate Chemistry. 30.16-26.
Chaturvedula, V.S.P., Prakash, I. // Carbohydrate Research. - 2011b. - V. 346. - P. 1057-1060.
Dobberstein, R.H., Ahmed, M.S. Extraction, separation and recovery of diterpene glycosides from Stevia rebaudiana plants // US Patent 4,361,697. - 1982.
Esaki, S., Tanaka, R., Kamiya, S. Synthesis and taste of certain steviol glycosides // Agric. Biol. Chem. -1984. - V. 48. - №7. - P. 1831- 1834.
Kinghorn, A.D., Soejarto, D.D. Current status of stevioside as a sweetening agent for human use. In: Economic and medicinal plant research. Wagner, H., Hikino, H., Farnsworth, N.R. (eds). Academic Press: London. - 1985. - V. 1. - P. 1-52.
Kitahata, S. Current industrial production and application of saccharides in Japan. Kasai Research Institute. - 2001. - 202 p.
Kohda, H., Kasai, R., Yamasaki, K., Murakami, K., Tanaka, O. New sweet diterpene glucoside from Stevia rebaudiana // Phytochemistry. - 1976a. - V. 15. - P. 981-983.
Lipinski, G.W.R., Hanger, L.Y. Acesulfame K. In: Alternative sweeteners. O'Brien Nabors, Lyn (ed.), Marcel Dekker: N.-Y. - 2001. - P. 13-31.
Morita, T., Fujita, I., Matsuura, F., Ota, M. New steviol glycoside // W02010/038911. - 2010.
Morita, T., Morita, K., Kanzaki, S. Novel stevia variety and method of producing sweetener // US Patent Appl. 201110023192. - 2011.
Ohtani, K., Yamasaki, K. Methods to improve the taste of the sweet principles of Stevia rebaudiana. In: Stevia: the genus Stevia, Kinghorn, A.D. (ed.), London: Taylor and Francis. - 2002. - P. 138--159.
Prakash I., Markosyan A., Bunders C. (2014b) Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M. Foods. 3. 162-175.
Prakash, I., DuBois, G.E., Clos, J.F., Wilkens, K.L., Fosdick, L.E. Development of rebiana, a natural, non-caloric sweetener // Food and Chemical Toxicology. - 2008. - V. 46. - P. 75-82.
Prakash, I., DuBois, G.E., Miguel, R.I.S., Clos, J. Rebaudioside A derivative products and methods for making // US Patent Appl. 2010/0278993. - 2010.
Purkayashta, S., Martin, J., Petit, M., Chkhan, K. Steviol glycoside compositions // US Patent US 2018/0317534 A1. - 2018.
Purkayashta, S., Martin, J., Petit, M., Chkhan, K. Steviol glycoside compositions // US Patent, WO 2017/075034. - 2017.
Soejarto, D.D., Compadre, C.M., Medon, P.J., Kamath, S.K., Kinghorn, A.D. Potential sweetening agents of plant origin. II. Field search for sweet-tasting stevia species // Economic Botany. - 1983. - V. 37. - P. 7179.
Yamamoto, K., Yoshikawa, K., Okada, S. Effective production of glycosyl-steviosides by a-1,6-transglucosylation of dextrin dextranase // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1994. - V. 58. - №9. - P. 1657-1661.
Yamamoto, T. (ed.). Handbook of amylases and related enzymes. Pergamon Press: Tokyo. - 1988.
Effects of Enzymatic Transglycosylation of Steviol Glycosides on Their Taste Profile
Kristina V. Chkhan
Moscow State University of Food Production 11 Volokolamskoe highway, Moscow, 125080, Russian Federation Scientific- Research laboratory of PureCircle. Limited Kuala Lumpur, 50250 Malaysia E-mail: ch.kristina84@gmaiLcom
Marina B. Moiseyak
Moscow State University of Food Production 11 Volokolamskoe highway, Moscow, 125080, Russian Federation
E-mail: marina-mgupp@mail.ru
Enzymatic transglycosylation is an effective method for structural modification of biologically active compounds, including high-intensity sweeteners. Enzymatic transglycosylation of Steviol glycosides from Stevia rebaudiana was studied. Bacillus stearothermophilus St-88 was used as producer for cyclomaltodextrin glucanotransferase (CGTase). CGTase can be an effective biocatalyst in the transglucosylation reaction of Rebaudioside A, Rebaudioside D, Rebaudioside M in the presense of cyclodextrins or/and starch as donors. The possibility of obtaining steviol glycosides with different length of side chains was demonstrated. Isolation and purification of individual derivatives (RebD-G1 / G2, RebM-G1 / G2, RebA-G1 / G2) was performed on 10 chromatographic columns connected to each other, Diaion HP-20 resin was used. It is shown that transglycosylated steviol glycosides are excellent high intensity sweeteners that can act as taste modulators for unmodified steviol glycosides.
Keywords: high-intensity sweeteners, cyclomaltodextrin glucanotransferase, Rebaudioside D, Rebaudioside M, Rebaudioside A, steviol glycosides of Stevia, enzymatic modification, modulation of taste profile
Reference
Abelyan V.A. Cyclodextrins: production and use. // Erevan:Van.Aryan. 2001. p. 519
Abelyan V.H., Abelyan L.A. (2012) The Art of Stevia. PureCircle. Kuala Lumpur. 876 стр.
Abelyan V.H., Ghochikyan V.T., Markosyan A.A., Adamyan M.O., Abelyan L.A. (2010) Extraction, separation and modification of sweet glycosides from the stevia rebaudiana plant. US Pat 7,838,044.
Akimaru e K, Yagi T, Yamamoto S. Purification and properties of Bacillus coagulans cyclomaltodextrin glucanotransferase. J Ferment Bioeng. 1991; 71:322-328.
Bakal A. and O'Brien Nabors, L. (1986) Stevioside. In: Alternative Sweeteners, L. O'Brien Nabors and R.C. Gelardi (Eds), Marcel Dekker, New York, pp. 295307
Chaturvedula V.S.P. and Prakash I. (2011c) Journal of Carbohydrate Chemistry. 30.16-26.
Chaturvedula, V.S.P., Prakash, I. // Carbohydrate Research. - 2011b. - V. 346. - P. 1057-1060.
Dobberstein, R.H., Ahmed, M.S. Extraction, separation
and recovery of diterpene glycosides from Stevia rebaudiana plants // US Patent 4,361,697. - 1982.
Esaki, S., Tanaka, R., Kamiya, S. Synthesis and taste of certain steviol glycosides // Agric. Biol. Chem. -1984. - V. 48. - №7. - P. 1831- 1834.
Kinghorn, A.D., Soejarto, D.D. Current status of stevioside as a sweetening agent for human use. In: Economic and medicinal plant research. Wagner, H., Hikino, H., Farnsworth, N.R. (eds). Academic Press: London. - 1985. - V. 1. - P. 1-52.
Kitahata, S. Current industrial production and application of saccharides in Japan. Kasai Research Institute. - 2001. - 202 p.
Kochikyan, V. T., Markosyan, A. A., Abelyan, L. A., Balayan, A. M., & Abelyan, V. A. (2006). Combined enzymatic modification of stevioside and rebaudioside A. Applied Biochemistry and Microbiology. https://doi.org/10.1134/ s0003683806010030.
Kohda, H., Kasai, R., Yamasaki, K., Murakami, K., Tanaka, O. New sweet diterpene glucoside from Stevia rebaudiana // Phytochemistry. - 1976a. - V. 15. - P. 981-983.
Lipinski, G.W.R., Hanger, L.Y. Acesulfame K. In: Alternative sweeteners. O'Brien Nabors, Lyn (ed.), Marcel Dekker: N.-Y. - 2001. - P. 13-31.
Morita, T., Fujita, I., Matsuura, F., Ota, M. New steviol glycoside // W02010/038911. - 2010.
Morita, T., Morita, K., Kanzaki, S. Novel stevia variety and method of producing sweetener // US Patent Appl. 201110023192. - 2011.
Ohtani, K., Yamasaki, K. Methods to improve the taste of the sweet principles of Stevia rebaudiana. In: Stevia: the genus Stevia, Kinghorn, A.D. (ed.), London: Taylor and Francis. - 2002. - P. 138--159.
Prakash I., Markosyan A., Bunders C. (2014b) Development of Next Generation Stevia Sweetener: Rebaudioside M. Foods. 3. 162-175.
Prakash, I., DuBois, G.E., Clos, J.F., Wilkens, K.L., Fosdick, L.E. Development of rebiana, a natural, non-caloric sweetener // Food and Chemical Toxicology. - 2008. - V. 46. - P. 75-82.
Prakash, I., DuBois, G.E., Miguel, R.I.S., Clos, J.
Rebaudioside A derivative products and methods for making // US Patent Appl. 2010/0278993. - 2010.
Purkayashta, S., Martin, J., Petit, M., Chkhan, K. Steviol glycoside compositions // US Patent US 2018/0317534 A1. - 2018.
Purkayashta, S., Martin, J., Petit, M., Chkhan, K. Steviol glycoside compositions // US Patent, WO 2017/075034. - 2017.
Soejarto, D.D., Compadre, C.M., Medon, P.J., Kamath, S.K., Kinghorn, A.D. Potential sweetening agents of plant origin. II. Field search for sweet-tasting stevia species // Economic Botany. - 1983. - V. 37. - P. 7179.
Yamamoto, K., Yoshikawa, K., Okada, S. Effective production of glycosyl-steviosides by a-1,6-transglucosylation of dextrin dextranase // Biosci. Biotechnol. Biochem. - 1994. - V. 58. - №9. - P. 1657-1661.
Yamamoto, T. (ed.). Handbook of amylases and related enzymes. Pergamon Press: Tokyo. - 1988..
