CC BY
48
2015
ВЕСТНИК САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКОГО УНИВЕРСИТЕТА
Сер. 11
Вып. 1
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ МЕДИЦИНА
УДК 615.322: 616-005.6
С. М. Гуляев, С. М. Николаев, Е. 3. Урбанова
ВЛИЯНИЕ ЭКСТРАКТА PHLOJODICARPUS SIBIRICUS НА АГРЕГАЦИЮ ТРОМБОЦИТОВ, ДЛИТЕЛЬНОСТЬ КРОВОТЕЧЕНИЯ И АРТЕРИАЛЬНЫЙ ТРОМБОЗ
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, Российская Федерация, г. Улан-Удэ, 670047, ул. Сахьяновой, 6
Большинство кардиоваскулярных заболеваний сопровождается дисфункцией эндотелия, активацией тромбоцитов и тромбозом. В фитотерапии Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) Koso-Pol. используется как вазорелаксирующее, коронарорасширяющее средство. В настоящей работе проведена оценка влияния экстракта Phlojodicarpus sibiricus (PS) на агрегацию тромбоцитов, длительность кровотечения и FeCl3 -индуцируемый тромбоз in vitro и in vivo. Агрегацию тромбоцитов определяли в тесте in vitro после пре-инкубации тромбоцитов с PS. Длительность кровотечения и FeC^-индуцированный тромбоз в сонной артерии определяли in vivo после курсового внутрижелудочного введения крысам PS. Установлено, что PS (50-200 мкг/мл) в обратной дозовой зависимости в тесте in vitro ингибировал агрегацию тромбоцитов (р < 0,001). Введение крысам PS (50-100 мг/кг) значительно увеличивало время кровотечения (р < 0,05), препятствовало тромбообразованию: масса тромба была меньше контроля (р < 0,05). Указанные эффекты PS обусловлены ингибированием агрегации тромбоцитов. Антитромботический эффект экстракта обеспечивается антиагрегантным, антиоксидантным действием кумаринов, наличествующих в данном растении. Phlojodicarpus sibiricus может оказывать ингибирующее влияние на «гиперактивацию» тромбоцитов, образование тромба в сочетании с вазоактивным действием. Данное растение является перспективным объектом для разработки новых стратегий профилактики тромбоза при сосудистых заболеваниях. Библиогр. 12 назв. Табл. 3.
Ключевые слова: экстракт Phlojodicarpus sibiricus, агрегация тромбоцитов, время кровотечения, FeC^-индуцированный тромбоз, антитромботический эффект.
INFLUENCE OF PHLOJODICARPUS SIBIRICUS EXTRACT ON PLATELET AGGREGATION, BLEEDING TIME AND ARTERIAL THROMBOSIS
S. M. Gulyaev, S. M. Nikolaev, E. Z. Urbanova
Institute of General and Experimental Biology SB RAS, 6, Sackhyanovoi, 670047, Ulan-Ude, Russian Federation
Many cardiovascular diseases are associated with an endothelium dysfunction, increase in blood platelet activity, thrombosis. In phytotherapy Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) Koso-Pol. is used as vasodilator and cardiovascular remedy. This work explores the influence of Phlojodicarpus sibiricus extract (PS) on platelet aggregation, bleeding time, FeCl3-induced thrombosis in vitro and in vivo. The in vitro aggregation was monitored after pre-incubation of platelets with PS. The in vivo bleeding time and FeCl3-induced carotid artery thrombosis model were measured after oral PS course treatment. The PS (50-200ug/ml) inhibited dose dependent platelet aggregation (p < 0,001) was established. The administration of PS (50-100 mg/kg) significantly prolonged bleeding time (p < 0,05), obstructed thrombus formation, decreased thrombus weight (p < 0,05). These effects of PS may be attributed to the observed inhibition of platelet aggregation. This antithrombotic effect related in anti-platelet and antioxidant ac-
tion of coumarins is present in the herb. These results support the hypothesis that the Phlojodicarpus sibiricus may benefit in the inhibition of platelet hiperactivation, in the prevention of thrombotic disturbances with accompany vessel active action. This herb is potentially interesting in the development of new prevention strategies for thrombosis with various vascular diseases. Refs 12. Tables 3.
Keywords: Phlojodicarpus sibiricus extract, platelet aggregation, bleeding time, FeCl3-induced thrombosis, and antithrombotic effect.
Большинство кардиоваскулярных заболеваний сопровождается дисфункцией эндотелия, активацией тромбоцитов, тромбообразованием. Антиагрегантные средства значительно уменьшают риск развития сосудистых тромботических осложнений. Однако нередко отмечаются случаи резистентности и развития побочных реакций при их длительном применении [1-4].
Актуальной задачей в профилактической и клинической медицине является поиск новых средств, гармонично сочетающих вазопротективную и антитромботи-ческую активность. Целесообразным считается применение растительных средств, обладающих, как правило, комплексным, мягким лечебным действием без побочных реакций [5, 6]. Интересным в этой связи представляется определение «анти-тромбоцитарной», антитромботической активности Phlojodicarpus sibiricus (Steph. ex Spreng.) Koso-Pol., семейство Umbelliferae — растения с известным вазорелаксирую-щим, коронарорасширяющим свойством [7]. Указанные фармакологические свойства обеспечиваются наличием в его корнях кумаринов, в частности пиранокумари-нов — виснадина и дигидросамидина.
Целью настоящего исследования явилось определение влияния экстракта Phlojodicarpus sibiricus на агрегацию тромбоцитов, длительность кровотечения и FeCl3-индуцированный тромбоз сонной артерии.
Материалы и методы исследования. Сухой экстракт из корней Phlojodicarpus sibiricus (PS) получали путем экстрагирования спирто-водным раствором (60%) и высушивания в вакуум-сушильном шкафу.
В эксперименте использовали крыс-самцов линии Wistar 180-220 г, содержащихся в стандартных условиях вивария со свободным доступом к воде и пище. Влияние PS на агрегацию тромбоцитов определяли in vitro с помощью «Агрескрин-теста» (фирма «Технология-стандарт»). Кровь из бедренной вены у наркотизированных крыс (тиопентал натрия 45 мг/кг) забирали в силиконовые пробирки с 3,8% цитратом натрия — 9:1. Приготовление богатой тромбоцитами плазмы и проведение теста проводили по стандартной методике [8]. Для оценки влияния PS на длительность кровотечения животных распределяли на группы: 1 — контроль (дист. вода); 2, 3 группы составили животные, получавшие PS в течение 7 дней в дозах 50, 100 мг/кг однократно, внутрижелудочно; 4 группу (позитивный контроль) составили крысы, получавшие аспирин (30 мг/кг) по аналогичной схеме. Крыс, наркотизированных тиопенталом натрия — 45 мг/кг, помещали на согреваемую поверхность, «термоста-тировали» животных (t = 37°С) в течение 5 мин. Затем вызывали кровотечение путем ампутации бритвенным лезвием части хвоста на расстоянии 5 мм от его кончика [9]. Через каждые 30 сек поверхность раны промокали фильтровальной бумагой. Время от момента ампутации до исчезновения следов крови на фильтровальной бумаге отмечали как длительность кровотечения. Для оценки антитромботической активности PS использовали модель тромбоза, индуцируемого аппликацией FeCl3 на адвентицию артерии [10]. Первую группу составили ложнооперированные живот-
ные, 2 — контрольные животные (тромбоз), 3 и 4 группы — крысы, получавшие Р8 в дозах 50, 100 мг/кг внутрижелудочно однократно в течение 7 дней и за 1ч до эксперимента (Р8 + тромбоз). Крысам контрольной группы вводили воду, очищенную по аналогичной схеме. Животным под наркозом (тиопентал натрия, 45 мг/кг, в/б) делали срединный разрез на передней поверхности шеи, выделяли левую и правую общие сонные артерии. Фильтровальную бумагу (размером 0,5x0,5 мм), смоченную 10% раствором БеС13, помещали на поверхность общей сонной артерии. После инкубации в течение 3 мин бумагу удаляли, а сонную артерию обильно промывали физ. раствором. Через 10 мин животных умерщвляли летальной дозой эфира. Апплици-рованный отрезок сонной артерии аккуратно иссекали и определяли массу тромба.
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием ^критерия Стьюдента.
Результаты исследования. Добавление Р8 в дозах 50, 100 и 200 мкг/мл к суспензии тромбоцитов снижало их агрегацию в 4,6-3,1 и 2,4 раза соответственно (табл. 1). Введение Р8 в дозах 50 и 100 мг/кг увеличивало время кровотечения в 2 раза, при этом показатели были сопоставимы с показателями животных, получавших аспирин (позитивный контроль) (табл. 2). Курсовое введение Р8 животным ингибирова-ло тромбообразование в общей сонной артерии, индуцируемое аппликацией БеС13: масса тромба у животных, получавших Р8 в дозах 50 и 100 мг/кг, была меньше контроля соответственно на 56,5и51% (табл. 3).
Таблица 1. Влияние Р8 на агрегацию тромбоцитов т уИто
Условия опыта Время агрегации тромбоцитов (с)
Контроль 1, богатая тромбоцитами плазма + УИА 15,0±1,0
Р8 (мкг/мл) + богатая тромбоцитами плазма + УИА: 25 50 100 200 13,5±0,5 61,7±7,9 ** 46,7±3,8 ** 35,7±5,8 *
Контроль 2, бедная тромбоцитами плазма + УИА 80,5±1,5 **
Примечание: * — различия значимы по сравнению с контролем 1 прир < 0,01; ** — прир< 0,001.
Таблица 2. Влияние PS на длительность кровотечения (в мин) in vivo
Контроль (n = 5) PS (n = 5), 50 мг/кг PS (n = 5), 100 мг/кг Аспирин (n = 5), 30 мг/кг
5,1±0,5 11,1±0,9* 11,1±0,7* 15,6±1,6*
Примечание: * — различия значимы по сравнению с контролем, прир < 0,05.
Таблица 3. Влияние Р8 на тромбообразование, вызванное аппликацией на левую общую сонную артерию 10% раствора БеС! 3
Группа животных Масса тромба, мг
Ложнооперированные (п = 6) -
Контроль (п = 6) 0,76±0,06
Р8 50 мг/кг (п = 6) 0,33±0,03*
Р8 100 мг/кг (п = 6) 0,37±0,08*
Примечание: * — различия значимы по сравнению с контролем прир < 0,05.
Обсуждение результатов. Данные проведенных исследований свидетельствуют о выраженном влиянии PS на тромбоцитарное звено гемостаза: PS ингибирует агрегацию тромбоцитов, увеличивает время кровотечения. Увеличение времени кровотечения обусловлено ингибированием агрегации тромбоцитов. Известно, что кумарины, содержащиеся в растениях семейства Umbelliferae, обладают преимущественно коронарорасширяющим, спазмолитическим и антиагрегантным свойствами [11]. Считается, что в механизме их действия лежит способность ингибировать цАМФ-фосфодиэстеразу. При ингибировании указанного фермента увеличивается содержание цАМФ и секвестрация ионов Са2+ в тромбоцитах и миоцитах сосудов, что вызывает снижение активации тромбоцитов и вазорелаксацию. Модель FeCl3-индуцированного тромбоза основана на индукции ионами Fe3+ свободнорадикаль-ных процессов и повреждении эндотелия, что приводит к агрегации тромбоцитов, тромбообразованию. Показано, что многие кумариновые соединения обладают антирадикальными свойствами [12]. Антитромботический эффект PS при FeCl3-индуцированном тромбозе артерии обеспечивается антирадикальным, «антитром-боцитарным» действием кумаринов, наличествующих в экстракте. Известно, что препарат «Фловерин», разработанный на основе кумариновых соединений, выделенных из корней Phlojodicarpus sibiricus, используется как спазмолитическое средство при стенокардии, эндартериите [7]. Результаты проведенных исследований аргументируют целесообразность более широкого применения средств из указанного растения.
Таким образом, Phlojodicarpus sibiricus проявляет антитромботический, вазо-протективный эффекты благодаря антиагрегантной и антирадикальной активности. Учитывая потенциальную возможность системного гематовазального действия данного растения, можно рассматривать его как перспективный объект для разработки новых стратегий профилактики сосудистых заболеваний и тромботических осложнений.
Литература
1. Воробьева Н. М. Резистентность к ацетилсалициловой кислоте: значение лекарственной формы // Лечащий врач. 2013. № 7. С. 53.
2. Hurst N. L., Nooney V. B., Raman B. et al. Clopidogrel "resistance": Pre-vs post-receptor determinants // Vascular. Pharmacology. 2013. N 59. P. 152-161.
3. Skurnik Y. D. et al. Ticlopidine-induced cholestatic hepatitis // Ann. Pharmacother. 2003. Vol. 37. P. 371-375.
4. Maseneni S., Donzelli M., Taegtmeyer A. B. et al. Toxicity of clopidogrel and ticlopidine on human myeloid progenitor cells: Importance of metabolites // Toxicology. 2012. Vol. 299. P. 139-145.
5. Барнаулов О. Д. Введение в фитотерапию. 1999. 160 с.
6. Гуляев С. М., Санданов Т. М. Влияние настойки вздутоплодника сибирского на когнитивные функции и нейропсихологический статус у больных с недостаточностью мозгового кровообращения // Вестн. С.-Петерб. ун-та. Сер. 11: Медицина. 2008. Вып. 3. С. 44-49.
7. Соколов М. Я., Замотаев М. В. Справочник по лекарственным растениям (Фитотерапия). М., 1988. 464 с.
8. Баркаган З. С., Момот А. П. Диагностика и контролируемая терапия нарушений гемостаза. М.: «Ньюдиамед-АО», 2008. 292 с.
9. Wang, Y Y., Tang, Z. Y., Dong M. et al. Inhibitionof platelet aggre-gation by polyaspartoyll-arginine and its mechanism // Acta Pharmacologica Sinica. 2004. N 25. Р. 469-473.
10. Surin W. R., Prakash P., Barthwal M. K., Dikshit M. Optimization of ferric chloride induced thrombosis model in rats: Effect of anti-platelet and anti-coagulant drugs // Journal of Pharmacological and Toxico-logical Methods. 2010. № 61. Р. 287-291.
11. Thastrup O., Knudsen J. B., Lemmich J., Winter K. Ingibition of human platelet aggregation by dihy-dropyrano- and dihydrofuranocoumarins, a new class of c-AMP-phosphodiesterase ingibitors // Biochemical. pharmacology. 1985. Vol. 34, N 12. P. 2137-2140.
12. Paya M., Halliwell B., Hoult J. R. Interactions of a series of coumarins with reactive oxygen species. Scavenging of superoxide, hypochlorous acid, and hydroxyl radicals // Biochem. Pharmacol. 1992. N 44. P. 205-214.
Статья поступила в редакцию 25 декабря 2014 г.
Контактная информация
Гуляев Сергей Миронович — кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник; [email protected]
Николаев Сергей Матвеевич — доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник
Урбанова Екатерина Зориктуевна — аспирант
Gulyaev Sergey M. — Candidate of Medicine, senior researcher; [email protected] Nikolaev Sergey M. — Doctor of Medicine, Professor, head of the department Urbanova Ekaterina Z. — post graduate student
